檢測(cè)水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、試劑盒及基因分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)，設(shè)及一種檢測(cè)水稻抗稻攝病基因 Pigm的引 物、試劑盒及基因分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由稻攝病菌(Magnapothe 0巧zae)引起的水稻稻攝病是對(duì)水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的 病害之一，每年可造成的10~30%減產(chǎn)。選育與利用抗病品種，是防治稻攝病最安全有效的 方法。經(jīng)湖南稻攝病病圃多年鑒定，水稻品種"谷梅4號(hào)"一直為高抗品種。W "谷梅4號(hào)"為供 體，選育并推廣的水稻品種已廣泛應(yīng)用于商業(yè)化育種中，其抗稻攝病性表現(xiàn)穩(wěn)定高抗。
[0003] "谷梅4號(hào)"所攜帶的Pigm基因是抗譜廣且抗性持久的基因之一。Pigm基因被定位 于水稻品種％梅4號(hào)"第6號(hào)染色體10367284~10421563的片段內(nèi)。目前，用于檢測(cè)該基因 的分子標(biāo)記多為顯性或非緊密連鎖標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果易引起誤判;檢測(cè)過(guò)程中使用的EB或聚 炳締酷胺易對(duì)環(huán)境造成污染、對(duì)人體產(chǎn)生危害。開(kāi)發(fā)與抗稻攝病基因 Pigm共分離的特異性 分子標(biāo)記及建立高效、環(huán)境友好的相關(guān)檢測(cè)體系，則對(duì)促進(jìn)Pigm基因在商業(yè)化育種中的應(yīng) 用具有重要意義?；诨痲Man探針的基因分型方法是通過(guò)計(jì)算機(jī)記錄并分析PCR過(guò)程中產(chǎn) 生的巧光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)監(jiān)測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與表現(xiàn)型一致;檢測(cè)過(guò)程無(wú)需電泳，徹底杜 絕了PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染和邸對(duì)環(huán)境的污染、甲醒對(duì)人體的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種快速、可靠、靈敏度 高、特異性強(qiáng)和成本低的檢測(cè)水稻抗稻攝病基因 Pigm的引物、試劑盒及基因分型方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明按照如下方法獲取探針及引物：
[0007] a.采用植物DNA提取方法獲得水稻基因組DNA，作為下游實(shí)驗(yàn)的模板；
[000引b.對(duì)多個(gè)水稻稻攝病抗性基因 Pigm的等位基因與"谷梅4號(hào)"近等基因系序列做比 對(duì)的方法，分析得到能區(qū)別于其感病等位基因的1個(gè)堿基差異位點(diǎn)；
[0009] C.根據(jù)化qMan MGB探針的設(shè)計(jì)原理和設(shè)計(jì)方法，針對(duì)上述位點(diǎn)設(shè)計(jì)化qMan MGB分 型探針、引物；
[0010] d.對(duì)所設(shè)計(jì)的探針、引物進(jìn)行篩選，從中篩選出優(yōu)化地特異性探針、引物;并優(yōu)化 出合適的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。
[0011] 本發(fā)明選定的用于檢測(cè)水稻抗稻攝病基因 Pigm的化qman定性基因型分析PCR引物 包括：
[0012] 上游引物S1806GC-F: 5' -ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAAACGT-3' ；
[0013] 下游引物5180660尺：5'-〔60：1'(：了0：4641'176〔46了41'-3'。
[0014] 本發(fā)明選定的配合上述引物使用的探針包括：
[0015] S1806-VIC:5，-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3,；
[0016] S1806-FAM:5 '-CCCAAATGTTAGACATCATA-3 '。
[0017] 其中，VIC、FAM均為巧光報(bào)告基團(tuán)。
[0018] 本發(fā)明還提供了采用前述探針和引物制成的用于水稻抗稻攝病Pigm基因分型檢 測(cè)的試劑盒。
[0019]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種水稻抗稻攝病基因 Pigm的Taqman定性基因型分析方 法，該方法包括W下步驟：
[0020] 1)提取待測(cè)水稻的基因組DNA，調(diào)整濃度至20-25ngAil左右；
[0021] 2)利用前述探針和引物，通過(guò)化qMan實(shí)時(shí)巧光PCR儀ABI 7500對(duì)水稻基因組DNA進(jìn) 行基因分型檢測(cè)，獲得多組分圖譜和基因分型圖;根據(jù)多組分圖譜，判斷是否有巧光信號(hào)收 集;根據(jù)基因分型圖，判斷基因類(lèi)型：基因分型結(jié)果為GG或GC的水稻基因組，表明存在抗稻 攝病基因 Pigm。
[0022] 本發(fā)明優(yōu)選的？〔1?反應(yīng)體系^2〇41計(jì)為：2XTaqMan*?Genotyping Master Mix ΙΟμ l，20XTaqMan?SNPGenotypingAssayslμl，20-化ng/μlDNA化l，d地20補(bǔ)足至20μl。
[0023] 其中，TaqMan*?Genotyping Master MidRTaqManSSNP Genotyping 433日73分別自 ThermoFisher公司（產(chǎn)品編號(hào)4371353)及Invitrogen公司（產(chǎn)品編號(hào)4332077)購(gòu)得。
[0024] 本發(fā)明優(yōu)選的PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性10分鐘;95°C變性15秒，56°C退火30秒， 72°C延伸1分鐘，共40個(gè)循環(huán);60°C保持1分鐘。
[0025] 本發(fā)明還提供了前述試劑盒在水稻抗稻攝病Pigm基因分型檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明還提供了前述引物和探針W及前述試劑盒在抗稻攝病水稻選育方面的應(yīng) 用。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0028] 本發(fā)明提供了檢測(cè)水稻抗稻攝病基因 Pigm的引物、試劑盒及基因分型方法。采用 本發(fā)明的探針和引物進(jìn)行TaqMan探針?lè)中蜋z測(cè)，每個(gè)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)中包括本發(fā)明的兩 個(gè)引物和探針對(duì)，通過(guò)兩種不同巧光物質(zhì)進(jìn)行雙通道同步檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)檢測(cè)樣品的SNP 位點(diǎn)的基因型判定，能夠克服現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)鑒定方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、需要豐富經(jīng)驗(yàn)和PCR、 RAPD、PCR-RFLP、Southern雜交等檢測(cè)方法操作復(fù)雜或檢測(cè)靈敏度不高、或特異性不強(qiáng)、或 重復(fù)性不好等缺點(diǎn)，徹底杜絕了PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染和EB對(duì)環(huán)境的污染、甲醒對(duì)人體的危 害，具有簡(jiǎn)便、可靠、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、環(huán)境友好的顯著優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例5中利用標(biāo)記S1806GC檢測(cè)各供試水稻材料的基因分型圖；其 中，GG為攜帶Pigm的檢測(cè)結(jié)果，包括谷梅4號(hào)、谷梅2號(hào)及近等基因系B170、B195;CC為未攜帶 Pigm的檢測(cè)結(jié)果，包括9113、38006、則128、黃華占、魔王谷、湘資3150、3168、〇111曰'、培5、 Y58S、廣湘24S、廣占63S、中廣絲苗、3608、43024、〔8823、41555、明恢63、2855、1141、肌12、 1?299、11?24、2338、冊(cè)11、9311;6坊1雜合的檢測(cè)結(jié)果，谷梅4號(hào)與9311的混合0魁；國(guó)為空白對(duì) 照。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例6中利用標(biāo)記S1806GC檢測(cè)近等基因系B170與R1128雜交后代 F2群體的基因分型圖；其中，GG為攜帶Pigm的檢測(cè)結(jié)果，包括11個(gè)個(gè)體;CC為未攜帶Pigm的 檢測(cè)結(jié)果，包括7個(gè)個(gè)體;GC為雜合的檢測(cè)結(jié)果，包括11個(gè)個(gè)體；·為空白對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是W下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0032] 若未特別指明，W下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手 冊(cè)（化*￥〇'4:〔〇1(1591'；[]1旨化1'13〇1'1^日13〇^1:〇巧？'633,1989)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或 按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件;所用原料均為市售商品。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 本實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明所述引物和探針的篩選過(guò)程
[0035] 1、實(shí)驗(yàn)材料及來(lái)源
[0036] 共選擇10個(gè)供試水稻材料，具體為：谷梅4號(hào)、9311、R1128、黃華占、中廣絲苗、 R608、華占 W及W谷梅4號(hào)為供體、9311為輪回親本，經(jīng)雜交、多代回交所得的近等基因系 B170、B195、Z2752(BC6F2單株）。其中，谷梅4號(hào)、B170、B195對(duì)稻攝病菌株67表現(xiàn)抗病，Z2752、 9311、R1128、黃華占、中廣絲苗、R608、華占表現(xiàn)感病。W上材料均由湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究 院提供。
[0037] 2、DNA 提取
[0038] 對(duì)10個(gè)供試材料，于幼苗期分別取少許葉片利用CTAB法提取基因組DNA?；痳o化op 2000微量測(cè)量DM濃度，并將濃度調(diào)至50ngAU左右。
[0039] 3、測(cè)序及序列比對(duì)
[0040] 根據(jù)Pigm基因定位信息，在可能的抗病基元內(nèi)設(shè)計(jì)多對(duì)引物，通過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序及拼 接，獲得10個(gè)材料的等位片段序列；利用GeneDoc對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得與表型一致的 SNP位點(diǎn)106個(gè)。
[0041] 4、探針合成及篩選
[0042] 根據(jù)Pita、PiK等功能SNP信息，選擇5個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物及探針，具體包括 81088了6、518066(：、5191464、51539061'及517137(：1'，其中，在51088了6、518066(：及51539061'位 點(diǎn)處合成引物與探針。通過(guò)對(duì)10個(gè)供試材料進(jìn)行基因分型分析，發(fā)現(xiàn)S1088TG-FAM、 S15390GT-FAM及S15390GT-VIC均未能收集到巧光信號(hào)，因此，僅在SNP位點(diǎn)S1806GC處設(shè)計(jì) 并合成的引物及探針合適用于Pigm的基因型分析。
[0043] 實(shí)施例2-種用