一種抗人淀粉樣β肽的納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學與分子生物學領(lǐng)域，涉及一種抗人淀粉樣β肽(amy IoidP，Αβ) 的納米抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是進行性認知功能障礙和行為損害為 特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。2015年9月Alzheimer's disease international，（ADI)的 報告數(shù)據(jù)顯示：目前約每3.2秒就有一人罹患老年癡呆，在老年癡呆患者中60-70%為阿爾 茨海默病性癡呆，隨著老齡人口基數(shù)和比例的持續(xù)增加，AD帶來患者個人的痛苦和社會、家 庭的壓力將越來越嚴重。
[0003] 淀粉樣肽(amyloidi3，Ai3)是存在于人腦的天然產(chǎn)物，其在神經(jīng)細胞發(fā)育(Heo C， et al.J Neurochem.2007;102(2):493-500·)、睡眠調(diào)節(jié)（Kang JE，et al.2009;326 (5955): 1005-7)、抗菌（Soscia SJ，et al .PLoSOne 2010;5:e9505.)等方面發(fā)揮積極的調(diào) 節(jié)作用。但遺傳學分析發(fā)現(xiàn)Αβ前體蛋白（amyloid precursor protein，APP)(Goate A,et al.Nature.1991;349(6311):704-6;Jonsson T，et al.Nature.2012;488(7409):96-9)或 與其代謝相關(guān)的基因如早老素發(fā)生突變與家族性AD的是否發(fā)生相關(guān)（Kamino K，et al.Neurosci Lett.1996；208(3):195-8；Sherrington R,et al.Nature.1995；375(6534): 754-60.)，因此人們認為Αβ肯定與AD的發(fā)生相關(guān)。在AD發(fā)生過程中自由Αβ經(jīng)歷先增加后減 少的過程(Maia LF，et al.EMBO Mol Med.2015;7(7):895-903·)，可能正是由于Αβ的代謝 失衡，Αβ在某種未知條件的誘導(dǎo)下逐漸聚集形成可溶的Αβ聚集體以及不溶的Αβ纖維沉積。
[0004] 動物模型研究和臨床實驗均發(fā)現(xiàn)普通抗體都可以在一定程度上干擾A邱勺代謝，但 在緩解AD病情發(fā)展方面沒有獲得理想的結(jié)果。仔細分析治療過程發(fā)現(xiàn)，其治療機理主要是 通過藥物與血液內(nèi)A邱勺結(jié)合打破血液與腦脊液A邱勺平衡，促使腦脊液內(nèi)Αβ跨越血腦屏障進 入血液;或者是通過抗體跨越血腦屏障起到直接治療效果，但實際所用藥物主要是IgG類抗 體，血液內(nèi)極低的Αβ水平和抗體難于跨越血腦屏障的缺陷，大大限制了其治療效果(Bard F,et al.Exp Neurol.2012；238(I):38-43.)〇
[0005] 為了提高抗體跨越血腦屏障的能力，目前通常對抗體進行包埋修飾或?qū)袠丝贵w 與具有跨血腦屏障能力的蛋白（腦血管內(nèi)皮細胞相關(guān)抗原抗體或具有特殊轉(zhuǎn)胞吞作用的蛋 白）構(gòu)建成嵌合體。無論哪一種策略，都進一步增加了抗體的制備成本。而分子量較?。?2-15kD)等電點較高(p I >9.2)的來自駝科動物重鏈抗體可變區(qū)的納米抗體在不進行任何修飾 的條件下可以非常高效的跨越血腦屏障（Li T，et al.FASEB J.2012;26(10):3969-79.)， 因此納米抗體在腦疾病治療中具有很好的應(yīng)用前景；另外，獲得的納米抗體和普通抗體一 樣可以用于以Αβ為靶標的診斷、檢測與治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供一種抗淀粉樣β肽的納米抗體。
[0007] -種抗淀粉樣?3肽的納米抗體，所述納米抗體氨基酸序列包括框架區(qū)FR和互補決 定區(qū)⑶R，其特征在于，所述的框架區(qū)FR由下組的FR的氨基酸序列組成:如SEQ ID NO. 1所示 的FRl，如SEQ ID NO. 2所示的FR2,如SEQ ID NO. 3所示的FR3,如SEQ ID NO.4所示的FR4;所 述的互補決定區(qū)⑶R由下組的⑶R的氨基酸序列組成：如SEQ ID NO.5所示的⑶R1，如SEQ ID N0.6所示的CDR2，如SEQIDN0.7所示的CDR3。
[0008]進一步地，所述的抗淀粉樣β肽的納米抗體，其具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序 列。
[0009] 本發(fā)明目的之二是提供一種上述所述的納米抗體在制備治療淀粉樣抑太代謝失衡 引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的淀粉樣抑太代謝失衡引起的疾病為阿爾茨海默 病。
[0010] 本發(fā)明目的之三是提供一種上述所述的納米抗體在制備檢測淀粉樣抑太的檢測試 劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供一種DNA分子，其編碼本發(fā)明所述的抗淀粉樣β肽的納米抗體。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明提供了一種特異性的抗Αβ的納米抗體，該納米抗體對Αβ具有與已發(fā)表抗體 不同的氨基酸序列，可以將其對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)入到原核的或真核表達體系中進行表達，獲得 的抗體可以應(yīng)用在各種以Αβ為靶標的疾病的治療藥物的制備以及仙的檢測試劑的制備中。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明納米抗體的框架區(qū)、互補決定區(qū)的位置以及氨基酸序列示意圖。
[0015]圖2為SDS-PAGE電泳檢測納米抗體在IPTG誘導(dǎo)條件下的表達情況。M為蛋白質(zhì)分子 量標準;泳道3為未加 IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白；泳道1與2為IPTG誘導(dǎo)后的全菌蛋白。
[0016]圖3為SDS-PAGE電泳檢測金屬螯合層析分離純化納米抗體情況。M為蛋白質(zhì)分子量 標準，泳道1為流穿液;泳道2-4為50mM咪唑洗脫;泳道5-11為150mM咪唑洗脫；泳道12-13為 500mM咪唑洗脫。
[0017] 圖4為ELISA檢測納米抗體對不同序列(Αβ?2-35、六04〇、六042)與狀態(tài)（單體、可溶聚集 體和纖維)Αβ的結(jié)合能力。對照組與實驗組的區(qū)別是前者包被抗原未加入納米抗體，后者加 入了納米抗體。
[0018] 圖5為MTT檢測納米抗體對Αβ處理細胞SH-SY5Y的保護情況。
【具體實施方式】
[0019] 下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，本申請公開的 DNA序列和氨基酸序列可以按照本領(lǐng)域常用的其他方法獲得。而且可以將本申請獲得的新 的氨基酸序列對應(yīng)的基因構(gòu)建到任何合適的載體，用任何合適的表達體系進行表達。下述 內(nèi)容僅僅是對本申請要求保護的范圍的示例性說明，一些根據(jù)所公開的內(nèi)容做出的改變和 修飾，也應(yīng)當屬于本申請要求保護的范圍。本文實施例中所使用的藥品及試劑若無特殊說 明均按常規(guī)途徑獲得。
[0020] 不同序列的Αβ(Αβ?2-35、Αβ40、Αβ42 )的單體、可溶聚集體和纖維購自杭州中肽生化有 限公司。
[0021 ]實施例1納米抗體庫的建立
[0022] 本發(fā)明使用的噬菌體展示庫是以T7噬菌體為載體的非免疫庫，建立步驟如下：
[0023] (1)提取2歲雄性羊駝外周血淋巴細胞的總RNA(ambi〇n?:PuerLinkTM RNA Mini Kit，Life Technologies :12183018A);以UP primer 1 為引物將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并采用兩輪巢式PCR擴增VHH基因；其中第一輪PCR為以轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，以UP primer 1和DOWN primer 1為引物，PCR擴增后回收大小為650~750bp的條帶，再以此為模 版，進行第二輪PCR擴增，上游和下游引物分別為UP primer 2和DOWN primer 2,回收得到 450~500bp的PCR產(chǎn)物；
[0024] UP primer I: 5'_GGTACGTGCT GTTGAACTGT TCC-3'
[0025] DOWN primer I: 5'-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3'
[0026] UP primer 2: 5'_AAGCTTTTGT GGTTTTGGTG TCTTGGGTTC-3'
[0027] DOWN primer 2: 5'-AAGCTTGGGG TCTTCGCTGT GGTGCG-3'
[0028] (2)用EcoRI和Hindi Π 酶切上述PCR產(chǎn)物，即為VHH基因片段；
[0029] (3)用T4 連接酶連接 ?7 載體（T7Select?l〇-3Cl〇ning Kit, Merck Millipore Novagen'70550-3)和VHH基因片段，將連接產(chǎn)物進行包裝，然后進行擴增(方法見實施例 2)，得噬菌體原始文庫。
[0030] 實施例2 T7噬菌體的液體擴增
[00311 (1)活化宿主菌:在50ml LB培養(yǎng)基(含0 · lmg/mL羧芐青霉素，簡稱Carb-LB)中接種 大腸桿菌BLT5403,37°C170r/min過夜培養(yǎng)，得一代宿主菌；
[0032] (2)在Carb-LB液體培養(yǎng)基中接種1 %的一代宿主菌，搖床培養(yǎng)，到OD6qq為0.5-1.0， 得二代宿主菌；
[0033] (3)用T7噬菌體感染二代宿主菌，37°C200r/min培養(yǎng)2-3h，觀察溶菌情況，溶菌完 全立即停止培養(yǎng)。將溶菌產(chǎn)物在8000g離心10min，并回收上清，上清即為擴增的噬菌體。測 定滴度。
[0034]實施例3 T7噬菌體滴度的測定
[0035] (1)在培養(yǎng)皿中倒入Carb-LB底層培養(yǎng)基，冷卻、凝固；
[0036] (2)溶解頂層培養(yǎng)基，冷卻，加入Carb后45°C保溫；
[0037] (3)用無菌LB液體培養(yǎng)基梯度稀釋擴增的噬菌體；
[0038] (4)300yL二代宿主菌與50yL不同梯度稀釋的噬菌體混勻，加入4mL預(yù)熱Carb-頂層 培養(yǎng)基，迅速倒入有底層培養(yǎng)基的平皿中，晃動平皿使之分布均勻；
[0039] (5) 37°C倒置培養(yǎng)3_4h，直到看