一種固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開了一種固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制備方法，屬于右旋糖酐領域。
【背景技術】
[0002]右旋糖酐，又名葡聚糖，是一種由葡萄糖單元脫水形成的高分子聚合物，它的結構具有多樣性，通常被定義為一種完全由α-D-吡喃葡萄糖單體構成的多糖。右旋糖酐是某些細菌產生的一種胞外多糖，是由分泌性酶催化生成的胞外產物，作為最早發(fā)現(xiàn)的微生物多糖，右旋糖酐是美國FDA(食品和藥物管理局)批準的第一種可用于食品的微生物胞外多糖，也是世界上第一個工業(yè)化生產的微生物多糖。右旋糖酐因其安全、無毒、生物相容性好等優(yōu)點，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、色譜分析等多個領域。
[0003]右旋糖酐的生產包括有如下兩種方法:微生物直接發(fā)酵法和酶合成法，而工業(yè)生產上主要以直接發(fā)酵法為主。但直接發(fā)酵法生產葡聚糖時，產物分子大小難以控制，發(fā)酵后菌體與產品很難分離，生產中引入的氮、氯等雜質，致使右旋糖酐質量低，臨床副反應多。而利用誘導分離出的葡聚糖合成酶來制備右旋糖酐可以克服這些不足，因此，從特有的微生物中通過分子生物學技術構建和篩選的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重點之一。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術問題:針對目前右旋糖酐分子量的調控方法包括有化學法、物理法和生物法，其中化學法是傳統(tǒng)所使用的方法，主要是通過鹽酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，該法由于反應條件劇烈，不易控制，反應后部分右旋糖酐被降解成了單糖，因而導致收率很低的問題，提供了一種固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制備方法，本發(fā)明先得發(fā)酵培養(yǎng)基，將棘孢青霉菌和醋桿菌接在培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)得菌體，再超聲破碎后得菌液，將菌液和卡拉膠混合滴加到氯化鈣溶液中，制得右旋糖酐酶固定化細胞微球，將微球轉接至底物溶液中搖床反應，反應后用乙醇沉淀，捏洗干燥后即可本發(fā)明將棘孢青霉菌和醋桿菌發(fā)酵得菌體，里，面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉膠進行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和穩(wěn)定性，用其降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副廣物少，提尚右旋糖IfF的質量。
[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:
(I)按重量份數(shù)計，分別選取30?40份葡萄糖，10?15份蛋白胨，5?8份磷酸氫二鈉，2?4份磷酸二氫鉀，0.5?1.2份氯化鉀，3?5份酵母浸膏和30?50份去離子水，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為7.0，在105?110°C和0.1MPa下滅菌處理10?15min得發(fā)酵培養(yǎng)基;
(2 )向上述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積8?12%棘孢青霉菌種子液和培養(yǎng)基體積1?15%醋桿菌種子液，放入37°C恒溫搖床培養(yǎng)中，在200?220r/min下培養(yǎng)15?20h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4°C和5000?7000r/min轉速下離心分離12?15min，收集沉淀物，將沉淀物按固液比I: 2加入去離子水，得菌體懸浮液；
(3)將上述菌體懸浮液按體積比1:1加入pH6.8濃度0.05mol/LHAC-NaAC緩沖液，混合后在0°C和250?300W下超聲破碎15?20min，每破碎2s，間隔2s，超聲破碎后再在4°C和10000?12000r/min條件下離心分離15?20min，去除沉淀物，得上清液即菌液；
(4)取50?80mL質量分數(shù)3?5%卡拉膠溶液，將卡拉膠溶液和菌液按體積比1:1混合，將混合液緩慢滴加到質量分數(shù)5?8%的氯化鈣溶液中，控制在50?60min滴完，滴加同時在250?350r/min轉速下攪拌，滴加后再攪拌固定25?35min，固定后加入總體積5?8%戊二醛進行交聯(lián)I?2h，形成卡拉膠鈣珠，將卡拉膠鈣珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中靜置過夜，過濾，將過濾物用蒸餾水洗滌2?3次，即可得到右旋糖酐酶固定化細胞微球；
(5)將上述右旋糖酐酶固定化細胞微球按體積5?10%轉接量接至底物溶液中，在270C和100?150r/min恒溫搖床中反應18?20h，反應結束后用質量分數(shù)80%乙醇按體積比3:1混合進行沉淀，將沉淀物放入質量分數(shù)90%乙醇中捏洗2?3次，捏洗后的過濾物放入烘箱中在70?80 °C下干燥5?6h即可。
[0006]所述的底物溶液是每升水中含100?120g蔗糖，1.7?2.2g蛋白胨，1.8?2.2g磷酸氫二鈉，0.02?0.05g氯化鈣和0.003?0.006g硫酸鎂配比組成。
[0007]本發(fā)明制備得到的右旋糖酐酶固定化細胞微球在15?65°C進行測試熱穩(wěn)定性，右旋糖酐酶的相對活性從35?40%升高到100%，隨著溫度的升高又降低至25?30%，在42°C時達到最高，對右旋糖酐轉化率高達92%以上，重均分子量平均為3000?7000Da。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明將棘孢青霉菌和醋桿菌發(fā)酵得菌體，里面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉膠進行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和穩(wěn)定性；
(2)用本發(fā)明制備得到右旋糖酐酶固定化細胞微球降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副廣物少，提尚右旋糖圈1的質量；
(3)本發(fā)明的方法不僅綠色、環(huán)保、低成本、簡便，而且右旋糖酐轉化率高。
【具體實施方式】
[0009]首先按重量份數(shù)計，分別選取30?40份葡萄糖，10?15份蛋白胨，5?8份磷酸氫二鈉，2?4份磷酸二氫鉀，0.5?1.2份氯化鉀，3?5份酵母浸膏和30?50份去離子水，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為7.0，在105?110°C和0.1]\0^下滅菌處理10?1511^11得發(fā)酵培養(yǎng)基；向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積8?12%棘孢青霉菌種子液和培養(yǎng)基體積10?15%醋桿菌種子液，放入37°C恒溫搖床培養(yǎng)中，在200?220r/min下培養(yǎng)15?20h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4°C和5000?7000r/min轉速下離心分離12?15min，收集沉淀物，將沉淀物按固液比I: 2加入去離子水，得菌體懸浮液;將菌體懸浮液按體積比1:1加入pH6.8濃度0.05mol/LHAC-NaAC緩沖液，混合后在0°C和250?300W下超聲破碎15?20min，每破碎2s，間隔2s，超聲破碎后再在4°C和10000?12000r/min條件下離心分離15?20min，去除沉淀物，得上清液即菌液;取50?80mL質量分數(shù)3?5%卡拉膠溶液，將卡拉膠溶液和菌液按體積比1:1混合，將混合液緩慢滴加到質量分數(shù)5?8%的氯化鈣溶液中，控制在50?60min滴完，滴加同時在250?350r/min轉速下攪拌，滴加后再攪拌固定25?35min，固定后加入總體積5?8%戊二醛進行交聯(lián)I?2h，形成卡拉膠鈣珠，將卡拉膠鈣珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中靜置過夜，過濾，將過濾物用蒸餾水洗滌2?3次，即可得到右旋糖酐酶固定化細胞微球;將右旋糖酐酶固定化細胞微球按體積5?10%轉接量接至底物溶液中，在27°C和100?150r/min恒溫搖床中反應18?20h，反應結束后用質量分數(shù)80%乙醇按體積比3:1混合進行沉淀，將沉淀物放入質量分數(shù)90%乙醇中捏洗2?3次，捏洗后的過濾物放入烘箱中在70?80 °C下干燥5?6h即可。
[0010]所述的底物溶液是每升水中含100?120g蔗糖，I.7?2.2g蛋白胨，I.8?2.2g磷酸氫二鈉，0.02?0.05g氯化鈣和0.003?0.006g硫酸鎂配比組成。
[0011]實例I
首先按重量份數(shù)計，分別選取40份葡萄糖，15份蛋白胨，8份磷酸氫二鈉，2份磷酸二氫鉀，1.2份氯化鉀，3.8份酵母浸膏和30份去離子水，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為7.0，在105°C和0.1MPa下滅菌處理1min得發(fā)酵培養(yǎng)基；向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積8%棘孢青霉菌種子液和培養(yǎng)基體積10%醋桿菌種子液，放入37°C恒溫搖床培養(yǎng)中，在200r/min下培養(yǎng)15h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4°C和5000r/min轉速下離心分離12min，收集沉淀物，將沉淀物按固液比1:2加入去離子水，得菌體懸浮液;將菌體懸浮液按體積比1:1加入pH6.8濃度0.05mol/LHAC-NaAC緩沖液，混合后在O °C和250W下超聲破碎15min，每破碎2s，間隔2s，超聲破碎后再在4°C和10000r/min條件下離心分離15min，去除沉淀物，得上清液即菌液;取50mL質量分數(shù)3%卡拉膠溶液，將卡拉膠溶液和菌液按體積比1:1混合，將混合液緩慢滴加到質量分數(shù)5%的氯化鈣溶液中，控制在50min滴完，滴加同時在250r/m