專利名稱：從國產(chǎn)珍珠巖中篩選層析填料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選珍珠巖的方法，特別是涉及從國產(chǎn)珍珠巖中篩選適用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料的方法。
背景技術(shù)：
珍珠巖是火山作用形成的天然珍珠巖，在1100℃高溫下急速膨脹20倍以上形成膨脹珍珠巖的，經(jīng)過獨(dú)特的加工，工藝煅燒，粉碎研磨和風(fēng)選等制造而成。它富含閉口和開口氣孔(如圖2)，具有容重輕、導(dǎo)熱系數(shù)小、無毒、無味、無菌、無臭的膨脹珍珠巖，是一種新型助濾劑。它廣泛用于啤酒、飲料、味精、醫(yī)藥、食用油、石油、化工、污水處理等工業(yè)生產(chǎn)中的液體過濾。如Paracell是世界上最大的助濾劑制造商，格雷夫科公司(Grefco Inc)和日本三號(hào)金屬礦業(yè)株式會(huì)社合作開發(fā)了珍珠巖的產(chǎn)品。我國許多廠家，例如內(nèi)蒙的包頭、赤峰、河南省信陽等，某些生產(chǎn)廠家經(jīng)過多年研究和革新，已使珍珠巖成為世界上一流的產(chǎn)品，是硅藻土理想的替代品。珍珠巖作為助濾劑，已在內(nèi)蒙古啤酒廠和包頭啤酒廠及華北藥業(yè)集團(tuán)等應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于為了節(jié)約外匯，以國產(chǎn)珍珠巖為原料，從中篩選出用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料的方法；提供一種省時(shí)，省力，節(jié)能的從國產(chǎn)珍珠巖中篩選層析填料的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的從國產(chǎn)珍珠巖中篩選用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料的方法，包括以下步驟進(jìn)行篩選(1)首先選擇符合食用檢測指標(biāo)的珍珠巖過篩，獲得粒度在125-250μm的為初篩材料；(2)稱取步驟(1)獲得的初篩材料，加入的蒸餾水，蒸餾水加入量以使珍珠巖充分懸浮起來為準(zhǔn)，之后靜置2-5分鐘，選擇沉降的珍珠巖材料，棄去上部漂浮物；
(3)將步驟(2)獲得的珍珠巖進(jìn)一步裝柱篩選，用一次性注射器的針筒為層析柱(1*5cm)，底部用合成纖維均勻墊好，把蒸餾水懸浮的珍珠巖裝柱，柱床體積為1ml，然后蒸餾水流過珍珠巖的流速大于5-10秒/滴的珍珠巖再一次被棄去，余下的珍珠巖是可以做為分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料。
為了得到更好的用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料，可以對(duì)層析填料，進(jìn)一步篩選還包括步驟(4)在步驟(3)的柱中用4種PH8.0 Tris-Hcl緩沖液(含NaCl)，按順序階段洗脫將取無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)溶液1ml，加到步驟(3)處理好的國產(chǎn)珍珠巖為填料的層析柱中，自然流速，用10ml試管收集流出液，當(dāng)樣品流盡后，把收集的流出液用下述4種PH8.0的Tris-Hcl緩沖液(含NaCl)按順序階段洗脫，用編好號(hào)的試管收集洗脫液，每管收集1ml；所述的4種PH8.0含NaCl的Tris-Hcl緩沖液如下1.25mM Tris-Hcl緩沖液5ml；2.50mM Tris-Hcl緩沖液含0.2M NaCl 5ml3.50mM Tris-Hcl緩沖液含0.6M NaCl 5ml4.50mM Tris-Hcl緩沖液含1.0M NaCl 5ml。
步驟(5)測洗脫液蛋白質(zhì)的紫外吸收A280從步驟(4)中得到的各管收集1ml洗脫液蛋白質(zhì)，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行紫外吸光度測定，該蛋白質(zhì)在280nm處有吸光度A280，記錄讀數(shù)。以A280的數(shù)值為縱坐標(biāo)，收集洗脫液的管號(hào)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，在圖中可以看出分離的效果。對(duì)那些沒有把蛋白質(zhì)分離開的和洗脫時(shí)流速慢的珍珠巖又一次被淘汰。選用洗脫時(shí)流速快、分離效果好的珍珠巖為層析填料，分離結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出，國產(chǎn)珍珠巖分離的無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)有4個(gè)吸收峰。峰1、峰2、峰3、峰4。
還包括進(jìn)行電泳鑒定分離蛋白質(zhì)的純度步驟4中各蛋白吸收峰的洗脫液分別收集于一體，用標(biāo)準(zhǔn)純百日咳蛋白質(zhì)為對(duì)照，所獲得峰1至峰4的樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠鑒定分離蛋白質(zhì)的純度。結(jié)果見圖2，從圖2中可以看出，峰1含69k和一些雜蛋白質(zhì)，峰2、峰3分別是PT和FHA。其中峰2、峰3的蛋白質(zhì)純度達(dá)80％以上，基本不含雜蛋白。峰4是分離的雜蛋白質(zhì)，棄去不要，根據(jù)分離純化的效果和洗脫速度，確定哪種珍珠巖作為層析填料。用電泳鑒定分離蛋白質(zhì)的純度證明蛋白質(zhì)69k，PT和FHA是百日咳蛋白質(zhì)的主要成份，也證明了該方法的可行性和可靠性。
并可做如下分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)1.測血凝活性檢驗(yàn)國產(chǎn)珍珠巖分離純化百日咳蛋白質(zhì)的效果。
2.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠鑒定分離蛋白質(zhì)的純度。
3.根據(jù)分離純化的效果和洗脫速度，確定哪種珍珠巖作為層析填料。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的從國產(chǎn)珍珠巖中篩選出用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)做層析填料的方法，所用原料國產(chǎn)珍珠巖貨源充足，價(jià)格便宜每公斤1.5-3.0元人民幣，在國外每公斤珍珠巖6美元。該方法簡便快速，省時(shí)，省力，節(jié)能。
國產(chǎn)珍珠巖性能穩(wěn)定，用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)做層析填料易操作。


圖1是國產(chǎn)珍珠巖分離純化百日咳蛋白質(zhì)的圖譜圖中峰1.含69k的雜蛋白質(zhì)層析柱流出液；峰2.PT；峰3.FHA；峰4.分離的雜蛋白質(zhì)；圖2珍珠巖分離純化百日咳蛋白質(zhì)的SDS-PAGE中1.層析柱上樣蛋白質(zhì) 2.圖1中峰1樣品3.圖1中峰2樣品4.圖1中峰3樣品 5.標(biāo)準(zhǔn)樣品6.圖1中峰4樣品圖3層析填料國產(chǎn)珍珠巖的電鏡掃描照片(放大500倍的照片)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例2
用實(shí)施例1得到的從國產(chǎn)珍珠巖中篩選出的用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料進(jìn)行分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)將準(zhǔn)備好的無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)溶液1ml，加到實(shí)施例1中處理好的國產(chǎn)珍珠巖為填料層析柱中，自然流速，用10ml試管收集流出液，當(dāng)樣品流盡后，流出液用PH8.0 Tris-Hcl緩沖液(含NaCl)所述的4種緩沖液為按順序階段洗脫，用編好號(hào)的試管收集洗脫液，每管收集1ml，進(jìn)行分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)。可述的緩沖液為1.25mM Tris-Hcl緩沖液5ml2.50mM Tris-Hcl緩沖液含0.2M NaCl 5ml；3.50mM Tris-Hcl緩沖液含0.6M NaCl 5ml；4.50mM Tris-Hcl緩沖液含1.0M NaCl 5ml；
將準(zhǔn)備好的無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)溶液1ml，加到實(shí)施例1中處理好的國產(chǎn)珍珠巖為填料層析柱中，自然流速，用10ml試管收集流出液，當(dāng)樣品流盡后，流出液用PH8.0 Tris-Hcl緩沖液(含NaCl)所述的4種緩沖液為按順序階段洗脫，用編好號(hào)的試管收集洗脫液，每管收集1ml，進(jìn)行分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)。可述的緩沖液為1.25mM Tris-Hcl緩沖液10ml；2.50mM Tris-Hcl緩沖液含0.2M NaCl 5ml；3.50mM Tris-Hcl緩沖液含0.6M NaCl 5ml；4.50mM Tris-Hcl緩沖液含1.0M NaCl 5ml；
權(quán)利要求
1.一種從國產(chǎn)珍珠巖中篩選層析填料的方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行(1)首先選擇符合食用檢測指標(biāo)的珍珠巖過篩，獲得粒度在125-250μm的為初篩材料；(2)稱取步驟(1)獲得的國產(chǎn)珍珠巖初篩材料，加入的蒸餾水，蒸餾水加入量以使珍珠巖充分懸浮起來為準(zhǔn)，之后靜置2-5分鐘，選擇沉降的珍珠巖材料；(3)將步驟(2)獲得的珍珠巖進(jìn)一步裝柱篩選，用一次性注射器的針筒為層析柱，底部用合成纖維均勻墊好，裝入1ml珍珠巖為柱床，裝柱后加入蒸餾水，當(dāng)通過珍珠巖水的流速大于5-10秒/滴的珍珠巖再一次被棄去，余下的是可以做為分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料。
2.按權(quán)利要求1所述的從國產(chǎn)珍珠巖中篩選層析填料的方法，其特征是還包括步驟(4)取無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)溶液1ml，加到步驟(3)處理好的國產(chǎn)珍珠巖為填料層析柱中，自然流速，用10ml試管收集流出液，當(dāng)樣品流盡后，該流出液用PH＝8.0、含NaCl的Tris-Hcl緩沖液按順序階段洗脫。
3.按權(quán)利要求2所述的從國產(chǎn)珍珠巖中篩選層析填料的方法，其特征是所述的4種PH＝8.0、含NaCl的Tris-Hcl緩沖液為(1).25mM Tris-Hcl緩沖液5-10ml洗脫；(2).50mM Tris-Hcl緩沖液含0.2M NaCl 5-10ml；(3).50mM Tris-Hcl緩沖液含0.6M NaCl 5-10ml；(4).50mM Tris-Hcl緩沖液含1.0M NaCl 5-10ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從國產(chǎn)珍珠巖中篩選用于分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料的方法。該方法包括1選擇可食用的珍珠巖過篩，獲得粒度在125－250μm的為初篩材料；2稱取步驟1的初篩材料，加入的蒸餾水，其蒸餾水加入量以使珍珠巖充分懸浮起來為準(zhǔn)，之后靜置2－5分鐘，棄去上部漂浮物；3將步驟2獲得的珍珠巖作填料進(jìn)一步裝柱篩選，用一次性注射器的筒為層析柱，底部用合成纖維均勻墊好，裝入1ml珍珠巖為柱床，裝柱后加入蒸餾水，當(dāng)流速大于5－10秒/滴的珍珠巖再一次被棄去，余下的是可以做為分離純化無細(xì)胞百日咳蛋白質(zhì)的層析填料。該方法所用原料國產(chǎn)珍珠巖貨源充足，價(jià)格便宜；該方法簡便快速，省時(shí)，省力，節(jié)能。
文檔編號(hào)B01J20/10GK1453064SQ02117008
公開日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2002年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月27日
發(fā)明者孫世章, 王立飛, 冠秀芬, 李貴凡 申請(qǐng)人:北京市優(yōu)力凱生物技術(shù)有限責(zé)任公司