雙眉藻及其在產(chǎn)生物柴油、epa、巖藻黃素中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株雙眉藻(Amphora sp.)及其在產(chǎn)生物柴油、EPA、巖藻黃素中的應(yīng)用。本發(fā)明的雙眉藻的保藏編號為CGMCC No.11816。本發(fā)明的雙眉藻是一株綜合性狀優(yōu)良藻株。該藻株生長快，易采收，生物質(zhì)生產(chǎn)成本低于多數(shù)微藻。在制備生物柴油的同時，利用生物精煉技術(shù)可以獲得EPA、類胡蘿卜素和巖藻黃素等高附加值產(chǎn)品，其胞外多糖和二氧化硅硅殼也具有商業(yè)價值。CGMCC No.1181620160108
【專利說明】
雙眉藻及其在產(chǎn)生物柴油、EPA、巖藻黃素中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株富油微藻及其在產(chǎn)生物柴油、EPA、巖藻黃素中的應(yīng)用，特別涉及 一株雙眉藻及其在產(chǎn)生物柴油、EPA、巖藻黃素中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 化石燃油短缺及其燃燒時帶來的環(huán)境污染問題，使可再生的代用燃料一一生物柴 油備受關(guān)注。微藻可以在灘涂、鹽堿地、粘土地等荒蕪土地上及淺海和湖泊中大規(guī)模培養(yǎng)， 不與糧爭地，不與人爭糧，并可節(jié)約淡水資源，還可與工廠廢棄的二氧化碳處理和減排相結(jié) 合。因此，微藻被認為是極具開發(fā)潛力的生物柴油原料。近幾年，研究者們獲得了許多具有 生物柴油開發(fā)潛力的富油微藻。然而，由于微藻培養(yǎng)、采收和加工的高成本，導致微藻生物 柴油的生產(chǎn)成本仍不能與化石燃油相比，限制了微藻生物柴油的商業(yè)化生產(chǎn)。
[0003] 目前，研究者們普遍認為，將微藻生產(chǎn)生物柴油藻與微藻生物精煉(Biorefining) 技術(shù)相結(jié)合將是解決微藻生物柴油高成本的有效途徑。微藻富含多不飽和脂肪酸、優(yōu)質(zhì)蛋 白、多糖、色素及多種特殊的次級代謝物質(zhì)，在生產(chǎn)生物柴油的同時，進行多不飽和脂肪酸、 蛋白或色素等高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)，將有效降低微藻生物燃油的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一株雙眉藻(Amphora sp.)及其產(chǎn)生物柴油、EPA和巖藻黃素富油微 藻中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的雙眉藻(Amphora sp.)是本實驗室經(jīng)過多年篩選，獲得一株綜合性狀優(yōu) 良硅藻株系，命名為BQWSM，已于2016年1月8日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心 (地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），保藏編號為CGMCC No. 11816。雙眉藻藻株BQWSM的形態(tài)為殼面橢圓形，長10~12.5微米，寬6~7.5微米。兩端頭 形，寬2.8~3.5微米，背緣凸出、腹緣內(nèi)凹，殼縫直，左右對稱。
[0006] 本發(fā)明經(jīng)過培養(yǎng)檢測發(fā)現(xiàn)，雙眉藻(Amphora sp. )BQWSM CGMCC No . 11816環(huán)境適 應(yīng)性強，易培養(yǎng)，易采收，具體如下所述：
[0007] (1)溫度適應(yīng)性強：屬耐高溫藻種，生長最適溫度:30-38°C，可耐4°C低溫和45°C高 溫。在海南可常年室外培養(yǎng)，無需溫控設(shè)備。
[0008] (2)鹽度適應(yīng)性強：屬廣鹽性藻種，目前實驗表明，在淡水至鹽度為80%。的海水中 均可生長，最適鹽度為30%。一60%。，最尚鹽度尚未實驗。
[0009] (3)可進行附著培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。
[0010] (4)容易采收:該藻種在不同培養(yǎng)條件下呈較大顆粒狀或片狀的群體細胞形態(tài)，可 用篩網(wǎng)過濾采收，降低采收成本。
[0011]雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No.11816油脂含量可達細胞干重30-60%。在 35°C條件下，F(xiàn)/2海水培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，總脂含量可達到20%以上;培養(yǎng)7天，當達到指數(shù)生長 中后期時，藻細胞總脂含量可達30%以上；當達到生長后期，或環(huán)境刺激（如低溫或高鹽條 件培養(yǎng)），藻細胞總脂含量最高可達到60%以上。
[0012]雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No .11816藻油主要成份是：
[0013]棕櫚酸(C16:0):30% 左右；
[0014] 棕櫚油酸(C16:1):25%左右；
[0015] EPA(二十碳五烯酸，C20:5):3%-25% 左右
[0016] 棕櫚酸(C16:0)和棕櫚油酸(C16:1)比例高，占50%以上，兩種脂肪酸碳鏈較短，飽 和度較高，適合做生物柴油。
[0017] 雙眉藻（Amphora sp. )BQWSM CGMCC No.11816只含EPA，不含DHA，因而較易獲得 已卩八純品。此外，雙眉藻(細?11〇^8?.沖0131061〇：如.11816藻株易采收和培養(yǎng)，生物質(zhì)生 產(chǎn)成本較低，油脂含量高，EPA占脂肪酸量最可達25%，高于多數(shù)微藻，因而是較理想的制備 EPA的原料。
[0018] 雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生產(chǎn)EPA中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護 范圍。
[0019] 所述應(yīng)用中，生產(chǎn)EPA中包括培養(yǎng)雙眉藻(Amphora sp.)CGMCCNo.ll816用于提取 EPA，所述雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816按照包括下述步驟的方法培養(yǎng)：
[0020] 1)將雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816接種至含硅酸鹽的培養(yǎng)基靜置或通氣 培養(yǎng)藻種，培養(yǎng)溫度為30~38 °C，，獲得藻種培養(yǎng)液；
[0021] 2)將步驟1)培養(yǎng)的藻種培養(yǎng)液與含硅酸鹽的培養(yǎng)基按照體積比1:20-120置于培 養(yǎng)容器中進行大量培養(yǎng)，將可供硅藻附著的固體附著板或附著網(wǎng)（如PC板或其它固體附著 材料)豎直(垂直于容器底部）固定于培養(yǎng)容器中，形成用于雙眉藻附著的附板，相鄰的兩個 間隔3-6厘米，向培養(yǎng)容器中通入空氣，使海水培養(yǎng)基的溫度為30-38Γ，對硅藻附板照射燈 光，光照強度10-80mol .πΓ2. s^1，光照時間每天12-15小時，培養(yǎng)3至10天后，米收藻株細胞。 [0022] 所述雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816培養(yǎng)后還包括低溫刺激，所述低溫刺 激的步驟為:置于10-25Γ低溫環(huán)境中給予低溫刺激0.5-2天。
[0023] 所述低溫刺激優(yōu)選15-25Γ低溫環(huán)境，低溫刺激的方法可以為放置于低溫循環(huán)水 浴鍋中刺激。
[0024] 雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護范圍。
[0025] 雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生產(chǎn)類胡蘿卜素中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明 的保護范圍。
[0026]所述類胡蘿卜素中，含量較高的是巖藻黃素，因此，本發(fā)明的雙眉藻(Amphora sp.) CGMCC No. 11816也可以用于高效提取巖藻黃素。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明的雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816是一株綜合性 狀優(yōu)良藻株。該藻株生長快，易采收，生物質(zhì)生產(chǎn)成本低于多數(shù)微藻。在制備生物柴油的同 時，利用生物精煉技術(shù)可以獲得EPA、類胡蘿卜素和巖藻黃素等高附加值產(chǎn)品，其胞外多糖和 二氧化硅硅殼也具有商業(yè)價值。
【附圖說明】
[0028] 圖1為雙眉藻(Amphora sp. )BQWSM顯微鏡下照片。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1.雙眉藻(Amphora sp. )BQWSM的篩選、分離和鑒定 [0030] 1、雙眉藻(Amphora sp · )BQWSM的篩選
[0031] 我們經(jīng)過篩選，獲得一株綜合性狀優(yōu)良的硅藻株系：雙眉藻（Amphora sp.) bqwsm，具體方法如下：
[0032] 取海南?？诮逗Ｋ?，補加營養(yǎng)鹽富集，瓶底長出褐色藻落后，取褐色藻落涂平板 (平板用F/2培養(yǎng)基+1.5%瓊脂配制而成），獲得多個雙眉藻單克隆，挑取多個單克隆用F/2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，再經(jīng)過涂平板分離純化，經(jīng)十幾代的分離純化經(jīng)，高溫、高鹽篩選適應(yīng)性 強生長快的藻株，常溫培養(yǎng)，檢測EPA含量，挑取EPA含量最高的藻株，再進行平板純化，培 養(yǎng)。獲得一株雙眉藻，命名為BQWSM。
[0033] 2、雙眉藻(Amphora sp. )BQWSM的鑒定
[0034] 2.1形態(tài)學鑒定
[0035] 在100倍油鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM(圖1)，可見 藻細胞殼面橢圓形，長10~12.5微米，寬6~7.5微米。兩端頭形，寬2.8~3.5微米，背緣凸 出、腹緣內(nèi)凹，殼縫直，左右對稱。
[0036] 2.2、分子鑒定方法：已測定18s rDNA和ITS序列
[0037] 離心收集對數(shù)期微藻細胞，CTAB法提取基因組DNA。分別以真核藻類18srDNA和ITS 通用引物擴增藻細胞的18srDNA序列和ITS序列。
[0038] 18srDNA引物序列為：18SF:5'GGA TCA GAA TTC TAT CTG GTT GAT CCT GCC AG 3，；
[0039] 18SR:5'-CTC AGT AAG CTT GAT CCT TCC GCA GGT TCA CC-3'。
[0040] ITS引物序列為:ITSF: 5 ' -GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3 ' ；
[0041 ] ITSR:5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
[0042] PCR反應(yīng)條件如下：94°C預變性5min;94°C變性lmin，55°C退火30s，72°C延伸 1.5min，30個循環(huán)；，最后72°C延伸8min。膠回收后的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體(購自大連寶 生物)連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109(北京微生物研究所）。挑選5個轉(zhuǎn)化菌落進行PCR檢 測，再將擴大培養(yǎng)后的重組菌落送去上海生工和上海捷瑞公司完成測序。
[0043] 測序結(jié)果表明，18srDNA序列如序列表中序列1所示，ITS序列如序列表中序列2所 示。利用Blast將測序所得的18S rDNA和ITS序列進行同源性比對，結(jié)果表明，藻株的 18srDNA序列與Amphora cofeaefomis 18S rDNA序列的相似度98%. ;ITS序列與Amphora cofeaefomis序列的相似度95%,與Amphora salina序列的相似度97%。
[0044] 根據(jù)形態(tài)學和分子生物學鑒定方法，鑒定該藻種為雙眉藻屬，命名為：雙眉藻 (Amphora sp.)BQWSM，雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM，已于2016年1月8日保藏于中國普通微 生物菌種保藏管理中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究 所），保藏編號為CGMCC No.11816。
[0045] 實施例2.雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816的性能鑒定
[0046]
【申請人】經(jīng)過對雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816多方面的綜合評價分 析，發(fā)現(xiàn)該藻株是一株產(chǎn)EPA和巖藻黃素富油微藻，具有商業(yè)開發(fā)的潛力，具體如下所述：
[0047] 一、雙眉藻(Amphora sp. )BQWSM CGMCC No. 11816的環(huán)境適應(yīng)性檢測：
[0048] 經(jīng)過培養(yǎng)檢測發(fā)現(xiàn)，雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816環(huán)境適應(yīng)性強， 易培養(yǎng)，易采收，具體如下所述：
[0049] (1)溫度適應(yīng)性強：屬耐高溫藻種，生長最適溫度:30_38°C，在海南可常年室外培 養(yǎng)，無需溫控設(shè)備。
[0050] 溫度實驗：
[0051] 藻種培養(yǎng):雙眉藻以f/2培養(yǎng)基單藻種靜止培養(yǎng)。待培養(yǎng)到指數(shù)生長期后，取藻液 按1:8比例接種于3L玻璃三角瓶中。搖勻后分裝于500ml三角瓶中，每瓶400ml藻液。實驗設(shè)4 個處理:20 °C、30°C、35°C、38°C，每個處理3個重復。光周期為14h: 8h，光照強度為4000Lux。 海水取自海口市白沙門，鹽度30%。，pH8.1。過濾后高壓滅菌。
[0052]生長測定:雙眉藻培養(yǎng)6天后離心(5000g)收集，去離子水清洗一次，再次離心獲得 藻細胞沉淀。藻細胞冷凍干燥(Labconco)后以精密分析天平(MA200，上海良平儀器儀表有 限公司)稱重。據(jù)以下公式計算雙眉藻的相對生長速率(K)和細胞倍增時間：
[0053] K=(lnN2-lnNl)/(t2_tl)
[0054] Τ = 0·6931/Κ(2)
[0055] 式中，Κ為相對生長速率;tl、t2為對應(yīng)的培養(yǎng)時間（3天）；Ν1和Ν2分別為tl、t2時期 的細胞干重;T為細胞的平均倍增時間。
[0056] 實驗結(jié)果:靜止培養(yǎng)條件下細胞的比生長速率和倍增時間如表1
[0057] 表 1
[0059]備注:abc表示方差分析差異程度，同一欄內(nèi)標有相同字母的處理之間沒有顯著差 異，P>0.05;同一欄內(nèi)沒有相同字母的處理之間差異顯著，Ρρ〈0.05。
[0060] (2)廣鹽性：屬廣鹽性藻種，目前實驗表明，在淡水至鹽度為80%。的海水中均可生 長，鹽度為10%。一60%。的條件下生長速率無顯著差異(P〈0.05)(表2)，最高鹽度尚未實驗。 [0061 ] 鹽度實驗：
[0062] 藻種培養(yǎng):雙眉藻以F/2培養(yǎng)基單藻種靜止培養(yǎng)。待培養(yǎng)到指數(shù)生長期后，取藻液 按20mg/L比例接種于5L玻璃三角瓶中。搖勻后分裝于500ml三角瓶中，每瓶400ml藻液。實驗 設(shè)置6個鹽度梯度（10%。一 60%。）的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光周期為 14h:8h，光照強度為4000LUX，溫度30°C。每個梯度設(shè)3個平行。
[0063] F/2培養(yǎng)基為每升海水中添加如下元素：NaN03 75mg，NaH2P04 · 2H20 5.65mg, Na2EDTA 4.16mg,FeC13 · 6H20 3.15mg,Na2Si03 · 9H20 20mg,CuS04 · 5H20 0.01mg,ZnS04 · 7H20 0.022mg,CoCl2 · 6H2O O.Olmg, MnC12 · 4H20 0.18mg,Na2Mo04 · 2H20 0.006mg, Vitamin B12 0.0005mg，Vitamin B1 0.1mg，Biotin 0.0005mg。
[0064] 生長測定：同溫度實驗中的生長測定方法。
[0065] 實驗結(jié)果如表2所示：
[0066]表 2
[0068]備注:abc表示方差分析差異程度，同一欄內(nèi)標有相同字母的處理之間沒有顯著差 異，P>0.05;同一欄內(nèi)沒有相同字母的處理之間差異顯著，Ρρ〈0.05。
[0069] (3)可進行附著培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。
[0070] (4)容易采收:該藻種在不同培養(yǎng)條件下呈較大顆粒狀或片狀的群體形態(tài)，可用篩 網(wǎng)過濾采收，降低采收成本。
[0071] 二.雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816細胞油脂含量測定
[0072] 雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816油脂含量可達細胞干重30-60%。在 35°C條件下，F(xiàn)/2海水培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，總脂含量可達到20%以上;培養(yǎng)7天，達到指數(shù)生長中 后期，總脂含量可達30%以上；生長后期或低溫或高鹽條件下的藻細胞總脂含量最高可達 到60%以上。
[0073] 3.生物質(zhì)產(chǎn)量高：
[0074] (1)靜置培養(yǎng)：每升接種量20mg藻細胞（濕重），38°C，光照強度為4000LUX，400ml F/2海水培養(yǎng)基，500ml錐形瓶靜置培養(yǎng)7天，生物量約為4.5g\m2，0.2g干重/L，高于兩株海 水小球藻Chlorela ssp.相同培養(yǎng)條件下的生物質(zhì)產(chǎn)量。
[0075] (2)通空氣培養(yǎng):接種量20mg藻細胞(濕重）/L，利用50L培養(yǎng)箱通入空氣（空氣流 量：15L/min)培養(yǎng)，30°C，光照強度為4000LUX，光周期為14h:8h，生物質(zhì)產(chǎn)量約為3g/m2/d， 約0.2g/L/d。
[0076] 3、脂肪酸組成分析表明，該株藻種可以作為生產(chǎn)EPA和生物柴油原料
[0077] 培養(yǎng)條件為：500ml錐形瓶靜置培養(yǎng)，光照強度為4000LUX，光周期為14h: 8h，溫度 30°C。設(shè)2個處理：（1)30°C條件培養(yǎng)7天后，采收，冷凍干燥；（2)30°C條件培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入20 °C條件下再培養(yǎng)2天，采收，冷凍干燥。
[0078]將冷凍干燥的藻粉0.3研磨，氯仿-甲醇法提取總脂（Bligh，E.G.，Dyer，W.J.， 1 9 5 9 . A rapid method of total lipid extraction and purif ication.Can. J.Biochem.Physiol ·37,911_917·)，然后甲酯化，甲酯化反應(yīng)如下：
[0079] 甲酯化過程：先加入3ml 0 · 5mol/LK0H/甲醇溶液60°C水浴15min，冷卻后加入2ml 14 %的BF3溶液，60 °C水浴中振蕩2min，放至室溫，加入2ml正己烷，振蕩均勻，加入lml飽和 氯化鈉溶液和少量無水亞硫酸鈉，靜置，取lml于2ml玻璃試管，加入適量白土去除色素，取 上清進行GC分析。
[0080] GC色譜條件:氣相色譜分析過程中，進樣量為lyL，分流比為30:1。色譜條件:FFAP 柱為30m*0.25mm，膜厚0.50μπι;進樣口溫度為250°C，檢測器溫度為280°C ;程序升溫，50°C下 保留lmin.，以25°C/min升到200°C，再以3°C/min升高到230°C，保留lOmin.總運行時間 27min。載氣為高純氮氣。通過樣品保留時間與37種脂肪酸甲酯標準品（Supe lco 37Component FAME mix, St .Louis, MO, USA)色譜圖保留時間的比對，確定樣品中脂肪酸甲 酯的成分，（即保留時間相同則為同一脂肪酸甲酯成分）。
[0081 ] 結(jié)果如下：
[0082] 雙眉藻(Amphora spjBQWSM CGMCC No .11816藻油主要成份是：
[0083] 棕櫚酸（C16:0):30%;
[0084] 棕櫚油酸（C16:l):25%;
[0085] EPA(二十碳五烯酸，C20:5):4% ~10%(3(TC 培養(yǎng)）20% - 25%(3(TC 培養(yǎng) 7 天，再 轉(zhuǎn)入20°C培養(yǎng)2天）
[0086] 棕櫚酸(C16:0)和棕櫚油酸(C16:1)比例高，占50%以上，兩種脂肪酸碳鏈較短，飽 和度較高，適合做生物柴油。
[0087] EPA屬于Ω-3系列多不飽和脂肪酸，是魚油的主要成分，具有多種藥理作用。EPA具 有幫助降低膽固醇和甘油三酯含量、促進體內(nèi)飽和脂肪酸代謝的作用，從而降低血液粘稠 度，增進血液循環(huán)，防止脂肪在血管壁的沉積，預防動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展、預防腦血 栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病。
[0088]目前商業(yè)上EPA主要來源是深海魚油，由于深海魚類生長的不確定性及人類頻繁 捕撈，加上各種污染導致魚類資源越來減少，質(zhì)量也相應(yīng)下降。因此，尋找其他替代資源已 成為新的研究熱點。微藻來源的多不飽和脂肪酸具有原料容易獲得，供應(yīng)穩(wěn)定，不破壞生態(tài) 平衡等優(yōu)點。許多微藻如三角褐脂藻（Phaeodacty lum tr icornutum)和微綠球藻 (Nannochloropsis oculata)可以合成EPA，但往往同時含有一定量DHA，二者不易分離，分 離到的是產(chǎn)物往往是EPA和DHA的混合物。我們的藻株只含EPA，不含DHA，因而較易獲得EPA 純品。此外，Amphora sp.BQWSM藻株易采收和培養(yǎng)，生物質(zhì)生產(chǎn)成本較低，油脂含量高，EPA 占脂肪酸量最可達25%，高于多數(shù)微藻，因而是較理想的制備EPA的原料。
[0089] 4、類胡蘿卜素和巖藻黃素(fucoxanthin)含量高
[0090]類胡蘿卜素是一種抗氧化劑，有緩解心血管病的藥療性能，2018年其全球市場銷售 總值將達到3.09億美元。目前，工業(yè)上生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要原料是紅酵母和杜氏鹽藻，其 最高含量分別為干物質(zhì)重的3.5 %和10 %。
[0091 ] 按照蘿卜素含量測定方法（參考文獻：Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids :pigments of photosynthetic biomembranes.Methods in Enzymology, 1987，148:350-382 ·)對Amphora sp · BQWSM藻株胡蘿卜素進行測定：
[0092] 90%丙酮法提取色素，按照下式計算提取液中
[0093]類胡蘿卜素的含量：
[0094] 類胡蘿卜素(mg/L) = (1000 XD470 - 3 · 27 X Chla -104 X Chlb)/229
[0095] 我們實驗結(jié)果表明，Amphora sp.BQWSM藻株的類胡蘿卜素含量高達10%以上。
[0096]巖藻黃素是一種脂溶性天然類胡蘿卜素，占類胡蘿卜素總量10%以上，具有抗氧化 活性、抗炎癥、抗腫瘤和抗肥胖等作用，可用于食品加工和動物飼料中，是預防癌癥和減肥 的有效藥物。自然界中巖藻黃素大量存在于褐藻、硅藻及海洋軟體動物中，目前多從海帶中 提取制備。研究表明（嚴小軍，范曉，婁清香，等.海藻中類胡蘿卜素的提取及含量測[J].海 洋科學集刊，2001，6(43): 108-114)，海帶巖藻黃素含量約為干物質(zhì)重的0.5mg/g左右，鼠尾 藻中巖藻黃素含量為〇.724mg/g，海黍子中巖藻黃素含量為0.680mg/g，裙帶菜中巖藻黃素 含量為 1.141mg/g。
[0097]巖藻黃素提取和測定方法(劉梁，勾明玥等，海帶巖藻黃素提取工藝的優(yōu)化大連工 業(yè)大學學報，2010,29(8) :406-408):
[0098] 稱取一定量的硅藻干粉（30mg)，加入20yLDMS0和0.5mL85%甲醇于研缽中避光研 磨lOmin。加入85%甲醇，置于40°C水浴避光浸提60min，靜置，取上清，反復抽提，合并上清 液，于445nm處測定吸光值。
[0?00] 式中，A為樣品在445nm處的吸光值;Alcm是在lcm光程長的比色皿中l(wèi)g/L巖藻黃素 的理論吸收值，即1 600;n為稀釋倍數(shù);V為提取液總體積，mL;m為樣品質(zhì)量，g。
[0101] 我們實驗表明，上述培養(yǎng)條件下（30°C，鹽度30，光照40001ux)Amphora sp · BQWSM 藻株巖藻黃素含量高達l〇mg/g以上。因此，可以利用本發(fā)明的雙眉藻(Amphora sp. )BQWSM CGMCC No. 11816提取生產(chǎn)巖藻黃素。提取方法可以為現(xiàn)有的巖藻黃素提取方法。
[0102] 綜上所述，Amphora sp.BQWSM藻株是一株綜合性狀優(yōu)良藻株。該藻株生長快，易采 收，生物質(zhì)生產(chǎn)成本低于多數(shù)微藻。在制備生物柴油的同時，利用生物精煉技術(shù)可以獲得 EPA、類胡蘿卜素和巖藻黃素等高附加值產(chǎn)品，其胞外多糖和二氧化硅硅殼也具有商業(yè)價值。
[0103] 實施例3、雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816在生產(chǎn)EPA中的應(yīng)用
[0104] 如實施例2中所述，本發(fā)明的雙眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC Νο·11816*ΕΡΑ 含量很高，并且不含DHA，比較容易提取和純化，本發(fā)明的發(fā)明人提供一種培養(yǎng)雙眉藻生產(chǎn) EPA的方法，具體如下：
[0105] 1、藻種培養(yǎng)步驟：
[0106] F/2海水培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)藻種；
[0107] 培養(yǎng)溫度為30-38°C，培養(yǎng)時間為7天，至藻種濃度0. lg/L左右。
[0108] F/2海水培養(yǎng)基的配方為每升海水中添加如下元素：NaN0375mg，NaH2P04 · 2H20 5.65mg，Na2-EDTA 4.16mg，F(xiàn)eCl3*6H2〇 3.15mg，Na2Si〇3*9H2〇 20mg，CuS〇4*5H2〇 O.Olmg， ZnS〇4 · 7H20 0.022mg，CoCl2 · 6H2O 0.01mg，MnCl2 · 4H20 0.18mg，Na2Mo〇4 · 2H20 0.006mg， Vitamin B120.0005mg,Vitamin B10.lmg,Biotin 0.0005mg〇
[0109] 2、大量培養(yǎng)步驟：
[0110] 向50升的培養(yǎng)容器中加入40升F/2海水培養(yǎng)基，海水培養(yǎng)基鹽度為35%。至55%。，將 上步驟培養(yǎng)的藻種按靜置培養(yǎng)藻種體積與海水培養(yǎng)基體積比1:100置于培養(yǎng)容器中，將PC 板豎直(垂直于培養(yǎng)容器底部）固定于培養(yǎng)容器中，形成多個用于雙眉藻附著的附板，相鄰 兩個附板間隔3厘米，向硅藻附板吹送空氣（10L-25L/min)，使海水培養(yǎng)基的溫度為30-38 °C，對硅藻附板照射燈光，光照強度10-80mol .πΓ2. ?Γ1，使晝:夜比為14小時：10小時；
[0111] 采收步驟:在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)3至5天后，取出硅藻附板，放置于添加起膜劑的溶液 中（添加起膜劑的F/2培養(yǎng)基或海水，起膜劑添加濃度為70g/L)，l至2天后，附著于硅藻附板 上的硅藻細胞會呈膜狀或大塊片狀懸浮在水體中，用網(wǎng)篩過濾采收硅藻細胞;起膜劑由下 述重量份數(shù)比的組分組成NH 3S〇4: NaN03 = 5:1。
[0112] 低溫刺激步驟:將采收后的硅藻細胞集中起來，置于循環(huán)水浴鍋中給予15、18、20 或25 °C低溫刺激1天，然后將硅藻細胞冷凍干燥。
[0113] 3、EPA的檢測和提取(見實施例2的GC測脂肪酸方法，包括:抽提總脂，甲酯化反應(yīng)， 氣相色譜分析EPA和各種脂肪酸百分含量），提取方法可以按照現(xiàn)有技術(shù)提取。
[0114]本發(fā)明的硅藻培養(yǎng)方法包括低溫刺激步驟，經(jīng)分析，各低溫刺激后的藻細胞油脂 含量可達50 %，EPA含量可占脂肪酸組成的20 %以上，是不經(jīng)低溫處理藻細胞的3倍。
[0115]以上說明對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解， 在不脫離所附權(quán)利要求所限定的精神和范圍的情況下，可做出許多修改、變化或等效，但都 將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一株雙眉藻(Amphora sp·)，其特征在于，所述雙眉藻(Amphora sp.)的保藏編號為 CGMCC No.11816。2. 雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No .11816在生產(chǎn)EPA中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，生產(chǎn)EPA中包括培養(yǎng)雙眉藻(Amphora sp.) CGMCC No. 11816，所述雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816按照包括下述步驟的方法培 養(yǎng)： 1) 將雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816接種至含硅酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)藻種，培養(yǎng) 溫度為25 °C~38 °C，獲得藻種培養(yǎng)液； 2) 將步驟1)培養(yǎng)的藻種培養(yǎng)液與含硅酸鹽的培養(yǎng)基按照體積比1:20-120置于培養(yǎng)容 器中進行大量培養(yǎng)，將可供硅藻附著的固體附著板或附著網(wǎng)豎直固定于培養(yǎng)容器中，形成 用于雙眉藻附著的附板，相鄰的兩個附板間隔3-6厘米，向培養(yǎng)容器中通入空氣，使海水培 養(yǎng)基的溫度為30-38°C，對硅藻附板照射燈光，光照強度10-80mol.m- 2. s-1，光照時間每天 12-15小時，培養(yǎng)3至10天后，采收藻株細胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述雙眉藻（Amphora sp .) CGMCC No. 11816培養(yǎng)后還包括低溫刺激，所述低溫刺激的步驟為:給予10-25 °C低溫刺激0.5-2天。5. 雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。6. 雙眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生產(chǎn)類胡蘿卜素中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述類胡蘿卜素為巖藻黃素。
【文檔編號】C12P7/64GK105969666SQ201610414424
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】劉志媛
【申請人】海南大學