小鼠骨髓雜交瘤細胞株、及其產生的單克隆抗體和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及犬攝熱病毒小鼠骨髓雜交瘤細胞株、其產生的單克隆抗體，含單克隆 抗體的檢測試劑盒和應用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 犬攝熱病毒(化nine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，病毒核 酸為單股RNA，病毒粒子呈圓形或不整形，有時呈長絲狀。CDV對熱和干燥敏感，在50-60°C溫 度下30分鐘即可滅活，在炎熱季節(jié)CDV在犬群中不能長期存活。在較冷的溫度下，CDV可存活 較長時間，在2-4°C可存活數(shù)周，在-60°C可存活超過7年。
[0003] 犬攝熱病是由犬攝熱病毒引起的，屬于犬科、綻熊科和關科動物的一種急性、高度 接觸性傳染病，W雙相熱型發(fā)熱、結膜炎、上呼吸道與肺及胃腸道卡他性炎癥、皮炎、神經炎 和足墊硬化為特征。染病犬的死亡率高達30%-80%，嚴重影響犬及其它易感染動物的健 康，造成大批犬死亡，并可引起患病動物的嚴重后遺癥，造成了嚴重的經濟損失。
[0004] 目前，國內外犬攝熱病毒檢測方法包括電鏡觀察、親和素-生物素-復合物法 (ABC )、免疫巧光法(IFA )、聚合酶鏈式反應法(PCR )，檢測時需要昂貴的儀器設備和專業(yè)的 技術人員，從而限制了其在大規(guī)模篩查方面的應用，使得運些方法偏向于實驗室診斷，不適 合基層或現(xiàn)場快速檢測。基于此，亟需發(fā)展一種快速、簡便、靈敏度高的檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了犬攝熱病毒小鼠骨髓雜交瘤細胞株，其分 泌的抗犬攝熱病毒單克隆抗體，可W有效地診斷、預防和/或治療犬攝熱病毒所引發(fā)的感 染;含所述抗犬攝熱病毒單克隆抗體的檢測試劑盒，可快速、簡便、準確地檢測犬攝熱病毒 抗原。
[0006] 本發(fā)明設及一種小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株巧ybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 6E11)，保藏號為CCTCC N〇:C2015202,保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、，保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏時間為2015年11月25日。
[0007] 本發(fā)明設及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守 性變異體。
[000引本發(fā)明設及一種小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株巧ybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0，s化ain 1G5)，保藏號為CCTCC N0:C2015201，保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、，保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏時間為2015年11月25日。
[0009]本發(fā)明設及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.8所示的氨 基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守 性變異體。
[0010] 本發(fā)明設及一種抗犬攝熱病毒藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含免疫量的 本發(fā)明的所述單克隆抗體或其可變區(qū)氨基酸序列制備的單鏈抗體，W及藥學上可接受的載 體。
[0011] 本發(fā)明還設及犬攝熱病毒檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括有效量的所述單克隆 抗體6E11和有效量的所述單克隆抗體1G5,還包括所述單克隆抗體和犬攝熱病毒的抗原抗 體反應進行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照。
[0012] 本發(fā)明還設及所述抗犬攝熱病毒藥物組合物在制備預防和/或治療犬攝熱相關疾 病的藥物中的應用。
[0013] 本發(fā)明還設及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬攝熱病毒檢測中的應用，其中， 所述非診斷目的的犬攝熱病毒檢測包括流行病學分析、對離體組織進行定性和定量檢測、 表位鑒定研究W及定性和定量鑒別檢驗含犬攝熱病毒全病毒抗原和其他抗原的疫苗組合 物中的犬攝熱病毒全病毒抗原。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] (1)本發(fā)明通過使用特異性高的抗犬攝熱病毒單克隆抗體，制備的酶標記的犬攝 熱病毒檢測試劑盒在硝酸纖維素膜上完成了化ISA檢測過程，實現(xiàn)了酶聯(lián)免疫級聯(lián)放大效 應，因此其靈敏度可W達到化ISA水平，并且操作僅需30分鐘，較化ISA簡便、快速、省時；
[0016] (2)本發(fā)明使用金標記的犬攝熱病毒檢測試劑盒敏感性高于市售進口膠體金檢測 試紙條，提高了 CDV感染的檢出率。
【附圖說明】
[0017] 圖1為酶免疫層析檢測試紙條的側面示意圖，圖中：1-硝酸纖維素膜，2-酶標墊，3-底物墊，4-吸水墊，5-展開液墊，6-檢測線，7-質控線，8-底物緩沖液槽，9-底物緩沖液，10-支撐物，11-檢測樣品。
[0018] 圖2為小鼠骨髓雜交瘤細胞株6E11和1G5分泌單克隆抗體6E11和1G5的聚丙締酷胺 凝膠電泳鑒定圖，其中：泳道M為Marker;泳道1為單克隆抗體1G5,包括上端的重鏈和下端的 輕鏈;泳道2為單克隆抗體6E11，包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
【具體實施方式】
[0019] W下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。
[0020] 本發(fā)明設及小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株化ybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,s1:rain 6E11)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為CCTCC No: C2015202,保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏時間為2015年11月25日。
[0021] 本發(fā)明的小鼠骨髓雜交瘤細胞6E11株由犬攝熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠 后，取其脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選制得。
[0022] 術語"犬攝熱病毒"（caninediStempervirus，CDV)在分類上屬于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(MorbilIivirus)，是一種單鏈RNA病毒，可感染犬科、綻熊 科和關科動物，感染后W雙相熱型發(fā)熱、結膜炎、上呼吸道與肺及胃腸道卡他性炎癥、皮炎、 神經炎和足墊硬化為特征。
[0023] 本發(fā)明設及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守 性變異體。
[0024] 術語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個 體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質不 是離散抗體的混合物。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、犬源化抗體W及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結合結構域的任何多膚?？贵w為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因 子，因而，運個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、犬源化抗體W及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多膚，無論是天然的還是合成產生的?？贵w 的實例是免疫球蛋白亞型（如IgG, I姐，IgM, I曲和IgA)及其亞型亞類;也可W是包含抗原結 合結構域的片段如化13、3。。￥^￥、(1413少(1;和雙鏈抗體((11曰130(1163)。融合至另一多膚的、包 含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述?？贵w可W通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產 生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。運種技術可W包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區(qū)或互補性決定區(qū)（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)， 參見EP.A. 184187 ,GB2188638A或EP.A. 239400。還可W對雜交瘤細胞或產生抗體的其它細 胞進行遺傳突變或其它改變，運不改變所產生抗體的結合特異性。用于本發(fā)明的"單克隆抗 體"也可用基因工程方法制得，因為編碼本發(fā)明鼠源化抗體的DNA序列可用本領域技術人員 熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增得到，因而也可 用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體中。最后，在適 合本發(fā)明抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉化所得的宿主細胞，然后本領域技術人員應用熟知的 常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。抗體包含通過二硫橋連接在一起的多膚 鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多膚主鏈構成抗體的所有主要結構類別（同型物）。重鏈 和輕鏈都進一步可分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個的可變區(qū)和=個不 同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個可變區(qū)（不同于重鏈的可變區(qū)）和單個恒定區(qū)（不同于重鏈的 恒定區(qū)）。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負責抗體的結合特異性。
[0025] 術語"重鏈可變區(qū)"是指一種多膚，其長度為110至125個氨基酸，其氨基酸順序相 應于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，術語"輕鏈可變 區(qū)"是指一種多膚，其長度為95至115個氨基酸，其氨基酸順序相應于本發(fā)明單克隆抗體從 輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。本領域普通技術人員顯然知曉，在本發(fā)明所具體 公開的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列基礎上，可W通過常規(guī)基因工程 和蛋白質工程方法進行一個或多個氨基酸的添加、刪除、替換等修飾，獲得其活性片段或保 守性變異體，而仍能夠保持與犬攝熱病毒特異性結合。本發(fā)明中的單克隆抗體還包括其活 性片段或保守性變異體。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述單克隆抗體為單克隆抗體6E11，由所述小鼠骨 髓雜交瘤細胞6E11株分泌產生。
[0027] 所述單克隆抗體6E11重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列； 所述單克隆抗體6E11輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
[0028] 本發(fā)明的單克隆抗體6E11的相對親和力常數(shù)為1:5120,也就是說，其與抗原的抗 原決定簇的結合強度非常高;所述單克隆抗體6E11IPMA(免疫過氧化物酶單層細胞試驗)效 價為1:12800,與犬攝熱病毒具有良好的反應性。
[00巧]本發(fā)明設及小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株(Hybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0，strain 1G5)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為CCTCC N〇:C2015201， 保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏時間為2015年11月25日。
[0030] 本發(fā)明的小鼠骨髓雜交瘤細胞1G5株由犬攝熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠 后，取其脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選制得。
[0031] 本發(fā)明設及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.8所示的氨 基酸序列或該序列經過一個或多個