多肽類核酸載體、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸載體，具體涉及多肽類核酸載體。本發(fā)明還涉及含有所述核酸載 體和核酸分子的復(fù)合體，以及所述核酸載體和核酸載體/核酸分子復(fù)合體的制備方法及用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 美國食品藥品管理局（FDA)定義基因治療是通過轉(zhuǎn)錄或翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)和/或整合到 宿主基因組中外源基因進(jìn)彳丁治療疾病的一種治療方法?；蛑委熓侵委煱┌Y、單基因疾病、 心血管疾病和神經(jīng)性疾病等的潛在的最有效的治療方法。自1990年，基因治療第一次進(jìn)入 臨床試驗(yàn)開始，全球已經(jīng)有超過1800例基因治療臨床試驗(yàn)開展。我國更是在2004年，成為 第一個在市場上引進(jìn)基因藥物（Gendicine)的國家。由于用于基因治療的核酸藥物分子具 有分子量大、富含大量負(fù)電荷以及極易降解等特點(diǎn)，目前基因治療面臨的最大難題是缺乏 理想的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，因此尋找高效、安全的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體成為研究的重點(diǎn)。
[0003]目前開展的臨床試驗(yàn)大多采用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因藥物的載體，但病毒 載體的缺點(diǎn)在于轉(zhuǎn)運(yùn)能力低、使用成本高昂和潛在的安全性等。在1994年，因?yàn)樵谂R床試 驗(yàn)中使用病毒基因載體造成病人死亡，致使基因治療研究一度陷入停滯。因此，近些年非病 毒類載體研究發(fā)展迅速，包括脂質(zhì)體、陽離子聚合物和多肽等。非病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)基因藥物多 數(shù)通過自身的陽離子與基因藥物的陰離子之間的離子相互作用負(fù)載DNA或RNA，形成較小 尺度的納米顆粒，轉(zhuǎn)運(yùn)DNA或RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)而整合到宿主基因中進(jìn)行表達(dá)。多肽以 其較好的生物相容性、功能多樣性和易于合成等特點(diǎn)成為基因治療載體的較好選擇。
[0004] 細(xì)胞透膜肽（Cell-PenetratingPeptides,CPPs)是一類能夠高效介導(dǎo)核酸、蛋白 等生物大分子透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的一類短肽，一般肽序列長度不超過30個氨基酸，大部 分透膜肽富含賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸。其中，TAT(49-57)(HIVtatprotein)是細(xì) 胞透膜蛋白肽片段中可完全行使細(xì)胞透膜功能且無細(xì)胞毒性的最小片段，TAT(49-57)肽序 列為Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RKKRRQRRR)。該段透膜肽可以通過在生理條 件下堿性氨基酸的正電荷與核酸的負(fù)電荷結(jié)合，負(fù)載核酸進(jìn)而通過內(nèi)吞作用介導(dǎo)核酸進(jìn)入 細(xì)胞，并且TAT肽片段有一定的細(xì)胞核靶向能力。然而，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的TAT/DNA 或RNA復(fù)合體首先進(jìn)入內(nèi)涵體（endosome，一種內(nèi)部呈酸性環(huán)境的脂膜結(jié)構(gòu)），最終運(yùn)送至 溶酶體降解。富含精氨酸的透膜肽肽序列Rn(η= 6-10)也具有和TAT相似的特性。由于 ΤΑΤ和Rn缺乏逃逸內(nèi)涵體的能力，因此很難單獨(dú)作為遞送DNA的載體達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效率。
[0005] 實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸的方法主要有兩種，一種是利用酸性環(huán)境（pH〈6. 0)下具有離子 緩沖作用的材料，通過質(zhì)子泵作用破壞內(nèi)涵體，使DNA或RNA復(fù)合體逃逸；另一種是利用帶 有α-螺旋雙親性結(jié)構(gòu)的多肽與脂膜作用，形成空洞，釋放出來DNA或RNA復(fù)合體。具有 α-螺旋雙親性結(jié)構(gòu)的抗菌肽（AMPs)是一類可以有效促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸的功能多肽。該類多 肽在水性環(huán)境中呈無規(guī)則狀態(tài)，但在疏水性環(huán)境中會形成ct-螺旋的雙親性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而起 到破壞內(nèi)涵體脂質(zhì)囊泡的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對基因轉(zhuǎn)運(yùn)過程中需要解決的關(guān)鍵問題，設(shè)計合成了一類具有較高轉(zhuǎn)染 效率并且能夠較好實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸的多肽類核酸載體，由此完成了本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明第一方面涉及核酸載體，所述載體含有細(xì)胞透膜肽和具有α-螺旋雙親性 結(jié)構(gòu)的抗菌肽（AMPs)。
[0008] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述抗菌肽位于細(xì)胞透膜肽的N端方向。
[0009] 在本發(fā)明中，所述具有α-螺旋雙親性結(jié)構(gòu)的抗菌肽是指該類抗菌肽在水溶液中 呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲的構(gòu)象，而在疏水性環(huán)境中呈現(xiàn)ct-螺旋結(jié)構(gòu)，親水性的堿性氨基酸和疏 水性氨基酸分別排列與螺旋的兩側(cè)，呈現(xiàn)特有的雙親性二級結(jié)構(gòu)。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體，其在所述抗菌肽的N端方向還連接有疏 水性分子。
[0011] 在本發(fā)明中，所述抗菌肽的N端方向連接有疏水性分子是指所述疏水性分子與抗 菌肽直接連接或通過其它氨基酸或小肽片段連接于抗菌肽的N端。
[0012] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過在抗菌肽N端連接疏水性分子，誘導(dǎo)AMP形成 α-螺旋雙親性結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)有利于帶正電荷的親水性氨基酸與負(fù)電荷的核酸藥物充分 接觸，進(jìn)而形成穩(wěn)定致密的納米復(fù)合物，有利于細(xì)胞的攝取，使得抗菌肽可以通過疏水相互 作用提高聚集體的局部濃度，進(jìn)而提高局部電荷密度，提高DNA或RNA的負(fù)載能力、提高核 酸載體/DNA或RNA復(fù)合體的穩(wěn)定性，同時，通過其疏水性烷基鏈與細(xì)胞膜的融合作用，進(jìn)而 有效提高透膜效率和破壞內(nèi)涵體的能力。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體，在所述細(xì)胞透膜肽和抗菌肽之間、和/ 或抗菌肽和疏水性分子之間還連接有1個氨基酸或者2-10個氨基酸組成的小肽；優(yōu)選地， 所述1個氨基酸為半胱氨酸，或者所述小肽中含有半胱氨酸。
[0014] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞透膜肽和抗菌肽之間、和/或抗菌肽和疏水 性分子之間還連接有1個氨基酸或者2-10個氨基酸組成的小肽，該氨基酸或小肽可以起到 連接肽的作用，以保證細(xì)胞透膜肽、抗菌肽和疏水性分子能夠正確行使各自的功能，和/或 起到提供半胱氨酸以有利于形成二硫鍵的作用；優(yōu)選地，該氨基酸為半胱氨酸，或者所述小 肽中含有半胱氨酸，兩個半胱氨酸可以在分子間形成二硫鍵。載體示意圖見圖1。
[0015] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，在細(xì)胞透膜肽和抗菌肽之間、以及抗菌肽和疏水性 分子之間，各連接有一個甘氨酸。
[0016] 在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，在細(xì)胞透膜肽和抗菌肽之間、以及細(xì)胞透膜肽和 疏水性分子之間，各連接有一個半胱氨酸。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體，其在分子間形成二硫鍵。
[0018] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述二硫鍵可以在上述起連接作用的氨基酸或小肽之間 形成，如果在細(xì)胞透膜肽或抗菌肽中含有半胱氨酸，則也可在這樣的兩個半胱氨酸之間形 成。
[0019] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過在核酸載體中加入半胱氨酸，可以在分子間形成二 硫鍵以穩(wěn)定核酸載體/DNA或RNA復(fù)合體，并降低該復(fù)合體的尺寸，形成直徑在100-200nm 的納米結(jié)構(gòu)。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體，其中所述細(xì)胞透膜肽選自TAT、Rn(n= 6-10)(表示 6-10 個精氨酸組成的肽）、penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKK，SEQIDNO:8)、MAP(KLALKLALKALKAALKLA,SEQIDNO：9),pVEC(LLIILRRRIRKQAHAHSK,SEQIDNO： 10), MPG(Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-NH 2,SEQIDNO：11),MPGANLS(Ac-GALFLGFLGAA GSTMGAWSQPKSKRKV-NH2,SEQIDNO： 12),Stearyl-R8(st-RRRRRRRR-NH2,SEQIDNO： 13), EBl(LIKLWSHLIHIffFQNRRLKWKKK-NH2,SEQIDNO： 14),Tat-DRBD(GRKKRRQRRRPQ-DRBD,SEQ IDNO:15)〇
[0021] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述TAT的序列為4找-1^8-1^8-4找-4找-61]1-4找-Arg_Arg(RKKRRQRRR，SEQIDN0:5)或Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln_Arg-Arg-Arg(GRKK RRQRRR，SEQIDNO:6)。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體，其中所述a-螺旋雙親性結(jié)構(gòu)的抗菌肽 選自（LLKK)3(LLKKLLKKLLKK，SEQIDN0:7)、magainin(GIGKFLHSAKKFGKAFVGE頂NS，SEQID NO：16),Pexiganan(GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK,SEQIDNO：17),mellitin(GIGAVLKVLTTGL PALISWIKRKRQQ，SEQIDN0:18)、天蠶素（Cecropins)、蛙皮素（Magainins)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體，其中所述疏水性分子選自長鏈脂肪酸 (如硬脂酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸等）、膽固醇、磷脂。
[0024] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述核酸載體的序列為Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu -Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQ IDNO：1)〇
[0025] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述核酸載體的序列為Cys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu -Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Cys-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQ IDNO：2)〇
[0026] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述核酸載體的序列為(318-617-1^11-1^11-1^8-1^8-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(S EQIDNO：3)〇
[0027] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述核酸載體的序列為(318-〇78-1^11-1^11-1^8-1^8-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Cys-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(S EQIDNO：4)〇
[0028] 在本發(fā)明中，所述C18是指硬脂酸。
[0029] 本發(fā)明第二方面涉及核酸載體/核酸復(fù)合體，其含有本發(fā)明第一方面任一項的核 酸載體和核酸（DNA或RNA)分子。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的核酸載體/核酸復(fù)合體，所述核酸載體與核酸分子 的電荷比為1-10,例如為2-8。
[0031] 在本發(fā)明中，所述的核酸載體帶有正電荷，核酸分子帶有負(fù)電荷，核酸載體與核酸 分子之間通過正負(fù)電荷間的吸引作用形成復(fù)合體。
[0032] 本發(fā)明第三方面涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項的核酸載體或者第 二方面任一項的核酸載體/核酸復(fù)合體。
[0033] 在本發(fā)明中，所述細(xì)胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)