純化系統(tǒng)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于優(yōu)化從樣品中純化蛋白質(zhì)的自動(dòng)層析系統(tǒng)和用于控制該自動(dòng)系統(tǒng)的軟件。該軟件適于在系統(tǒng)中監(jiān)控來(lái)自檢測(cè)器的信號(hào)、確定兩種信號(hào)參數(shù)以及根據(jù)該兩種信號(hào)參數(shù)的實(shí)際值來(lái)控制系統(tǒng)的組件。
【專(zhuān)利說(shuō)明】純化系統(tǒng)
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00480036887.4(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/EP2004/014074)、申請(qǐng)日為2004年12月10日、發(fā)明名稱(chēng)為“純化系統(tǒng)”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及用于純化生物分子的層析法、系統(tǒng)和軟件。
現(xiàn)有技術(shù)
[0003]層析分離系統(tǒng)通常用于從含有目的蛋白和一種或多種雜質(zhì)的溶液中分離目的蛋白。典型地，層析蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)包括許多各自具有不同性質(zhì)的、使溶液在其中按特殊順序流過(guò)的層析柱。例如，蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)可依次使用下列4種柱型中一些或全部層析柱:親和柱、脫鹽柱、離子交換柱和凝膠過(guò)濾柱?？赏ㄟ^(guò)配備了合適軟件的計(jì)算機(jī)或微處理機(jī)來(lái)控制該系統(tǒng)。
[0004]為了純化含有目的蛋白的樣品，操作者將會(huì)選擇含有配備了特異性地但可逆性地結(jié)合目的蛋白的配體的介質(zhì)的親和柱。在有利于目的蛋白與配體結(jié)合的條件下將含有目的蛋白的樣品加到層析柱。一旦含有目的蛋白的所有樣品流過(guò)介質(zhì)，就從柱洗去了未結(jié)合的物質(zhì)，然后通過(guò)改變流過(guò)柱的緩沖液，例如可中斷目的蛋白和配體之間結(jié)合的高鹽濃度的緩沖液，將目的蛋白從介質(zhì)洗脫到緩沖液中。通過(guò)檢測(cè)器，例如檢測(cè)離開(kāi)柱的洗脫緩沖液中在特定波長(zhǎng)(如280nm或254nm)下UV吸光度變化的UV檢測(cè)器，檢測(cè)從柱上洗脫的緩沖液中存在的目的蛋白，吸光度提供了該在給定的餾分中洗脫的總蛋白的粗略測(cè)量。當(dāng)洗脫柱時(shí)，將流體收集在餾分收集器中。軟件監(jiān)控UV檢測(cè)器的輸出信號(hào)，該輸出信號(hào)可指示包含目的蛋白的蛋白質(zhì)流出柱的時(shí)間，并在存儲(chǔ)器中記錄該時(shí)間對(duì)應(yīng)的餾分。在完全流過(guò)第一個(gè)柱后，操作者檢查UV曲線并手動(dòng)收集含有該蛋白的目的餾分。將手動(dòng)收集的餾分手工匯集，并轉(zhuǎn)入下一個(gè)柱。如果使用高鹽濃度的洗脫緩沖液，那么可以讓含有目的蛋白的洗脫緩沖液通過(guò)流過(guò)脫鹽柱來(lái)將其脫鹽。通過(guò)檢測(cè)器，例如UV檢測(cè)器，監(jiān)控從脫鹽柱輸出的洗脫溶液，并將流出脫鹽柱的、含有目的蛋白的該體積的脫鹽溶液指向餾分收集器。操作者手工匯集目的餾分，并將匯集的餾分轉(zhuǎn)入下一個(gè)柱。該體積的脫鹽溶液仍然含有雜質(zhì)，必須用離子交換柱來(lái)除去它們中的一些。如果那樣，那么操作者使含有目的蛋白的該體積的脫鹽液流過(guò)含有允許結(jié)合目的蛋白的介質(zhì)的離子交換層析柱。一旦將含有目的蛋白的該體積的脫鹽液加到柱上并且目的蛋白可逆地結(jié)合柱介質(zhì)，則洗滌柱以除去未結(jié)合的物質(zhì)。然后通過(guò)改變洗脫條件(其不利于目的蛋白的離子結(jié)合)從介質(zhì)除去包含目的蛋白和可能的一些雜質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)。通過(guò)檢測(cè)器(例如UV檢測(cè)器)監(jiān)控洗脫液流出離子交換柱，并在餾分收集器中收集流出離子交換柱的、含有目的蛋白的該體積的洗脫液。該體積的離子交換溶液仍然含有雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)分子聚集體)，必須使用凝膠過(guò)濾柱來(lái)除去它們中的一些。如果那樣，那么操作者使含有目的蛋白的該體積的離子交換液流過(guò)凝膠過(guò)濾柱。在餾分收集器中收集流出凝膠過(guò)濾柱的濾液。如果在每個(gè)柱中已經(jīng)正確選擇了介質(zhì)和洗脫條件來(lái)促進(jìn)從溶液中分離目的蛋白，那么這時(shí)目的蛋白應(yīng)當(dāng)是在流過(guò)凝膠柱的離子交換液中具有最高濃度的物質(zhì)。
[0005]以上純化蛋白質(zhì)的方法是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。需要操作者頻繁的活動(dòng)，例如評(píng)估每個(gè)柱的結(jié)果，并將洗脫液的餾分從一個(gè)柱移動(dòng)到另一個(gè)柱。
[0006]為了減少這些問(wèn)題，已經(jīng)生產(chǎn)了自動(dòng)系統(tǒng)，其中由計(jì)算機(jī)監(jiān)控檢測(cè)器信號(hào)，并且當(dāng)檢測(cè)器信號(hào)高于某一值(其對(duì)應(yīng)于流過(guò)檢測(cè)器的溶液中高于閾值的蛋白質(zhì)濃度)時(shí)開(kāi)始收集該餾分，以及當(dāng)檢測(cè)器信號(hào)低于某一值(其對(duì)應(yīng)于流過(guò)檢測(cè)器的溶液中低于閾值的蛋白質(zhì)濃度)時(shí)停止收集該餾分。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將軟件配備給被稱(chēng)為“監(jiān)控功能”的監(jiān)控子程序，所述子程序用于當(dāng)UV檢測(cè)器檢測(cè)的吸光度超過(guò)操作者設(shè)定的閾值時(shí)啟動(dòng)某種操作?！半娖礁哂赬I”的監(jiān)控功能引起計(jì)算機(jī)將通過(guò)UV檢測(cè)器的流體轉(zhuǎn)向到餾分收集器的一個(gè)新容器中，并記錄當(dāng)對(duì)應(yīng)于由UV檢測(cè)器檢測(cè)的吸光度電平的檢測(cè)器參數(shù)的信號(hào)通過(guò)值Xl時(shí)，流體正要被轉(zhuǎn)入其中的餾分收集器的序號(hào)。它也啟動(dòng)“電平低于Y1”的監(jiān)控功能?！半娖降陀赮1”監(jiān)控功能引起計(jì)算機(jī)將通過(guò)UV檢測(cè)器的流體從餾分收集器的當(dāng)前容器轉(zhuǎn)向到新(或廢)容器，并且當(dāng)UV檢測(cè)器檢測(cè)的吸光度低于電平Y(jié)l時(shí)重新啟動(dòng)“電平高于XI”的監(jiān)控功能。雖然這些自動(dòng)系統(tǒng)克服了由操作者的錯(cuò)誤引起的一些問(wèn)題，但是計(jì)算機(jī)遵循的啟動(dòng)和停止餾分收集的規(guī)則至今是不完善的。例如，當(dāng)檢測(cè)器信號(hào)高于第一閾值時(shí)開(kāi)始收集并且當(dāng)信號(hào)低于第二閾值時(shí)停止收集的規(guī)則，已經(jīng)不足夠穩(wěn)固來(lái)保證對(duì)所有不同的、其不得不通過(guò)軟件識(shí)別的峰形進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖占?。圖1顯示當(dāng)流出柱時(shí)可產(chǎn)生蛋白質(zhì)的UV吸光度曲線的一些實(shí)例。圖1顯示在A處具有代表流出柱的單一蛋白質(zhì)的單一峰的曲線。圖1顯示在B處由在代表流出柱的兩種相似蛋白質(zhì)的峰之間具有槽或谷的兩個(gè)重疊峰形成的復(fù)合曲線。此處在谷的最低點(diǎn)處檢測(cè)器的電平高于第一峰的半最大值?？善谕占@兩個(gè)峰作為一餾分。圖1顯示在C處，在峰之間由具有更深谷的兩個(gè)重疊峰(其代表流出柱的兩種較少相似的蛋白質(zhì))形成的另一復(fù)合曲線。經(jīng)常期望收集這兩個(gè)峰作為分離的餾分。圖1顯示在D處，由代表兩種相似蛋白質(zhì)的兩個(gè)峰形成的另一復(fù)合曲線，其中第一種蛋白質(zhì)不如第二種蛋白質(zhì)豐富。圖1顯示在E處，峰后是穩(wěn)定的平臺(tái)。經(jīng)常期望收集該峰和平臺(tái)作為分離的餾分。使用“電平大于XI”和“電平小于Y1”的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)問(wèn)題在于分離圖1的B-E所示的峰。
[0007]另外，UV檢測(cè)器的噪聲和不穩(wěn)定性(例如隨時(shí)間的儀表零點(diǎn)漂移)可導(dǎo)致無(wú)意中激活“電平大于Xi ”功能的亂真輸出信號(hào)。
[0008]該穩(wěn)固性的缺乏意味著在從雜質(zhì)中分離目的蛋白期間仍然需要人工干預(yù)。
[0009]發(fā)明概述
[0010]根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)具有權(quán)利要求1的特征餾分中存在的特征的層析系統(tǒng)，可至少解決現(xiàn)有技術(shù)的一些問(wèn)題。用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的軟件具有權(quán)利要求5中提到的特征。
[0011]附圖簡(jiǎn)述
[0012]圖1顯示流出層析柱的蛋白質(zhì)的可能的檢測(cè)器信號(hào)峰形；
[0013]圖2圖解顯示根據(jù)本發(fā)明的層析儀的第一個(gè)實(shí)施方案；
[0014]圖3a_3d顯示使用根據(jù)本發(fā)明的方法，含有蛋白質(zhì)的樣品的洗脫結(jié)果；和，
[0015]圖4用表I顯示層析柱范圍的默認(rèn)參數(shù)值。
[0016]舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案的詳細(xì)描述[0017]圖2圖解顯示根據(jù)本發(fā)明用于純化目的蛋白的自動(dòng)層析系統(tǒng)I的第一個(gè)實(shí)施方案。系統(tǒng)I包括多個(gè)層析柱。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中有5個(gè)柱C1-C5,其中每個(gè)含有不同類(lèi)型的分離介質(zhì)。每個(gè)柱有輸入端和輸出端。在本發(fā)明該實(shí)施方案中，柱Cl和C2，是各自含有裝填了特異性但可逆性結(jié)合目的蛋白的配體的介質(zhì)的親和柱。柱C3是含有適于對(duì)含有目的蛋白的緩沖液進(jìn)行脫鹽的介質(zhì)的脫鹽柱。柱C4是含有允許可逆結(jié)合目的蛋白的介質(zhì)的離子交換柱。柱C5是適于從具有不同分子大小的其它蛋白質(zhì)中分離目的蛋白的凝膠過(guò)濾柱。
[0018]樣品儲(chǔ)存器S1-S4，每個(gè)含有體積的液體樣品(其中目的蛋白在溶液中)，可與計(jì)算機(jī)控制的多路徑輸入閥13連接。另外的儲(chǔ)存器A1-A8、B1和B2，每個(gè)含有緩沖液或洗脫液，也可與輸入閥13連接。輸入閥13是可通過(guò)計(jì)算機(jī)14來(lái)進(jìn)行控制的，以選擇性地指導(dǎo)來(lái)自儲(chǔ)存器S1-S4、A1-A8和B1-B2中任何一個(gè)的流體經(jīng)混合器M、計(jì)算機(jī)控制的多路徑注射閥16以及另外的計(jì)算機(jī)控制的多路徑柱閥17流到柱C1-C5中的任何一個(gè)輸入端。不僅可連接于柱閥17，注射閥16也可連接用于手動(dòng)注射流體的手動(dòng)操作注射器18和循環(huán)閥29。柱C1-C5的輸出端也可連接計(jì)算機(jī)控制的多路徑柱閥17。柱閥17上的輸出端可被連接于檢測(cè)器(例如UV檢測(cè)器19A和/或電導(dǎo)率檢測(cè)器19B)的流體輸入端，使得流出柱C1-C5的液體流過(guò)檢測(cè)器。UV檢測(cè)器19A產(chǎn)生輸出電子信號(hào)，其強(qiáng)度根據(jù)液體吸收的UV光量而變化，并且該信號(hào)被傳遞到計(jì)算機(jī)16。電導(dǎo)率檢測(cè)器19B產(chǎn)生輸出電子信號(hào)，其穿過(guò)液體的強(qiáng)度隨液體的電導(dǎo)率而變化，并且該信號(hào)被傳遞到計(jì)算機(jī)16。流出檢測(cè)器(組)的流體流到計(jì)算機(jī)控制的多路徑輸出閥21。輸出閥21可被連接到注射閥16、廢品儲(chǔ)存器25、餾分收集器27、多個(gè)餾分儲(chǔ)存器F3-FN以及經(jīng)由計(jì)算機(jī)控制的多路徑循環(huán)閥29連接于多個(gè)儲(chǔ)存環(huán)管L1-L5的輸入端。輸出閥21是可通過(guò)計(jì)算機(jī)16控制的，以選擇性地指導(dǎo)流出檢測(cè)器的液體流到注射閥16、餾分儲(chǔ)存器F1-FN、廢品儲(chǔ)存器25以及餾分收集器27中的一個(gè)中。循環(huán)閥是可受計(jì)算機(jī)控制的，以指導(dǎo)進(jìn)入它的液體到多個(gè)環(huán)管L1-L5中的一個(gè)中，或流向廢品儲(chǔ)存器26或回到注射閥16。每個(gè)環(huán)管L1-L5包括一定長(zhǎng)度的管道長(zhǎng)度，使得其內(nèi)部體積介于樣品的體積的1%至100%之間。環(huán)管L1-L5的輸出端被可分別連接到循環(huán)閥29的單個(gè)輸入端。循環(huán)閥29具有可經(jīng)由注射閥16連接于柱閥17的輸出端，并將環(huán)管L1-L5中任一輸出端可控制地連接到柱閥17。餾分收集器27是可移動(dòng)的，并包括固定的輸出管33。在計(jì)算機(jī)16的控制下，餾分收集器27可以被移動(dòng)，使得33位于餾分收集儲(chǔ)存器(如微滴定板37中的孔35)的上方。為了引起系統(tǒng)中的液體流動(dòng)，系統(tǒng)包含泵39，其泵送速率和方向受到計(jì)算機(jī)14的控制。優(yōu)選將泵、閥、柱、環(huán)管、檢測(cè)器和餾分收集器都一起安裝在機(jī)體43 (如虛線所示)中或上以形成單一器件。所述的器件可從Amersham BiosciencesAB, Uppsala,瑞典，商標(biāo)名 AktaXpress? 獲得。
[0019]給計(jì)算機(jī)14裝備了存儲(chǔ)器45，其含有用于控制泵、閥和餾分收集器的操作并且用于處理來(lái)自檢測(cè)器8s(19A、19B)的輸出信號(hào)的軟件。合適的軟件程序可從AmershamBiosciences Ab, Uppsala,瑞典獲得，并稱(chēng)作 Unicorn?5.00 版。
[0020]通過(guò)適當(dāng)?shù)乜刂崎y和泵，上述的配置可從樣品儲(chǔ)存器11中準(zhǔn)確地移取大量液體到該系統(tǒng)任何其它的部件。例如，讓我們假定樣品是包含蛋白質(zhì)混合物的餾分純化的蛋白質(zhì)溶液，其中目的蛋白是最大的組分，剩余餾分是不需要的。我們也可假定操作者知道通過(guò)將樣品溶液按序流過(guò)合適的親和柱、脫鹽柱、離子交換柱和凝膠過(guò)濾柱，來(lái)從雜質(zhì)中分離目的蛋白。在開(kāi)始純化之前，系統(tǒng)操作者將合適的層析柱C1-C5連接于器件43，并將含有目的蛋白的樣品加入樣品儲(chǔ)存器11。通過(guò)選擇將樣品溶液加到層析柱C1-C5上的順序、或設(shè)定可促使程序?qū)嵤┠骋恢噶畹臋z測(cè)器信號(hào)閾值、或選擇由制造商設(shè)定的檢測(cè)器信號(hào)閾值的默認(rèn)設(shè)置，然后操作者設(shè)計(jì)軟件程序以實(shí)施純化。軟件可實(shí)施以下功能:
[0021]挑選被轉(zhuǎn)入下一柱的峰；
[0022]將挑選的峰再注入下一柱中；
[0023]如果檢測(cè)器信號(hào)符合某一條件，則在兩個(gè)分離的餾分中收集一對(duì)重疊峰；和
[0024]如果檢測(cè)器信號(hào)符合某一條件，則將峰和隨后的平臺(tái)分離為含有該峰的餾分和含有該平臺(tái)的第二餾分。
[0025]軟件首先命令閥13將樣品儲(chǔ)存器11經(jīng)注射器閥16連接于柱Cl的輸入口，使得39可以樣品儲(chǔ)存器11吸取含有目的蛋白的樣品溶液到并流過(guò)親和柱Cl。目的蛋白和其它相似的雜質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)合柱Cl中介質(zhì)上的配體，而其它雜質(zhì)流過(guò)柱Cl。經(jīng)輸出閥21將這些雜質(zhì)輸送到儲(chǔ)存器F3-FN中的一個(gè)。一旦樣品溶液被裝載到親和柱Cl上，通過(guò)使來(lái)自儲(chǔ)存器A1-A8、B1-B2的洗液流過(guò)柱，軟件使得未結(jié)合的雜質(zhì)被洗出柱。作為安全的預(yù)防措施，也可將洗液輸送到儲(chǔ)存器F3-FN，使得沒(méi)有物質(zhì)丟失。為了從親和介質(zhì)上釋放結(jié)合蛋白，必須用來(lái)自儲(chǔ)存器A1-A8、B1-B8中的另一個(gè)的梯度洗脫緩沖液洗脫柱Cl，例如含有流過(guò)柱的、預(yù)定濃度的第二組分(如鹽)的緩沖液。該洗脫緩沖液可中斷使目的蛋白結(jié)合親和層析介質(zhì)的鍵，并且目的蛋白被夾帶在洗脫緩沖液中而離開(kāi)柱Cl。輸出的洗脫緩沖液穿過(guò)UV檢測(cè)器19A，設(shè)置后者是為了測(cè)量UV光束穿過(guò)洗脫緩沖液后的強(qiáng)度。UV檢測(cè)器19A產(chǎn)生根據(jù)洗脫緩沖液中UV光吸收物質(zhì)的數(shù)量而變化的檢測(cè)信號(hào)，并將該信號(hào)傳遞到計(jì)算機(jī)14。軟件監(jiān)控和處理檢測(cè)信號(hào)以便識(shí)別兩種信號(hào)參數(shù):當(dāng)前信號(hào)電平和當(dāng)前信號(hào)電平的變化速率(“斜率”)。一旦信號(hào)超過(guò)可指示蛋白質(zhì)在洗脫液體中的存在的“大于”閾值信號(hào)強(qiáng)度，軟件就控制閥21以指導(dǎo)洗脫流體從柱流向第一個(gè)環(huán)管L1-L15。同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。當(dāng)以ml/min表示的泵流速是可通過(guò)計(jì)算機(jī)14控制的并因此是已知的時(shí)，計(jì)算機(jī)14可能計(jì)算流進(jìn)第一個(gè)環(huán)管LI的液體體積。由于已知環(huán)管LI的體積，如果含有目的蛋白的液體體積大于第一個(gè)環(huán)管LI的體積，則計(jì)算機(jī)14可能安排含有目的蛋白的液體從第一個(gè)環(huán)管LI轉(zhuǎn)向第二個(gè)環(huán)管，如L2。一旦信號(hào)降到可指示洗脫流體中蛋白質(zhì)的存在的“低于”閾值信號(hào)強(qiáng)度之下，計(jì)算機(jī)使得閥29將洗脫液體從柱Cl流向廢品儲(chǔ)存器26。它貯存在存儲(chǔ)器45中，其中它已將洗脫緩沖液加入環(huán)管，并將該體積的洗脫緩沖液貯存在環(huán)管中。如果信號(hào)強(qiáng)度再次超過(guò)“大于”閾值信號(hào)強(qiáng)度，則軟件控制閥29來(lái)指導(dǎo)洗脫液體從柱流向另外的環(huán)管，如收集洗脫液體的L3。這連續(xù)到信號(hào)強(qiáng)度再次降到可指示洗脫流體中蛋白質(zhì)的存在的“低于”閾值強(qiáng)度之下，在那時(shí)計(jì)算機(jī)命令閥29使洗脫液體從柱Cl流向廢品儲(chǔ)存器26。在環(huán)管中收集洗脫液體的期間，軟件記錄最高吸光度值和/或進(jìn)行吸光度信號(hào)的積分。吸光度信號(hào)的整合可測(cè)量在該環(huán)管中收集的蛋白質(zhì)總量。計(jì)算機(jī)繼續(xù)將洗脫緩沖液柱泵出Cl，直到預(yù)定體積的洗脫緩沖液已經(jīng)流過(guò)親和柱Cl。在該時(shí)期，環(huán)管L1-L5中的至少一個(gè)含有大量的含目的蛋白的洗脫緩沖液。軟件檢查存儲(chǔ)器，并確定環(huán)管L1-L5中哪一個(gè)含有洗脫緩沖液的最大積分的吸光度信號(hào)或最高吸光度值(可選擇地)。通過(guò)軟件生產(chǎn)商進(jìn)行預(yù)編程序或根據(jù)用戶的選擇或在該軟件記錄的基值上，確定是否去檢查吸光度信號(hào)的最大積分或最高吸光度值的選擇。例如，如果存在具有吸光度信號(hào)基本相同的積分的兩個(gè)環(huán)管，那么軟件可檢查兩個(gè)環(huán)管中哪個(gè)具有最高吸光度值，并選擇該環(huán)管。假設(shè)該環(huán)管(如環(huán)管LI)含有目的蛋白(因?yàn)檫x擇親和介質(zhì)來(lái)結(jié)合目的蛋白)，并且該軟件操縱閥13、17、21和29將環(huán)管LI中該體積的洗脫緩沖液流向脫鹽柱C3。在也含有蛋白質(zhì)的任何其它環(huán)管中的緩沖液也可被儲(chǔ)存于一個(gè)儲(chǔ)存器中，以防結(jié)果是目的蛋白不在含有洗脫緩沖液的吸光度信號(hào)最大積分或最高吸光度值(可選擇地)的環(huán)管中，而在另外的環(huán)管中。將假定含有目的蛋白的脫鹽緩沖液從柱C3輸出到UV檢測(cè)器19A。通過(guò)上述的軟件，使用來(lái)自UV檢測(cè)器的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定脫鹽緩沖液中的蛋白質(zhì)峰通過(guò)UV檢測(cè)器的時(shí)間，并將該體積的脫鹽緩沖液加到一個(gè)或多個(gè)環(huán)管中。一旦已將所有挑選的洗脫緩沖液脫鹽，軟件確定哪個(gè)環(huán)管含有脫鹽的緩沖液的吸光度信號(hào)最大積分或最高吸光度值(可選擇地)，并假定該環(huán)管含有目的蛋白。然后將該環(huán)管(如L3)中該體積的脫鹽緩沖液加到離子交換柱C4。也可將也含有蛋白質(zhì)的任何其它環(huán)管中的緩沖液儲(chǔ)存于一個(gè)儲(chǔ)存器中，以防結(jié)果是目的蛋白不在含有洗脫緩沖液的吸光度信號(hào)最大積分或最高吸光度值(可選擇地)的環(huán)管中，而在另外的環(huán)管中。將含有目的蛋白的離子交換緩沖液從離子交換柱C4輸出到UV檢測(cè)器19A。通過(guò)上述的軟件，使用來(lái)自UV檢測(cè)器的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定離子交換緩沖液中的蛋白質(zhì)峰通過(guò)UV檢測(cè)器19A的時(shí)間，并將該體積的脫鹽緩沖液加到一個(gè)或多個(gè)環(huán)管L1-L2、L4-L5中。一旦來(lái)自環(huán)管的所有體積的脫鹽緩沖液已被離子交換，軟件確定哪個(gè)環(huán)管含有離子交換緩沖液的吸光度信號(hào)最大積分或最高吸光度值(可選擇地)，并假定該環(huán)管(如L4)含有目的蛋白。然后將該環(huán)管(如L4)中該體積的離子交換緩沖液加到凝膠過(guò)濾柱C5。也可將也含有蛋白質(zhì)的任何其它環(huán)管中的緩沖液儲(chǔ)存于一個(gè)儲(chǔ)存器中，以防結(jié)果是目的蛋白不在含有洗脫緩沖液的吸光度信號(hào)最大積分或最高吸光度值(可選擇地)的環(huán)管中，而在另外的環(huán)管中。將含有目的蛋白的過(guò)濾緩沖液從凝膠過(guò)濾交換柱C5輸出到UV檢測(cè)器19A。通過(guò)上述的軟件，使用來(lái)自UV檢測(cè)器19A的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定過(guò)濾緩沖液中的蛋白質(zhì)峰通過(guò)UV檢測(cè)器19A的時(shí)間，并將該體積的凝膠過(guò)濾緩沖液加到餾分收集器27以及將峰收集在一個(gè)或多個(gè)孔35中。然后進(jìn)行測(cè)試，以確保已經(jīng)純化了正確的蛋白質(zhì)。軟件可跟蹤儲(chǔ)存所有峰來(lái)自柱的位置。如果已經(jīng)收集了錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)這是有利的，因?yàn)榭墒褂脙?chǔ)存于其它環(huán)管中的含有峰的流體重新進(jìn)行純化。
[0026]至于“電平大于XI”和“電平小于Y1”的監(jiān)控功能，根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方案的裝置和方法被配備了“斜率大于X2”和“斜率小于Y2”的監(jiān)控功能。當(dāng)UV檢測(cè)器檢測(cè)的吸光度電平以大于X2mAU/min的速率增長(zhǎng)時(shí)，“斜率大于X2”的監(jiān)控功使得軟件將流出UV檢測(cè)器的流體轉(zhuǎn)向新的餾分收集器容器。參數(shù)的變化速率可稱(chēng)作信號(hào)的“斜率”。類(lèi)似地，當(dāng)UV檢測(cè)器檢測(cè)的吸光度電平以小于Y2mAU/min的速率降低時(shí)，“斜率小于Y2 ”的監(jiān)控功使得軟件將流出UV檢測(cè)器的流體轉(zhuǎn)向新的餾分收集器容器?？稍O(shè)計(jì)軟件使其同時(shí)監(jiān)控兩個(gè)監(jiān)控功能，如“電平大于Xl ”和“斜率大于X2”，并僅在激活兩個(gè)功能的條件(即電平大于Xl和斜率大于X2)存在時(shí)采取指令。
[0027]至于前述的監(jiān)控功能，根據(jù)本發(fā)明另外實(shí)施方案的裝置和方法也被配備了 “具有因子Zl的峰最大值”，其中Zl是小于最大峰高I的因子。例如，當(dāng)檢測(cè)器電平低于IOOOmAU時(shí)，如果檢測(cè)峰的最大吸光度電平是2000mAU并設(shè)定Zl在0.5，那么監(jiān)控功能“具有因子Zl的峰最大值”將采取指令。該指令能使流體停止在環(huán)管中儲(chǔ)存和/或指明峰已經(jīng)結(jié)束和/或不得不啟動(dòng)不同的監(jiān)控功能。
[0028]至于前面提到的監(jiān)控功能，根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的裝置和方法也被配備了“谷”和“穩(wěn)定的平臺(tái)”的監(jiān)控功能。在兩個(gè)重疊峰之間形成谷一例如參見(jiàn)圖B和C。在軟件中限定這是當(dāng)檢測(cè)器信號(hào)大于一定電平(如XI)并出現(xiàn)局部最小值(即檢測(cè)的信號(hào)斜率從下降信號(hào)改變?yōu)樯仙盘?hào))時(shí)的事件。圖1在E處顯示穩(wěn)定的平臺(tái)。在軟件中限定這是當(dāng)檢測(cè)器信號(hào)在預(yù)定時(shí)段保持恒定值(具有一定的容許偏差)時(shí)的事件。該軟件可適于同時(shí)尋找三種或多種監(jiān)控功能。
[0029]例如，為了將如圖1在B處所示的兩個(gè)接近的重疊峰儲(chǔ)存在一個(gè)餾分中但為了將如圖1在C處所示的兩個(gè)較少接近的重疊峰儲(chǔ)存在兩個(gè)餾分中，可設(shè)計(jì)軟件來(lái)尋找“電平大于XI”和“斜率大于X2”。一旦電平值和斜率分別高于X1、X2，那么軟件記錄峰起點(diǎn)、使流體轉(zhuǎn)向環(huán)管、啟動(dòng)計(jì)時(shí)器來(lái)測(cè)量環(huán)管的裝注并啟動(dòng)監(jiān)控功能“具有因子0.5的峰最大值”。這引起計(jì)算機(jī)記錄檢測(cè)器的最大電平信號(hào)，并當(dāng)信號(hào)電平降到其最大電平的0.5倍時(shí)可采取進(jìn)一步的指令。該進(jìn)一步的指令可以是尋找“電平小于Y1”、或“谷”或“穩(wěn)定的平臺(tái)”。如果介于峰之間的谷最低值高于如圖1在B處所示的第一個(gè)峰的最大值的0.5倍，那么根據(jù)“具有因子0.5的峰最大值”引起指令的條件僅僅在兩個(gè)峰作為一個(gè)餾分被收集后出現(xiàn)。如果谷的最低值降到第一個(gè)峰的最大值的0.5倍，那么可連續(xù)出現(xiàn)三種不同的事件:
[0030]a)信號(hào)電平繼續(xù)下降直至它低于閾值Yl-這對(duì)應(yīng)如圖1在A處顯示的單一峰。然后該軟件停止在當(dāng)前的環(huán)管中收集流體，發(fā)送隨后的流體到廢品儲(chǔ)存器并復(fù)位“電平大于Xl ”和“斜率大于X2”的監(jiān)控指令；
[0031]b)信號(hào)電平開(kāi)始再激發(fā)對(duì)應(yīng)如圖1在C處所示的重疊峰。然后該軟件停止在當(dāng)前的環(huán)管中收集流體，發(fā)送隨后的流體到新的環(huán)管并復(fù)位“電平大于XI”和“斜率大于X2”的監(jiān)控指令；
[0032]c)信號(hào)保持可指示如圖1在E處所示的平臺(tái)的恒定。然后軟件停止在當(dāng)前環(huán)管中收集流體，發(fā)送隨后的流體到不同的儲(chǔ)存器并激活(“電平大于XI”和“斜率大于X2”)或(“電平小于Y1”和“斜率小于Y2”)監(jiān)控。
[0033]至于前述的監(jiān)控功能，仍根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方案的裝置和方法，也可裝備了一種或多種下列監(jiān)控功能:
[0034](“電平大于XI”或“斜率大于Y1”):如果檢測(cè)器信號(hào)達(dá)到電平或斜率條件的一種，其引起軟件采取指令；
[0035](“斜率小于Y2”和“具有因子Zl的峰最大值”):如果檢測(cè)器信號(hào)變化速率低于Y2監(jiān)控器的單位/分鐘(即mAU/min)并且電平降至最近的峰最大值的規(guī)定的餾分“因子Z1”，其引起軟件采取指令；
[0036](“電平低于X2”和(“斜率低于Y2”和“具有因子Zl的峰最大值”)):如果檢測(cè)器信號(hào)低于電平X2并同時(shí)信號(hào)變化速率低于Y2監(jiān)控器的單位/分鐘以及電平降至最近的峰最大值的規(guī)定的餾分“因子Z1”，其引起軟件采取指令；和
[0037](“電平低于X2”或(“斜率小于Y2”和“具有因子Zl的峰最大值”)):如果檢測(cè)器信號(hào)低于電平X2，或如果信號(hào)變化速率低于Y2監(jiān)控器的單位/分鐘并且電平降至最近的峰最大值的規(guī)定的餾分“因子Z1”，其引起軟件采取行動(dòng)；和，
[0038](“穩(wěn)定的平臺(tái)”或((“斜率低于Y2”和“具有因子Zl的峰最大值”)):如果檢測(cè)器信號(hào)保持在預(yù)定時(shí)段的預(yù)定范圍，或如果信號(hào)變化速率低于Y2監(jiān)控器的單位/分鐘且電平降至最近的峰最大值的規(guī)定的餾分“因子Z1”，其引起軟件采取指令。[0039]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，軟件配備了“開(kāi)業(yè)奇才(set-up wizard)”。該程序允許操作者輸入系統(tǒng)中所用柱的特性，然后根據(jù)軟件和在用戶界面(例如熒光屏)展示的提示，選擇默認(rèn)的監(jiān)控功能或閾值，或輸入它自身的閾值。默認(rèn)值儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中，并是由系統(tǒng)制造商和/或柱制造商已經(jīng)輸入的值。默認(rèn)值是在柱上已經(jīng)被測(cè)試的值和被證實(shí)是令人滿意地分離目的祀蛋白的值。表I顯不來(lái)自Amersham Biosciences,Uppsala,瑞典的、用于 HiLoad Superdex? 凝膠過(guò)濾柱、HiPr印脫鹽柱、RESOURCEQ?、RESOURCE S?、HITrapQ?、HiTrap Sp? 和 Mono Q? 離子交換柱和 HiTrap Chelating?、HisTrap Hp?、GSTrap?親和柱的默認(rèn)值表。提供所述默認(rèn)值可節(jié)省大量的操作時(shí)間，因?yàn)樗苊庑枰僮髡呷?shí)施一系列試驗(yàn)以發(fā)現(xiàn)它自身的最佳閾值電平。在此情況下，操作者希望用它自身的閾值進(jìn)行試驗(yàn)，那么軟件顯示對(duì)用戶建議的默認(rèn)值的事實(shí)，給用戶進(jìn)行試驗(yàn)的基線并減少發(fā)現(xiàn)最佳閾值所需要的試驗(yàn)數(shù)量。
[0040]圖3a_3d顯示使用Unicorn5.00版軟件(其中用戶已使用“開(kāi)業(yè)奇才”來(lái)輸入柱型并已選出使用表I所示的、用于電平和斜率監(jiān)控功能閾值的默認(rèn)值)，大腸桿菌裂解樣品在AktaXpressTM上的4步驟的蛋白質(zhì)純化實(shí)例。革巴蛋白是(His)6標(biāo)記蛋白。使用下列柱:親和柱-HisTrap HP5ml ;脫鹽柱-HiPr印26/10 ;離子交換柱-RESOURCE Q6ml ;凝膠過(guò)濾柱-HiLoadl6/60SuperdeX75制備級(jí)。軟件使用下列監(jiān)控功能:(“電平大于XI”和“斜率大于X2”)、( “電平小于Y1”或“谷”或“穩(wěn)定的平臺(tái)”)，以及使用了用于親和柱的0.2和用于離子交換以及脫鹽柱的0.5的因子(Zl)的“具有因子Zl的峰最大值”。
[0041]在圖3a_3d中，針對(duì)流過(guò)檢測(cè)器的流體ml，將來(lái)自UV檢測(cè)器的信號(hào)和來(lái)自電導(dǎo)率檢測(cè)器的信號(hào)C進(jìn)行標(biāo)繪。圖中由S顯示峰起點(diǎn)和由E顯示峰終點(diǎn)。將樣品加到親和柱，首先將親和峰A(圖3b中更詳細(xì)地顯示)收集在環(huán)管中并稍后加到脫鹽柱。將從脫鹽柱洗脫的峰D (圖3b中更詳細(xì)地顯示)收集在環(huán)管中，并稍后加到離子交換柱。將從離子交換柱洗脫的峰1(圖3c中更詳細(xì)地顯示)收集在環(huán)管中，并稍后加到凝膠過(guò)濾柱。將從凝膠過(guò)濾柱洗脫的峰G (圖3d中更詳細(xì)地顯示)收集在餾分收集器的孔A1-A7中。
[0042]當(dāng)通過(guò)系統(tǒng)實(shí)例(其中用到一種運(yùn)行UniCornTM5.00版軟件的計(jì)算機(jī)來(lái)在一種
件上純化一種蛋白質(zhì))舉例說(shuō)明本發(fā)明時(shí)，可以設(shè)想使用相同的計(jì)算機(jī)
和Unicorn?5.00版軟件來(lái)同時(shí)控制多個(gè)AktaXpress?器件并在每個(gè)AktaXpress?
器件上純化多種蛋白質(zhì)。
[0043]上述實(shí)施方案用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，并且不用于限制由所附的權(quán)利要求所要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于純化蛋白質(zhì)的自動(dòng)層析系統(tǒng)(I)，包括 -多個(gè)層析柱(Cl - C5)， -能容納樣品液體的至少一個(gè)樣品儲(chǔ)存器(S1-S4)，其中目的蛋白在溶液中，所述樣品儲(chǔ)存器能連接至所述柱， -多個(gè)由計(jì)算機(jī)控制的閥(13、16、17、21)， -泵(39)，-能產(chǎn)生輸出信號(hào)的檢測(cè)器(19A、19B)，所述輸出信號(hào)表示流過(guò)檢測(cè)器的流體的組成，-計(jì)算機(jī)(14)，所述計(jì)算機(jī)配備了并且適于運(yùn)行用于控制所述閥(13、16、17、21)、泵(39)和檢測(cè)器(19A、19B)的軟件，以便指導(dǎo)來(lái)自樣品儲(chǔ)存器的流體流到所述柱中的任何一個(gè)，并且使得離開(kāi)柱的液體通過(guò)檢測(cè)器和所述計(jì)算機(jī)，所述計(jì)算機(jī)適于接受來(lái)自檢測(cè)器的表示流體組成的信號(hào)，和 -至少一個(gè)環(huán)管(L1-L5)，流體在通過(guò)一個(gè)柱之后可以被儲(chǔ)存在其中，并且所述被儲(chǔ)存的流體可以被引導(dǎo)回到另一個(gè)柱，隨后用于進(jìn)一步的純化， 其特征在于所述軟件能處理所述檢測(cè)器(19A、19B)的輸出信號(hào)來(lái)鑒定兩種信號(hào)參數(shù)，所述兩種信號(hào)參數(shù)是信號(hào)電平和信號(hào)電平的變化速率，并且其中當(dāng)滿足用于所述信號(hào)參數(shù)中的一種或兩種參數(shù)的預(yù)定條件，從而將目的蛋白儲(chǔ)存在所述至少一個(gè)環(huán)管時(shí)，所述軟件適于控制所述系統(tǒng)，以開(kāi)始或停止所述流體在所述至少一個(gè)環(huán)管中的儲(chǔ)存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自動(dòng)層析系統(tǒng)，其特征在于所述軟件適于當(dāng)同時(shí)滿足用于所述兩種信號(hào)參數(shù)的預(yù)定條件時(shí)，運(yùn)行預(yù)定的指令。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自動(dòng)層析系統(tǒng)，其特征在于所述軟件適于當(dāng)滿足用于所述兩種信號(hào)參數(shù)中一種的預(yù)定條件時(shí)，運(yùn)行預(yù)定的指令。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的自動(dòng)層析系統(tǒng)，其特征在于用于所述兩種信號(hào)參數(shù)的所述預(yù)定條件是默認(rèn)的條件或操作者選擇的條件。
5.一種用于控制用于純化蛋白質(zhì)的自動(dòng)層析系統(tǒng)(I)的軟件，所述層析系統(tǒng)包括: -多個(gè)層析柱(Cl - C5)， -能容納樣品液體的至少一個(gè)樣品儲(chǔ)存器(S1-S4)，其中目的蛋白在溶液中，所述樣品儲(chǔ)存器能連接至所述柱， -多個(gè)由計(jì)算機(jī)控制的閥(13、16、17、21)， -泵(39)， -能產(chǎn)生輸出信號(hào)的檢測(cè)器(19A、19B)，所述輸出信號(hào)表示流過(guò)檢測(cè)器的流體的組成， -計(jì)算機(jī)(14)，所述計(jì)算機(jī)配備了并且適于運(yùn)行用于控制所述閥(13、16、17、21)、泵(39)和檢測(cè)器(19A、19B)的軟件，以便指導(dǎo)來(lái)自樣品儲(chǔ)存器的流體流到所述柱中的任何一個(gè)，并且使得離開(kāi)柱的液體通過(guò)檢測(cè)器，和 -至少一個(gè)環(huán)管(L1-L5)，流體在通過(guò)一個(gè)柱之后可以被儲(chǔ)存在其中，并且所述被儲(chǔ)存的流體可以被引導(dǎo)回到另一個(gè)柱，隨后用于進(jìn)一步的純化， 其特征在于所述計(jì)算機(jī)適于接受來(lái)自檢測(cè)器的表示流體組成的信號(hào)，并且適于處理所述檢測(cè)器(19A、19B)的輸出信號(hào)來(lái)鑒定兩種信號(hào)參數(shù)，所述兩種信號(hào)參數(shù)是信號(hào)電平和所述信號(hào)電平的變化速率，并且其中當(dāng)滿足用于所述信號(hào)參數(shù)中的一種或兩種參數(shù)的預(yù)定條件，從而將目的蛋白儲(chǔ)存在所述至少一個(gè)環(huán)管時(shí)，所述軟件適于控制所述系統(tǒng)，以開(kāi)始或停止所述流體在所述至少一個(gè)環(huán)管中的儲(chǔ)存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的軟件，其特征在于所述軟件適于當(dāng)同時(shí)滿足用于所述兩種信號(hào)參數(shù)的預(yù)定條件時(shí)，運(yùn)行預(yù)定的指令。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的軟件，其特征在于所述軟件適于當(dāng)滿足用于所述兩種信號(hào)參數(shù)中一種的預(yù)定條件時(shí)，運(yùn)行預(yù)定的指令。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的軟件，其特征在于所述軟件適于允許操作者選擇用于所述兩種信號(hào)參數(shù)的默 認(rèn)預(yù)定條件或輸入操作者選擇的預(yù)定條件。
【文檔編號(hào)】B01D15/08GK103604896SQ201310361958
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2003年12月12日
【發(fā)明者】E.隆布拉德, L.赫德奎斯特, H.松奎斯特, M.戈林, T.普萊斯, J.西蒙 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司