粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶發(fā)酵產(chǎn)酶及其提高酶活的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶發(fā)酵產(chǎn)酶及其提高酶活的方法，屬于生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 1823年財(cái)2；[0發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌(361^&1：丨&1]1&1'〇686118)屬于腸道桿菌科下的沙雷 氏菌屬，可以分泌多種如脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、金屬蛋白酶、硫醇蛋白酶等胞外酶。目前，粘質(zhì) 沙雷氏菌脂肪酶的分泌機(jī)制已經(jīng)被研究清楚，是革蘭氏陰性細(xì)菌的ABC-transpoter機(jī)制。 由于應(yīng)用潛力較大，較多菌株的脂肪酶基因得到了克隆和表達(dá)，值得提出的是，粘質(zhì)沙雷氏 菌Sr41 8000的脂肪酶首次被日本科學(xué)家克隆和表達(dá)，并將酶固定在膜反應(yīng)器上用于拆分 消旋體反式-4-甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯(MPGM)得到(2R，3S)-4-甲氧苯基縮水甘油酸甲 酯。（-)-MPGM可以作為合成手性順式(+ )地爾硫卓。
[0003] 地爾硫卓的化學(xué)名為順-(+ )-5-[(2_二甲氨基）乙基]-2-(4-甲氧基苯基)-3_乙酰 基-2,3-二氫-1，5-苯并硫氮雜卓-4(5H)_酮鹽酸鹽。日本田邊制藥在1973年首次開發(fā)并通 過(guò)FDA認(rèn)證，其作用是抑制鈣離子通過(guò)血管平滑肌和心肌的膜通道慢轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，從而有強(qiáng)烈 的擴(kuò)張血管和心肌細(xì)胞激動(dòng)-收縮解偶聯(lián)作用，在臨床上，主要用于治療不同類型的心絞 痛、心律失常及局部缺血型心臟病和老年性高血壓等，是心血管疾病的主要藥物之一。
[0004] 自上世紀(jì)80年代后期開始，歐美及日本等國(guó)家先后成功的運(yùn)用了化學(xué)-酶法合成 地爾硫卓，包括日本田邊公司、荷蘭DSM公司等。但是，由于目前存在的粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶 在發(fā)酵表達(dá)上均存在酶活不夠高，或者表達(dá)量較低的問題，使得酶液拆分時(shí)間和收率均達(dá) 不到理想要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決上述的技術(shù)問題，提供一種粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶發(fā)酵產(chǎn)酶 及其提高酶活的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶發(fā)酵產(chǎn)酶及其提高酶活的方法，包括如下步驟： 51、 發(fā)酵產(chǎn)酶步驟； 52、 金屬離子組合添加步驟； 其中，所述S1具體包括： S11、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基準(zhǔn)備步驟： a、 種子培養(yǎng)基:準(zhǔn)備蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、NaCl，其重量份為：1:3:2:1，將上述原材料 自來(lái)水溶解、用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，自來(lái)水定容至所需體積，121°C滅菌20 min或以上； b、 發(fā)酵培養(yǎng)基：準(zhǔn)備蔗糖、玉米糊精、蛋白胨、玉米漿粉、硫酸銨、K2HP〇4 · 3H20、NaCl、 MgS〇4、CaCl2、FeS〇4 · 7H2〇，按重量份為 5:10:15:10:4:6:2:0.5:0.1:0.01，將上述原材料自 來(lái)水溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，自來(lái)水定容至所需體積，121°C滅菌20 min或以上； 512、 種子培養(yǎng)步驟： 將凍干管保存的粘質(zhì)沙雷氏菌Dbll(來(lái)源于華東理工大學(xué))接種于添加2%瓊脂的種子 培養(yǎng)基固體平板上，30°C恒溫培養(yǎng)12 h; 選擇平板上的單個(gè)菌落，取一環(huán)接入裝有所述種子培養(yǎng)基的三角瓶中，放置于恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)12 h或以上，得到種子液;種子培養(yǎng)基的體積小于三角瓶容 積的一半； 513、 發(fā)酵培養(yǎng)步驟： 按5%(v/v)的比例將S12培養(yǎng)好的種子液接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始溫度設(shè)定為 32-35°(3，罐壓設(shè)定為0.05-0.07 1〇^，空氣流速設(shè)置為0.5-0.8^111，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié) 攪拌轉(zhuǎn)速，維持發(fā)酵液的溶氧水平不低于20%，通過(guò)流加酸液或堿液，維持發(fā)酵液pH為7.5; 514、 誘導(dǎo)產(chǎn)酶步驟： 在發(fā)酵培養(yǎng)一半時(shí)間后，通過(guò)流加的方式加入產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，然后繼續(xù)發(fā)酵； 515、 發(fā)酵液處理步驟： 采用低溫冷凍離心機(jī)對(duì)S14的發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集上清酶液； 所述S2具體包括： 在S15得到的上清酶液中加入?6304、211(：12、0&(：12，使得?6 2+、2112+、0&2+的濃度為50111〇1/ L〇
[0007] 其中，S14中，所述產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑為吐溫-80稀釋液，在發(fā)酵培養(yǎng)8h后，通過(guò)流加的方 式加入5g/L的所述吐溫-80稀釋液，以0.5-lh流加完為準(zhǔn);發(fā)酵時(shí)間為16h; 優(yōu)選的，所述吐溫-80稀釋液為吐溫-80與蒸餾水按照1:4的比例稀釋。
[0008] 優(yōu)選的，所述S2后檢測(cè)酶活的檢測(cè)步驟包括： 取100 uL適當(dāng)稀釋的酶液加入到2.85 mL、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中，30°C保溫5min 后加入50 uL對(duì)硝基苯酚丁酸酯的DMS0溶液，濃度為200 mmol/L，快速混勻，置于分光光度 計(jì)中，恒溫30°C檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，每隔10 s讀取吸光度值;每分鐘生成lymoL對(duì)硝基 苯酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)， 酶活計(jì)算公式： 酶的發(fā)酵酶活單位(U/L)= △ A45〇*l. 823*104*酶液稀釋倍數(shù) 其中：ΔΑ450為每10 s吸光值變化的品均值。
[0009] 當(dāng)發(fā)酵液的酶活為10000-20000 U/L時(shí)，酶液應(yīng)稀釋5倍后測(cè)定；當(dāng)發(fā)酵液酶活〉 20000 U/L時(shí)，應(yīng)稀釋10倍后再測(cè)定。
[0010] 優(yōu)選的，S12中，具體為取平板上的單個(gè)菌落的一環(huán)接入裝有100 mL種子液培養(yǎng)基 的500 mL三角瓶中。
[0011]優(yōu)選的，S13中，發(fā)酵初始溫度設(shè)定為35°C，罐壓設(shè)定為0.05 MPa，空氣流速設(shè)置為 0.8 vvm〇
[0012] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:粘質(zhì)沙雷氏菌株有產(chǎn)脂肪酶的能力，但是在自然 發(fā)酵狀態(tài)下，產(chǎn)酶量較低，采用吐溫-80作為誘導(dǎo)劑，并采用流加的方式添加，極大提高了產(chǎn) 酶效率。
[0013] 不同的離子通過(guò)改變酶分子的理化性質(zhì)來(lái)影響酶活，通過(guò)優(yōu)化和篩選，采用金屬 離子組合的方式，在發(fā)酵后的酶液中添加，對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用，可很大程度的提高酶 活。
[0014] 該方法的優(yōu)點(diǎn)：1、發(fā)酵方法簡(jiǎn)單；2、誘導(dǎo)劑簡(jiǎn)單易得，誘導(dǎo)作用強(qiáng);3、金屬離子對(duì) 組合添加，在無(wú)需其他步驟的情況下，激活作用強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明使用由華東理工大學(xué)提供的一株粘質(zhì)沙雷氏菌，并發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，通過(guò)誘 導(dǎo)劑誘導(dǎo)的方法，并采用流加的方式添加，使得產(chǎn)酶量較大；同時(shí)，通過(guò)使用金屬離子的組 合添加，活化了脂肪酶的結(jié)合催化中心，提高了脂肪酶的酶活力和催化效率，取得了良好的 效果。以下結(jié)合實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的制備方法： 本發(fā)明的粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶發(fā)酵產(chǎn)酶及其提高酶活的方法，包括如下步驟： 51、 發(fā)酵產(chǎn)酶步驟； 52、 金屬離子組合添加步驟； 其中，所述S1具體包括： S11、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基準(zhǔn)備步驟： 種子培養(yǎng)基： 蔗糖5 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、NaCl 5 g/L、將上述原材料自來(lái)水溶解， 用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，自來(lái)水定容至所需體積，配制5瓶種子培養(yǎng)基，121°C滅菌20 min或以 上待用； 發(fā)酵培養(yǎng)基： 蔗糖5g/L、玉米糊精10 g/L、蛋白胨15 g/L、玉米漿粉10 g/L、硫酸銨4 g/L、 Κ2ΗΡ〇4·3Η20 6 g/L、NaCl 2 g/L、MgS〇4 0.5 g/L、CaCl2 0.1 g/L、FeS〇4.7H20 0.01 g/L，將 上述原材料自來(lái)水溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，自來(lái)水定容至所需體積;配制好10L發(fā)酵培養(yǎng) 基，加水約8.5L，放入15L發(fā)酵罐內(nèi)，按照發(fā)酵罐滅菌方法，121°C滅菌20 min或以上待用，滅 菌后的總體積約為9.5L。
[0016] S12、種子培養(yǎng)步驟： 平板種子培養(yǎng)步驟:取4°C冰箱保存的斜面種子或_80°C保存的凍干管種子，接種于添 加2%瓊脂的種子培養(yǎng)基固體平板上，劃線，接種完后倒置培養(yǎng)于30-35°C恒溫培養(yǎng)箱中，培 養(yǎng)10-16小時(shí)； 搖瓶種子培養(yǎng):選擇平板上的單個(gè)菌落，取一環(huán)接入裝有100 mL種子液培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，30-35°C恒溫振蕩培養(yǎng)12 h或以上。
[0017] S13、發(fā)酵培養(yǎng)步驟： 將培養(yǎng)好的5瓶共500ml搖瓶種子液按5%(v/v)的比例接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初 始溫度設(shè)定為32-35°C，罐壓設(shè)定為0.05-0.07 MPa，空氣流速設(shè)置為0.5-0.8 vvm，發(fā)酵過(guò) 程中通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速，維持發(fā)酵液