本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種用于清除血漿致病抗體的免疫吸附劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力等)的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫耐受丟失后，異常存在的自身抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物密切相關(guān)。免疫吸附療法是近年發(fā)展起來(lái)的特異性清除體內(nèi)致病抗體和免疫復(fù)合物，用于輔助緩解疾病癥狀和控制病情進(jìn)程的治療手段。

目前臨床應(yīng)用免疫吸附劑均采用生物親和高分子材料固載吸附功能基合成免疫吸附材料，利用功能基的特性實(shí)現(xiàn)對(duì)致病抗體的吸附。如固載蛋白a和抗igg抗體的蛋白類(lèi)功能基，由于其優(yōu)良的生物親和性，在臨床應(yīng)用中較為廣泛，immunosorba(fresenius,germany)和ig-therasorb(miltenyi，germany)是目前臨床應(yīng)用較多的蛋白類(lèi)功能基免疫吸附劑，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)研究(中國(guó)專(zhuān)利：200610035470.7)，這類(lèi)吸附劑由于功能基與抗體之間較強(qiáng)的親和識(shí)別能力，在臨床應(yīng)用中用于去除自身抗體，治療相關(guān)自身免疫性疾病。但是由于這類(lèi)吸附劑采用生物活性蛋白質(zhì)為功能基，其在產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)和使用過(guò)程中存在無(wú)法忽視的缺陷，如在產(chǎn)品合成、保存過(guò)程中功能基容易變性失活，同時(shí)存在難以滅菌和功能基易脫落、容易引發(fā)免疫反應(yīng)的問(wèn)題，且蛋白質(zhì)類(lèi)功能基生產(chǎn)成本高，純化過(guò)程復(fù)雜。另一類(lèi)應(yīng)用較多的是固載疏水氨基酸為功能基的吸附劑，如immusorbaph和tr(asahi，janpan)為臨床應(yīng)用較多的以苯丙氨酸和色氨酸為功能基的吸附劑，國(guó)內(nèi)專(zhuān)利(201210023961.5)也有相關(guān)研究，此類(lèi)采用小分子化合物為功能基的吸附劑，優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜；但是由于電荷和疏水作用的相互制約，以及環(huán)氧活化密度和空間位阻的限制，導(dǎo)致其吸附容量較低，治療效果有限。

目前市場(chǎng)上還沒(méi)有通過(guò)高密度偶聯(lián)小分子功能基，實(shí)現(xiàn)抗體快速吸附-洗脫，可以反復(fù)利用的醫(yī)用吸附劑。現(xiàn)有的兩種吸附劑：蛋白類(lèi)功能基雖然可以通過(guò)反復(fù)再生實(shí)現(xiàn)致病抗體的大量去除，但是蛋白偶聯(lián)取向復(fù)雜，且蛋白不同功能區(qū)對(duì)抗體親和力不同，使其在應(yīng)用過(guò)程中難以針對(duì)不同類(lèi)型致病抗體實(shí)現(xiàn)全面去除；氨基酸類(lèi)功能基吸附劑合成簡(jiǎn)單，但是與抗體親和力有限，同時(shí)利用環(huán)氧活化固載配給密度較低，分子偶聯(lián)柔性不夠，導(dǎo)致吸附容量較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于清除血漿致病抗體的免疫吸附劑及其制備方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于清除血漿致病抗體的免疫吸附劑，其多羥基吸附載體上通過(guò)間隔臂高密度偶聯(lián)有小分子功能配基，所述小分子功能配基的偶聯(lián)密度為160～180μmol/g濕態(tài)載體。

具體地，本發(fā)明利用共價(jià)偶聯(lián)的方式將小分子功能配基接枝于吸附載體材料上，活化方式為高密度活化，同時(shí)利用偶聯(lián)間隔臂以實(shí)現(xiàn)小分子功能配基的柔性連接，增加小分子功能配基在吸附過(guò)程中的自由度和鏈的柔性，可以使小分子功能配基和致病抗體快速結(jié)合，減少整個(gè)吸附載體的空間位阻，提高功能配基穩(wěn)定性、吸附容量和選擇性。

作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述小分子功能配基為2-巰基-1-甲基咪唑；所述間隔臂選自3,3-二氨基二丙基胺或己二胺。

作為上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述多羥基吸附載體選自瓊脂糖凝膠、纖維素凝膠、聚乙烯醇凝膠中的其中一種。具體地，本發(fā)明要求所述吸附載體材料具有良好的機(jī)械性能，耐受有機(jī)溶劑清洗，耐受滅菌條件。本發(fā)明中所述多羥基吸附載體的粒徑范圍為45～180μm，截留分子量為150000～4000000。

一種如上所述的用于清除血漿致病抗體的免疫吸附劑的制備方法，其包括如下步驟：

通過(guò)羰基二咪唑或溴化氰高密度活化處理多羥基吸附載體；

固載間隔臂分子；

間隔臂分子末端基團(tuán)上固載小分子功能配基；

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述通過(guò)羰基二咪唑高密度活化處理多羥基吸附載體過(guò)程中，先加入與多羥基吸附載體等質(zhì)量體積的無(wú)水丙酮，懸漿攪拌均勻，再稱(chēng)取羰基二咪唑加入反應(yīng)體系中，通過(guò)調(diào)節(jié)羰基二咪唑的用量在0.05～0.1g/g多羥基吸附載體之間，活化處理時(shí)間為2h。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述通過(guò)溴化氰高密度活化處理多羥基吸附載體過(guò)程中，先加入與多羥基吸附載體等體積的碳酸鈉溶液，懸漿攪拌均勻，再按體積比為溴化氰：乙腈＝1:0.5配制好溴化氰的乙腈溶液，并緩慢滴加到反應(yīng)容器中，至溴化氰與多羥基吸附載體的質(zhì)量比為0.05～0.1之間，停止滴加，室溫?cái)嚢?～5min。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述間隔臂分子為3,3-二氨基二丙基胺或己二胺。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述小分子功能配基為2-巰基-1-甲基咪唑。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用非氨基酸類(lèi)的、對(duì)自身抗體和免疫復(fù)合物有較好選擇性和較高吸附容量的小分子化合物，通過(guò)高密度活化和利用間隔臂克服疏水氨基酸功能配基吸附容量低、不能再生重復(fù)利用的缺點(diǎn)。同時(shí)，利用抗體類(lèi)物質(zhì)的親硫作用原理，在合成過(guò)程中利用生成的硫醚鍵，進(jìn)一步增加該免疫吸附劑對(duì)致病抗體的吸附容量。本發(fā)明所述制備的免疫吸附劑可以一次性使用也可以再生多次使用。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1～4試樣igg濃度與吸附時(shí)間的關(guān)系；

圖2為實(shí)施例1～4試樣重復(fù)使用性能測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，以便于所屬技術(shù)領(lǐng)域的人員對(duì)本發(fā)明的理解。有必要在此特別指出的是，實(shí)施例只是用于對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出的非本質(zhì)性的改進(jìn)和調(diào)整，應(yīng)仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。同時(shí)下述所提及的原料未詳細(xì)說(shuō)明的，均為市售產(chǎn)品；未詳細(xì)提及的工藝步驟或制備方法為均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的工藝步驟或制備方法。

本發(fā)明所述的免疫吸附劑可按如下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)對(duì)多羥基吸附載體的活化處理

a、采用羰基二咪唑(cdi)活化

將多羥基吸附載體用丙酮清洗干凈，待多羥基吸附載體中水分完全置換干凈后，用砂芯漏斗抽干，稱(chēng)取一定質(zhì)量的多羥基吸附載體置于圓底燒瓶中，按質(zhì)量體積比1:1加入無(wú)水丙酮，懸漿攪拌均勻；稱(chēng)取羰基二咪唑加入反應(yīng)體系中，通過(guò)調(diào)節(jié)cdi的用量在0.05～0.1g/g多羥基吸附載體之間，活化2h，反應(yīng)完成后用丙酮清洗干凈未反應(yīng)的活化劑；

b、采用溴化氰活化多羥基吸附載體

稱(chēng)取一定量的多羥基吸附載體于通風(fēng)櫥中，用2mol/l的碳酸鈉溶液清洗多羥基吸附載體后用砂芯漏斗抽干，置于圓底燒瓶中，將體積比1:1稱(chēng)量加入2mol/l的碳酸鈉溶液，懸漿攪拌均勻，將配制好的溴化氰的乙腈溶液(溴化氰：乙腈＝1:0.5)，緩慢滴加到反應(yīng)容器中，至溴化氰與多羥基吸附載體的質(zhì)量比為0.05～0.1之間，停止滴加；室溫?cái)嚢?～5min，用冷水清洗活化后凝膠，去除殘留活化劑和乙腈。

(2)以3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)或己二胺為間隔臂

a、無(wú)水環(huán)境cdi活化的多羥基吸附載體清洗干凈后，按質(zhì)量體積比1:1加入無(wú)水丙酮，懸漿攪拌均勻，以0.2g/ml多羥基吸附載體的比例加入間隔臂分子，在丙酮環(huán)境中攪拌反應(yīng)3h；

b、水溶液中溴化氰活化的多羥基吸附載體以0.2g/ml多羥基吸附載體的比例加入間隔臂分子，在ph8.5、0.1mol/l的碳酸鈉緩沖液中反應(yīng)3h；

(3)將間隔臂末端氨基與溴乙酸反應(yīng)

利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽實(shí)現(xiàn)溴乙酸和末端氨基的縮合反應(yīng)，獲得末端溴乙?；鶊F(tuán)。用ph4.5mes緩沖液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為終濃度10mg/ml的溶液，將上述連接間隔臂的交聯(lián)瓊脂糖凝膠按體積比1:1，懸浮于反應(yīng)液中，以0.1g/g載體的比例加入溴乙酸，攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)完成后依次用ph4.5mes緩沖液、水、1mol/lnacl和水清多羥基吸附載體；

(4)偶聯(lián)mmi

配制0.1g/ml的mmi水溶液，避光條件下，將載體材料按1:1的比例加入到mmi水溶液中，懸漿攪拌4h。利用末端溴乙?；鶊F(tuán)與mmi巰基反應(yīng)，將功能基固載于載體上。

實(shí)施例1

(1)羰基二咪唑活化交聯(lián)瓊脂糖凝膠

在100ml丙酮溶液中，加入5g羰基二咪唑溶解完全后，攪拌下加入50g交聯(lián)瓊脂糖凝膠，攪拌懸浮載體，反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后用丙酮充分清洗。

(2)連接間隔臂

10g的3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)溶于100ml丙酮中，加入活化后交聯(lián)瓊脂糖凝膠50g，攪拌反應(yīng)3h。

(3)偶聯(lián)2-巰基-1-甲基咪唑

用ph4.5的mes緩沖液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為終濃度10mg/ml，加入5g溴乙酸，將上述連接間隔臂的交聯(lián)瓊脂糖凝膠懸浮于反應(yīng)液中，反應(yīng)4h；注射水清洗干凈后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，攪拌反應(yīng)4h，注射水清洗干凈。

實(shí)施例2

(1)羰基二咪唑活化交聯(lián)瓊脂糖凝膠

在100ml丙酮溶液中，加入10g羰基二咪唑溶解完全后，攪拌下加入50g交聯(lián)瓊脂糖凝膠，攪拌懸浮載體，反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后用丙酮充分清洗。

(2)連接間隔臂

10g的3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)溶于100ml丙酮中，加入活化后交聯(lián)瓊脂糖凝膠50g，攪拌反應(yīng)3h。

(3)偶聯(lián)2-巰基-1-甲基咪唑

用ph4.5的mes緩沖液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為終濃度10mg/ml，加入5g溴乙酸，將上述連接間隔臂的交聯(lián)瓊脂糖凝膠懸浮于反應(yīng)液中，反應(yīng)4h；注射水清洗干凈后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，攪拌反應(yīng)4h，注射水清洗干凈。

實(shí)施例3

(1)溴化氰活化交聯(lián)瓊脂糖凝膠

用2mol/l的碳酸鈉溶液清洗載體后抽干，將50ml載體以體積比1:1懸浮于2mol/l的碳酸鈉溶液中，加入溴化氰的乙腈溶液，(溴化氰：乙腈＝1:0.5)，室溫?cái)嚢?～5min，用冷水清洗活化后凝膠。

(2)連接間隔臂

10g的3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)溶于100ml丙酮中，加入活化后交聯(lián)瓊脂糖凝膠50g，攪拌反應(yīng)3h。

(3)偶聯(lián)2-巰基-1-甲基咪唑

用ph的4.5mes緩沖液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為終濃度10mg/ml，加入5g溴乙酸，將上述連接間隔臂的交聯(lián)瓊脂糖凝膠懸浮于反應(yīng)液中，反應(yīng)4h；注射水清洗干凈后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，攪拌反應(yīng)4h，注射水清洗干凈。

實(shí)施例4

(1)溴化氰活化交聯(lián)瓊脂糖凝膠

用2mol/l的碳酸鈉溶液清洗載體后抽干，將50ml載體以體積比1:1懸浮于2mol/l的碳酸鈉溶液中，加入溴化氰的乙腈溶液，(溴化氰：乙腈＝1:0.5)，室溫?cái)嚢?～5min，用冷水清洗活化后凝膠。

(2)連接間隔臂

10g己二胺溶于100ml丙酮中，加入活化后交聯(lián)瓊脂糖凝膠50g，攪拌反應(yīng)3h。

(3)偶聯(lián)2-巰基-1-甲基咪唑

用ph4.5的mes緩沖液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為終濃度10mg/ml，加入5g溴乙酸，將上述連接間隔臂的交聯(lián)瓊脂糖凝膠懸浮于反應(yīng)液中，反應(yīng)4h；注射水清洗干凈后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，攪拌反應(yīng)4h，注射水清洗干凈。

實(shí)施例5：血漿igg的快速吸附測(cè)試

分別取上述實(shí)施例1～4所制得的免疫吸附劑3g，加入30ml血漿中，搖床振蕩吸附(37℃，100±10rpm)，分別于吸附開(kāi)始后10min、20min、30min、60min和120min取樣檢測(cè)igg濃度，結(jié)果附圖1。由附圖1測(cè)試結(jié)果可以看出，本發(fā)明制備得的免疫吸附劑在與血漿接觸吸附30min即可達(dá)到吸附平衡，吸附速度快。

實(shí)施例6：靜態(tài)吸附免疫球蛋白g(igg)試驗(yàn)

分別取上述實(shí)施例1～4所制得的免疫吸附劑3g，加入30ml血漿中，搖床振蕩吸附30min(37℃，100±10rpm)，檢測(cè)血漿igg濃度，計(jì)算吸附劑對(duì)其清除率。

表1免疫吸附劑對(duì)免疫球蛋白g的清除率

由表1數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明制備得的免疫吸附劑均對(duì)igg有高容量吸附，去除效果明顯，活化率提高吸附量增加。

實(shí)施例7：靜態(tài)吸附類(lèi)風(fēng)濕因子(rf)試驗(yàn)

分別取4份類(lèi)風(fēng)濕因子超標(biāo)的人血漿樣品30ml，加入上述實(shí)施例1～4所制得的免疫吸附劑3g，搖床振蕩吸附30min(37℃，100±10rpm)，檢測(cè)吸附前后血漿rf含量變化。

表2靜態(tài)吸附類(lèi)風(fēng)濕因子(rf)試驗(yàn)

由表2試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備得的免疫吸附劑對(duì)類(lèi)風(fēng)濕因子具有高效吸附能力。

實(shí)施例8：靜態(tài)吸附抗核抗體(ana)試驗(yàn)

分別取4份抗核抗體滴度超標(biāo)的人血漿樣品30ml，加入上述實(shí)施例1～4所制得的免疫吸附劑3g，搖床振蕩吸附30min(37℃，100±10rpm)，檢測(cè)吸附前后血漿抗核抗體滴度含量變化。

表3靜態(tài)吸附抗核抗體(ana)試驗(yàn)

由表3數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明制備得的免疫吸附劑對(duì)血漿抗核抗體吸附效果明顯。

實(shí)施例9：吸附劑重復(fù)使用性能

分別取上述實(shí)施例1～4所制得的免疫吸附劑3g，加入30ml血漿中，搖床振蕩吸附30min(37℃，100±10rpm)，取樣檢測(cè)血漿igg濃度，然后離心上述吸附劑，棄去上清，按體積比1:1加入ph2.3檸檬酸緩沖液(含0.9％nacl)，振蕩5～10min，抽濾，重復(fù)上述操作3次后用生理鹽水清洗吸附劑，至ph為中性，抽干；加入30ml血漿中，搖床振蕩吸附2h(37℃，100±10rpm)，取樣檢測(cè)血漿igg濃度。如此反復(fù)吸附—解吸6次，考察吸附劑再生使用性能，結(jié)果如附圖2所示，其結(jié)果表明本發(fā)明所制備得的免疫吸附劑在重復(fù)使用6次吸附性能下降較少，平均下降2.0％，可以重復(fù)再生使用。

實(shí)施例10：吸附劑滅菌后吸附性能測(cè)試

分別取上述實(shí)施例1～4所制得的免疫吸附劑3g，加入30ml注射水，密封；高壓蒸汽滅菌(121℃，60min)，清洗干凈，抽干；加入30ml血漿搖床振蕩吸附30min(37℃，100±10rpm)，取樣檢測(cè)igg濃度，與實(shí)施例6結(jié)果對(duì)比如下表4：

表4吸附劑滅菌后吸附性能測(cè)試

由表4數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明制備得的免疫吸附劑可以耐受高壓蒸汽滅菌，保持吸附能力。

上述實(shí)施例為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，凡與本發(fā)明類(lèi)似的工藝及所作的等效變化，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范疇。