一種pAPN基因定點修飾豬的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種pAPN基因定點修飾豬。
【背景技術(shù)】
[0002] 1、仔豬腹瀉病帶來的損失巨大
[0003] 仔豬腹瀉病是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下一種常發(fā)的、典型的由多因素導(dǎo)致的疾病。 近年來，我國仔豬腹瀉病發(fā)病率與死亡率居高不下，不少豬場的死亡率幾乎是100%，造成 了極大地經(jīng)濟損失。據(jù)不完全統(tǒng)計，2014年我國存欄母豬約4500萬頭，年產(chǎn)仔豬近8億頭，但 最后上市的豬大約只有80%，豬在不同階段的死亡率達20%，其中約有一半是由于腹瀉病 導(dǎo)致的。因此，仔豬腹瀉病對養(yǎng)豬業(yè)來說危害極大。
[0004] 2、仔豬腹瀉病病原
[0005] 豬腹瀉病病原種類繁多，致病性復(fù)雜，有細菌性的、病毒性的及寄生蟲等，其中，由 病毒和大腸桿菌感染仔豬而引起的腹瀉呈現(xiàn)為高發(fā)病率和高死亡率。就病毒性腹瀉而言， 目前認為豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和豬流行 性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrheavirusj邸V)是致使初生仔豬和斷奶仔豬發(fā)生腹 瀉最常見和最重要的病毒。豬傳染性胃腸炎病毒是引起仔豬腹瀉的重要病原之一，尤其是 對1-2周齡仔豬致死率可達100%(Ren et al 2008)。病毒性腹瀉造成的損失也極其嚴重， 2010冬至2012年初，病毒性腹瀉給全國各地規(guī)模豬場造成了很高的發(fā)病率和死亡率，僅在 南方就有超過100萬頭仔豬死于腹瀉(Sun et al 2012)。而對于細菌性腹瀉，K88和F18大腸 桿菌是導(dǎo)致初生仔豬和斷奶仔豬腹瀉最常見和最重要的細菌性病原菌。但是，該病的防治 主要W抗生素為主，但是效果極差，加之抗生素的濫用對食品衛(wèi)生健康造成的危害較大。因 此，培育一種抗仔豬腹瀉病的豬對于防控仔豬腹瀉病，保障養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。
[0006] 3、豬APN的功能和作用
[0007] 病毒豬胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(P邸V)同屬于I型冠狀病毒。目前， 大多數(shù)冠狀病毒成員的細胞表面受體已被鑒定出并呈現(xiàn)一定規(guī)律性。在I型冠狀病毒中，大 多數(shù)病毒的雙體為氨膚酶N(aminopeptidaseN，APN);II型冠狀病毒雙體為W9-0-乙酷唾 液酸;而SARS-CoV的功能性受體是血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE2)。
[000引 1963年，Pf leiderer和Celliers從豬的腎臟中分離得到豬氨膚酶N(Pf leidererfe Celliers 1963) ,1989年根據(jù)cDNA克隆序列對比確定了APN即為細胞表面的促分化抗原 CD13XD13/APN的酶活性表現(xiàn)為從小膚段N端切除氨基酸，故又名氨膚酶N。豬氨膚酶N是含 有Zn2 +的膜結(jié)合型外膚酶，屬于依賴鋒離子的金屬蛋白酶Ml家族，pAPN基因 cDNA全長 2892bp，含有20個外顯子，編碼964個氨基酸，分子量約為150W)a，廣泛存在于多種組織和細 胞中，尤其在小腸黏膜上高效表達，該蛋白通過近N端的螺旋產(chǎn)生跨膜作用進入細胞膜，使 pAPN能夠固定在細胞上，且有一部分N端膚鏈的單個氨基能夠通過催化作用進入細胞漿，從 而發(fā)揮其功能。由于pAPN基因具有重要的作用，其晶體結(jié)構(gòu)也已被解析出來(畑en et al 2012)，但是其作用的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)未見有報道。
[0009] 免疫學和體外研究表明pAPN是TGEV和陽DV等病毒的主要受體，宿主pAPN表達量的 高低在一定程度上決定了病毒感染程度的強弱化elmas et al 1994，Delmas et al 1992， Delmas et al 1993，Li et al 2007，Nam&Lee 2010,李寶賢et al 2009)〇TGEV感染過程中 病毒S蛋白與受體pAPN發(fā)生特異性結(jié)合的位置是pAPN上第717-813位氨基酸(Bridgen et al 1993) dPEDV感染過程中病毒S蛋白與受體pAPN發(fā)生特異性結(jié)合的位置是pAPN上第500- 963位氨基酸(單智夫2012)。
[0010] Me化ebeek等利用某種特殊的神經(jīng)氨酸酶處理刷狀緣細胞后，受體的α(2-3)，α(6- 8)唾液酸結(jié)合位點發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為pAPN與腸道內(nèi)K88ac菌毛的黏附明顯減少 (Me化ebeek et al 2012)eSnoeck等的研究證實，pAPN可W促進小腸上皮細胞內(nèi)吞K88ac菌 毛并且能夠誘導(dǎo)黏膜免疫的發(fā)生（Snoeck et al 2008)。有研究表明，K88ac是通過網(wǎng)格蛋 白介導(dǎo)的細胞吞隧作用內(nèi)陷入IPEC-J2細胞（Rasschaert et al 2010)。]\^化66664等還通 過口服pAPN的抑制劑來研究pAPN的功能，實驗表明，即使在沒有佐劑或輔助性物質(zhì)存在的 情況下，pAPN也可W引起腸道強烈的黏膜免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生數(shù)量較多的IgAJgG抗體，甚至 連初次免疫后產(chǎn)生的IgM抗體也可檢測到(Melkebeek et al 2012)，即使是遠低于可檢測 水平的pAPN也可W促進腸上皮細胞的吞隧作用，并能夠誘導(dǎo)一定的免疫應(yīng)答，運一結(jié)果表 明pAPN是疫苗抗原祀向穿越上皮細胞屏障的作用祀標(Devriendt et al 2012)。綜上所 述，pAPN還可能是K88ac受體的候選蛋白。
[0011] 我們前期的研究顯示pAPN基因在腎臟和空腸中表達最高，仔豬在7日齡表達量最 高，且運正好與腹瀉病毒及K88感染的流行病學呈高度相關(guān)。在細胞系上pAPN表達水平的高 低與病毒感染的強弱呈正相關(guān)，高表達pAPN的ST細胞和成纖維細胞對TGEV的敏感性要遠大 于低表達pAPN的IPEC-J2細胞，且攻毒后高表達pAPN的ST和成纖維細胞出現(xiàn)明顯的細胞病 變(細胞皺縮、變圓、脫壁、死亡）。運些研究在很大程度上也證明了pAPN在仔豬腹瀉病的發(fā) 生中起著十分重要的作用。
[0012] 4、人APN的功能和作用
[0013] APN在人體內(nèi)廣泛表達，存在于多種細胞表面，是一種鋒離子依賴的金屬蛋白酶 化C3.4.11.2)，主要參與細胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲、血管新生W及病毒感染 等病理生理過程。有研究表明其在腫瘤細胞表面高水平表達，是一種重要的腫瘤細胞標記 物功能蛋白（Jeffe巧2003) dAPN還是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，正常血管內(nèi)皮細胞上的 APN未被激活，而在腫瘤新生血管的內(nèi)皮細胞上，APN高度表達（Curnis et al 2000， Pasqualini et al 2000,van Hensbergen et al 2002)。因此，抑制APN的活性可W有效的 預(yù)防和控制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。隨著對APN研究的不斷深入，WAPN為祀點來設(shè)計抑制劑已 經(jīng)成為抗腫瘤藥物的研究熱點已有多種抗腫瘤藥物上市，如師enimex(即烏苯美司膠囊）， 本藥于1987年在日本上市，1998年在中國上市，為國家二類抗腫瘤新藥。豬作為疾病模型較 小鼠等具有諸多的優(yōu)勢，建立pAPN基因敲除豬模型，可能對研究其具體的分子作用機制起 到重要作用，也有可能獲得針對惡性血液病、腫瘤、免疫相關(guān)性W及某些冠狀病毒感染性疾 病等多種疾病的新療法，因而可能具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種pAPN基因定點修飾豬。
[0015] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種pAPN基因定點修飾豬，包 括W下步驟：
[0016] (l)pAPN基因的克隆與序列分析
[0017] 利用pAPN的基因組（GenBank access number:CT737411.6)和cDNA(GenBank access number:冊824547.1)序列信息，設(shè)計引物進行克隆，利用高保真DNA聚合酶擴增目 的片段，克隆至表達載體后，進行測序，對其基因組