本發(fā)明屬于生物碳點(diǎn)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于熒光影像成像的碳點(diǎn)、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

碳點(diǎn)作為一種新生的納米材料，被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中，尤其是其熒光性質(zhì)，以及可以通過細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的特性，碳點(diǎn)在細(xì)胞影像的方面的作用尤為突出。碳點(diǎn)在一定的范圍內(nèi)具有激發(fā)依賴性，也就是，其發(fā)射波長(zhǎng)隨著激發(fā)波長(zhǎng)的紅移而紅移，這也是判斷其是否為碳點(diǎn)的條件之一。與其他熒光納米粒子相比，碳點(diǎn)具有低毒性、熒光性能穩(wěn)定和生物形容性好等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)也就意味著其更適合應(yīng)用于生物科學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)方面。

目前碳點(diǎn)的合成方法種類繁多，有激光燒蝕法、電化學(xué)法、水熱法、微波法和熱解法等，而水熱法合成碳點(diǎn)一般產(chǎn)率較高，而且制備工藝簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，是目前采用比較多的一種制備方法。

然而現(xiàn)有的碳點(diǎn)制備方法存在成本高、不環(huán)保或原料難以得到的缺陷，所以發(fā)展簡(jiǎn)單易行、成本低廉，并且不污染環(huán)境的碳點(diǎn)勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種用于熒光影像成像的碳點(diǎn)、制備方法及應(yīng)用，解決了現(xiàn)有的碳點(diǎn)制備方法存在成本高、不環(huán)?；蛟想y以得到的問題。

本發(fā)明提供了一種用于熒光影像成像的碳點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，將4-羥乙基哌嗪乙磺酸、雙氧水和超純水按照2:1:8的質(zhì)量比例混合均勻，得到原料混合物溶液；

步驟2，將所述原料混合物溶液置于高壓反應(yīng)釜中，180℃加熱18-20h，得到反應(yīng)混合物溶液；

步驟3，將反應(yīng)混合物溶液置于透析袋中，其中，透析袋的截留分子量為500da，加入超純水，透析24-28h，然后將透析袋外面的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至除去水分，得到碳點(diǎn)粗油狀液體；

步驟4，將碳點(diǎn)粗油狀液體溶于等同質(zhì)量的甲醇中后，經(jīng)硅膠柱純化，得到純化液，然后將純化液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至除去甲醇，得到純化油狀液體；

步驟5，向步驟4的純化油狀液體中加入甲醇，產(chǎn)生沉淀，然后離心，收集上清液，得到用于熒光影像成像的碳點(diǎn)。

優(yōu)選的，上述用于熒光影像成像的碳點(diǎn)的制備方法中，步驟2中，高壓反應(yīng)釜的壓力小于或等于3mpa。

優(yōu)選的，上述用于熒光影像成像的碳點(diǎn)的制備方法中，步驟4中，硅膠柱純化的具體步驟為：將碳點(diǎn)粗油狀液體溶于等同質(zhì)量的甲醇后，得到粗溶液；然后以甲醇作為展開劑過硅膠柱對(duì)粗溶液進(jìn)行純化，得到純化液，其中硅膠柱中填充的是300目的硅膠，硅膠柱的外直徑為26mm，高度為10cm。

優(yōu)選的，上述用于熒光影像成像的碳點(diǎn)的制備方法中，步驟5中加入的甲醇的體積是步驟3中的反應(yīng)混合物溶液體積的10倍。

優(yōu)選的，上述用于熒光影像成像的碳點(diǎn)的制備方法中，步驟5中離心的條件為4℃，5000g，5min。

本發(fā)明還提供了一種上述制備方法制備而成的用于熒光影像成像的碳點(diǎn)。

本發(fā)明還提供了一種上述碳點(diǎn)在細(xì)胞熒光影像成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種上述碳點(diǎn)作為腦部腫瘤的熒光探針的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的熒光碳點(diǎn)具有以下有益效果：

(1)利用生活中常見的材料，原料成本低廉，合成的工藝簡(jiǎn)單，生物相容性好，可大量制備；

(2)此碳點(diǎn)水溶性好，在水中分散性好，適于用于細(xì)胞熒光影像成像，在生物科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)方面的前景非常廣闊；

(3)碳點(diǎn)本身的發(fā)射波長(zhǎng)隨激發(fā)波長(zhǎng)的紅移而紅移；

(4)現(xiàn)有碳點(diǎn)的尺寸較大，而本發(fā)明的碳點(diǎn)尺寸較小，直徑在2-3nm左右，并且可以輕松透過截留分子量為500da的透析袋，有望突破腦血屏障，作為腦部腫瘤的熒光探針。

附圖說明

圖1為碳點(diǎn)在透射電子顯微鏡下的整體形貌圖；

圖2為碳點(diǎn)粒徑分布的柱狀圖；

圖3為碳點(diǎn)的熒光光譜圖；

圖4為碳點(diǎn)的激發(fā)波長(zhǎng)依賴性測(cè)試圖；

圖5為碳點(diǎn)在酵母細(xì)胞中的熒光影像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對(duì)其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

本發(fā)明提供的一種用于熒光影像成像的碳點(diǎn)，包括以下實(shí)施例：

實(shí)施例1

一種用于熒光影像成像的碳點(diǎn)，具體按照以下步驟制備：

步驟1，將2g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1g的雙氧水和8g的超純水混合均勻，得到原料混合物溶液；

步驟2，將5g原料混合物溶液置于高壓反應(yīng)釜中，高壓反應(yīng)釜的壓力小于或等于3mpa，180℃加熱18h，得到反應(yīng)混合物溶液；

步驟3，將5ml反應(yīng)混合物溶液置于透析袋中，其中，透析袋的截留分子量為500da，加入400ml的超純水，透析24h，然后將透析袋外面的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至除去水分，得到碳點(diǎn)粗油狀液體；

步驟4，將1g碳點(diǎn)粗溶于1g甲醇中后，得到粗溶液；然后以甲醇作為展開劑過硅膠柱對(duì)粗溶液進(jìn)行純化，得到純化液，其中硅膠柱中填充的是300目的硅膠，硅膠柱的外直徑為26mm，高度為10cm；最后將純化液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至除去甲醇，得到純化油狀液體。

步驟5，向步驟4的純化油狀液體中加入50ml甲醇，產(chǎn)生沉淀，然后離心，離心的條件為4℃，5000g，5min，收集上清液，以除去未反應(yīng)的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，得到用于熒光影像成像的碳點(diǎn)，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

一種用于熒光影像成像的碳點(diǎn)，具體按照以下步驟制備：

步驟1，將4g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、2g的雙氧水和16g的超純水混合均勻，得到原料混合物溶液；

步驟2，將5g原料混合物溶液置于高壓反應(yīng)釜中，高壓反應(yīng)釜的壓力小于或等于3mpa，180℃加熱20h，得到反應(yīng)混合物溶液；

步驟3，將5ml反應(yīng)混合物溶液置于透析袋中，其中，透析袋的截留分子量為500da，加入400ml的超純水，透析26h，然后將透析袋外面的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至除去水分，得到碳點(diǎn)粗油狀液體；

步驟4，將1g碳點(diǎn)粗溶于1mg甲醇中后，得到粗溶液；然后以甲醇作為展開劑過硅膠柱對(duì)粗溶液進(jìn)行純化，得到純化液，其中硅膠柱中填充的是300目的硅膠，硅膠柱的外直徑為26mm，高度為10cm；最后將純化液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至除去甲醇，得到純化油狀液體。

步驟5，向步驟4的純化油狀液體中加入50ml甲醇，產(chǎn)生沉淀，然后離心，離心的條件為4℃，5000g，5min，收集上清液，以除去未反應(yīng)的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，得到用于熒光影像成像的碳點(diǎn)，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

需要說明的是，上述本發(fā)明的制備方法及實(shí)施例1-2中，制備的碳點(diǎn)可以直接將液體于4℃保存半年，或者凍干成粉末后-20℃長(zhǎng)期保存。

我們利用透射電子顯微鏡觀察制備而成的碳點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，碳點(diǎn)的形狀均為球形，且碳點(diǎn)在水中分散性好。

測(cè)量不同碳點(diǎn)的顆粒直徑，碳點(diǎn)粒徑分布的柱狀圖如圖2所示，顆粒直徑在1-3nm之間，且2-3nm大小的碳點(diǎn)顆粒占所有碳點(diǎn)顆粒的60％左右，在1-3nm之間，顆粒直徑均一，有望突破腦血屏障。

另外，我們?cè)诩ぐl(fā)波長(zhǎng)為370nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm的條件下，檢測(cè)碳點(diǎn)的熒光特性，結(jié)果如圖3所示，從圖3中可觀察到明顯的峰值，說明激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm的條件下，本發(fā)明的碳點(diǎn)呈現(xiàn)良好的熒光特性。

進(jìn)一步的，我們分別在激發(fā)波長(zhǎng)為320-430nm(激發(fā)波長(zhǎng)間距為10nm)的條件下，測(cè)定碳點(diǎn)的熒光光譜，結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出，同其他碳點(diǎn)一樣，在激發(fā)光為320-430nm的范圍內(nèi)，發(fā)射波長(zhǎng)隨激發(fā)光的紅移而紅移，而且隨著激發(fā)光波長(zhǎng)的紅移，熒光強(qiáng)度先增加后降低，在370nm激發(fā)下熒光強(qiáng)度最大且發(fā)射波長(zhǎng)為460nm。

進(jìn)一步的，為了驗(yàn)證本發(fā)明提供的碳點(diǎn)能夠在細(xì)胞熒光影像成像中的應(yīng)用，我們以酵母細(xì)胞為作用對(duì)象，具體步驟如下：

酵母菌在ypd培養(yǎng)基中30℃孵育17h，od600值調(diào)整到1，取1ml菌液離心收集酵母細(xì)胞，棄去上清，100μlypd培養(yǎng)基重懸酵母細(xì)胞，并加入碳點(diǎn)(碳點(diǎn)的終濃度為0.1mg/ml)，30℃繼續(xù)孵育6h，用pbs緩沖溶液清洗酵母細(xì)胞3次，制樣，得到待檢測(cè)酵母細(xì)胞，測(cè)熒光顯微鏡。

以370nm的紫外光為激發(fā)光，然后在顯微鏡下觀察待檢測(cè)酵母細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和熒光散發(fā)情況，結(jié)果如圖5所示，從圖5我們可以看出，碳點(diǎn)可以成功的轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，并具有顯著的熒光效果，可以用于細(xì)胞影響檢測(cè)。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。