專利名稱：用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法。
背景技術：
羊泰勒蟲病(Ovine and caprine theileriosis )是由媒介蝶傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內所引起的疾病的總稱。羊泰勒蟲病最早在1914年發(fā)現于埃及綿羊。我國最早在1958年由楊輔國等報道了四川的羊泰勒蟲病，隨后在青海、甘肅、遼寧、內蒙古、陜西和寧夏等地也有本病流行的報道。最近，在我國湖北、廣東、浙江、貴州、新疆等省也檢測到羊泰勒蟲病原體。本病主要呈地方性流行，發(fā)病率高達36.0%-100%，病死率高達17.8%-75.4%。該病危害嚴重，可引起羔羊和外地引進羊大量死亡，使慢性發(fā)病的山羊和綿羊發(fā)育遲緩，產肉量和產毛量顯著下降，從而給全球養(yǎng)羊業(yè)造成重大經濟損失。羊泰勒蟲裂殖子的分離純化一直是造成許多相關研究停滯不前的重要原因，任何非蟲體來源的物質都有可能對其研究產生嚴重偏差，例如，羊泰勒蟲蛋白質組全譜分析、差異蛋白分析與研究、轉錄組學的相關研究等，這都對羊泰勒蟲的分離純化技術提出了更高的要求。目前，國內外的學者已經建立了一些分離微小寄生蟲的方法，例如，利用纖維素濾膜過濾法純化弓形蟲速殖子(方正明，2010)，雖然能分離到較純凈的蟲體，但回收率太低，且存在濾膜易破、分離量少等缺點。Sugimoto等用溶血素法裂解感染瑟氏泰勒蟲的牛紅細胞，再通過Percoll密度梯度離心來回收牛瑟氏泰勒蟲，雖然可以大量的純化蟲體，但純化產物中往往混有較多雜質，并且蟲體易破損，造成蛋白損失，嚴重影響后續(xù)的實驗進展。利用溶血素從感染紅細胞分離羊泰勒蟲裂殖子(李有全，2007)，雖然純化效果較好，但是工作量大，步驟繁瑣也使得蟲體的大量純化較難進行。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法。本發(fā)明的技術方案如下:—種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱的制備方法，包括以下步驟:(I)抗體的純化:利用protein G層析柱純化血清抗體:將填料與結合緩沖液按照1:1體積比例預混后緩慢裝入層析柱中，待填料充分沉淀后按照流速I ml/min加5 ml結合緩沖液來平衡，將染蟲綿羊血清按照流速I ml/min加入到制好的層析柱中，收集流出液；用30 ml結合緩沖液按照流速2 ml/min過柱,待完全清洗后,用10-15 ml洗脫緩沖液按照流速I ml/min過柱，收集流出液，SDS-PAGE驗證純化效果；用平衡緩沖液平衡柱子，以備下次使用；所述結合緩沖液:20 mmol/L磷酸氫二鈉，0.15 mol/L氯化鈉，pH 8.0 ；所述洗脫緩沖液A:0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5 ；所述平衡緩沖液:Imol/L Tris-HCl, pH 8.5 ；(2)抗體的上樣前處理:用20 ml偶聯緩沖液清洗脫鹽柱，加入3 ml純化的IgG過柱脫鹽，收集流出液，將1/10流出液質量的氧化劑偏高碘酸鈉固體粉末加入到樣品中進行氧化處理，室溫振蕩I h，立即再次進行脫鹽處理；所述脫鹽柱:聚丙酰胺凝膠介質；(3)抗體的偶聯:吸取2 ml Aff1-Gel凝膠至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶聯緩沖液，混合均勻，待凝膠完全沉淀后，移除上清液，重復上述清洗過程；清洗完成后，再次加入5 ml偶聯緩沖液，將其轉移至偶聯柱中；加抗體至偶聯柱中，室溫振蕩偶聯24 h，收集流出液檢測偶聯率；用I倍柱容量的PBS清洗偶聯柱，將偶聯完成的偶聯柱放入4°C保存?zhèn)溆?；所述偶聯緩沖液:100 mmol/L醋酸鈉、100 mmol/L氯化鈉，pH 5.5。應用本發(fā)明的免疫親和層析柱，從鏡檢圖中看出，視野中分散著純化后的羊泰勒蟲裂殖子，無其他雜質存在，且細胞形態(tài)完整獨立，因此本發(fā)明對于羊泰勒蟲裂殖子的純化有較好的效果。


圖1:利用protein G提純IgG后的SDS-PAGE電泳圖；圖2:蟲體純化后1000倍油鏡鏡檢具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。免疫親和層析柱的制備方法:(I)抗體的純化:利用protein G層析柱(購自南京金斯瑞生物科技有限公司)純化血清抗體。將填料與結合緩沖液按照1:1體積比例預混后緩慢裝入層析柱中。待填料充分沉淀后加5 ml結合緩沖液來平衡(流速I ml/min)。將染蟲綿羊血清加入到制好的層析柱中(流速I ml/min),收集流出液。用30 ml結合緩沖液過柱(流速2 ml/min)。待完全清洗后，用10-15 ml洗脫緩沖液過柱(流速I ml/min)收集流出液，SDS-PAGE驗證純化效果。用平衡緩沖液平衡柱子，以備下次使用。結合緩沖液:20 mmol/L磷酸氫二鈉，0.15 mol/L氯化鈉，pH 8.0。洗脫緩沖液A:0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5。平衡緩沖液:Imol/L Tris-HCl, pH 8.5。從附圖1的SDS-PAGE電泳圖中可以看出，純化前，血清樣品中含有較多的雜蛋白，純化后，僅在25KDa (抗體輕鏈)及55KDa (抗體重鏈)處存在蛋白條帶，抗體被很好的提純出來，由此可看出protein G層析柱對于抗體的純化有較好的效果。(2)抗體的上樣前處理
用20 ml偶聯緩沖液清洗脫鹽柱，加入3 ml純化的IgG過柱脫鹽，收集流出液，將1/10流出液質量的氧化劑(偏高碘酸鈉固體粉末)加入到樣品中進行氧化處理。室溫振蕩I h。立即再次進行脫鹽處理。(3)抗體的偶聯:吸取2 ml Aff1-Gel凝膠至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶聯緩沖液，混合均勻，待凝膠完全沉淀后，移除上清液，重復上述清洗過程；清洗完成后，再次加入5 ml偶聯緩沖液，將其轉移至偶聯柱中。加抗體至偶聯柱中，室溫振蕩偶聯24 h，收集流出液檢測偶聯率。用I倍柱容量的PBS (pH 7.0)清洗偶聯柱，將偶聯完成的偶聯柱放入4 °C保存?zhèn)溆谩Ｅ悸撀视嬎愎?(偶聯前抗體量-未偶聯抗體量)/偶聯前抗體量偶聯緩沖液:100 mmol/L醋酸鈉、100 mmol/L氯化鈉，pH 5.5。氧化劑:偏高碘酸鈉固體粉末。脫鹽柱:聚丙酰胺凝膠介質(購自伯樂生物科技公司)。分離純化羊泰勒蟲裂殖子的方法:(I)樣品的前處理將染蟲羊通過頸動脈放血,收集抗凝血?？鼓?000 rpm離心10 min，去除血漿和白細胞層。加等量紅細胞壓積的生理鹽水，PBS或培養(yǎng)液重新懸浮紅細胞。用白細胞濾除器過濾紅細胞，去除所有的白細胞。以3000 rpm離心10 min，棄上清，留紅細胞壓積。按1:4比例向紅細胞壓積中加入含7%甘油的生理鹽水，室溫放置30 min。以3000 rpm離心10 min，棄上清，向壓積中1:4加入生理鹽水，紅細胞即可崩解。以4000 rpm離心10 min,棄沉淀，留上清。將上清液以10000 rpm，4°C離心30 min。盡可能的去除上清后，收集管底的白色沉淀。再以10000 rpm離心10 min反復洗漆3次。(2)裂殖子的純化:將4°C保存的免疫親和層析柱移至室溫環(huán)境，加2 4倍柱容量的緩沖液(pH 7.0PBS)平衡。上樣:用柱容積的I倍體積的PBS pH 7.0平衡柱子(流速I ml/min)。將樣品加入到平衡完成的柱子中(流速I ml/min)。清洗:上樣完成后，用柱容量I倍體積的PBS pH 7.0清洗柱子(流速2 ml/min)。洗脫:用柱容量0.5倍體積的0.1 mol/L醋酸、pH 3.0洗脫緩沖液B (0.1 mol/Lglycine-HCl PH 2.5)洗脫柱子上吸附的蟲體(流速I ml/min)。檢測:將純化樣品濃縮進行吉姆薩染色，1000倍油鏡下鏡檢和評估羊泰勒蟲裂殖子的純化效果。從圖2的鏡檢圖中可以看出，視野中分散著純化后的羊泰勒蟲裂殖子，無其他雜質存在，且細胞形態(tài)完整獨立，由此可看出本發(fā)明對于羊泰勒蟲裂殖子的純化有較好的效果O應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)抗體的純化: 利用protein G層析柱純化血清抗體:將填料與結合緩沖液按照1:1體積比例預混后緩慢裝入層析柱中，待填料充分沉淀后按照流速I ml/min加5 ml結合緩沖液來平衡，將染蟲綿羊血清按照流速I ml/min加入到制好的層析柱中，收集流出液；用30 ml結合緩沖液按照流速2 ml/min過柱,待完全清洗后,用10-15 ml洗脫緩沖液按照流速I ml/min過柱，收集流出液，SDS-PAGE驗證純化效果；用平衡緩沖液平衡柱子，以備下次使用； 所述結合緩沖液:20 mmol/L磷酸氫二鈉,0.15 mol/L氯化鈉，pH 8.0 ； 所述洗脫緩沖液A:0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5 ； 所述平衡緩沖液:I mol/L Tris-HCl，pH 8.5 ； (2)抗體的上樣前處理: 用20 ml偶聯緩沖液清洗脫鹽柱，加入3 ml純化的IgG過柱脫鹽，收集流出液，將1/10流出液質量的氧化劑偏高碘酸鈉固體粉末加入到樣品中進行氧化處理，室溫振蕩I h，立即再次進行脫鹽處理；所述脫鹽柱:聚丙酰胺凝膠介質； (3)抗體的偶聯: 吸取2 ml Aff1-Gel凝膠至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶聯緩沖液，混合均勻，待凝膠完全沉淀后，移除上清液，重復上述清洗過程；清洗完成后，再次加入5 ml偶聯緩沖液，將其轉移至偶聯柱中；加抗體至偶聯柱中，室溫振蕩偶聯24 h，收集流出液檢測偶聯率；用I倍柱容量的PBS清洗偶聯柱，將偶聯完成的偶聯柱放入4°C保存?zhèn)溆?；所述偶聯緩沖液:100 mmol/L醋酸鈉、100 mmol/L氯化鈉，pH 5.5。
2.根據權利要求1所述的制備方法制備得到的用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于分離純化羊泰勒蟲裂殖子的免疫親和層析柱及其制備方法，包括以下步驟(1)抗體的純化；(2)抗體的上樣前處理；(3)抗體的偶聯。應用本發(fā)明的免疫親和層析柱，從鏡檢圖中看出，視野中分散著純化后的羊泰勒蟲裂殖子，無其他雜質存在，且細胞形態(tài)完整獨立，因此本發(fā)明對于羊泰勒蟲裂殖子的純化有較好的效果。
文檔編號B01J20/291GK103143332SQ201310079950
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權日2013年3月13日
發(fā)明者殷宏, 羅建勛, 李有全, 張曉 , 劉志杰, 陳澤, 楊吉飛, 關貴全, 任巧云, 劉愛紅, 牛慶麗, 劉軍龍, 馬米玲, 岑雙慶, 何海寧 申請人:中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所