本發(fā)明屬于芯片，涉及微珠芯片的制備，具體涉及一種微珠芯片的絲桿入孔式制備方法。

背景技術(shù)：

1、芯片檢測(cè)作為一種成本低、通量大、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方法已成為大規(guī)模分析的有力檢測(cè)工具，為遺傳學(xué)研究分析、個(gè)體化醫(yī)療及農(nóng)業(yè)育種等領(lǐng)域研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障?；蛐酒苽渲胁牧系墓潭ǚ绞街饕ㄔ缓铣煞?、點(diǎn)樣法以及微球裝載法等，其中微球裝載法是制備高密度基因檢測(cè)芯片成本最低、最高效的方法。通常的制備方法是以硅基板作為基體，表面有數(shù)十萬(wàn)、數(shù)百萬(wàn)甚至上億的小孔，每個(gè)小孔用來(lái)固定一個(gè)微球，微球表面共價(jià)偶聯(lián)用于檢測(cè)的核酸探針。

2、微球在硅基板上的裝載是基因芯片制備的關(guān)鍵步驟。通常將數(shù)十萬(wàn)種修飾有不同核酸探針的微球按比例混合均勻，之后隨機(jī)裝載在硅基板的小孔中。如何提高微球的裝載率，并且適合大規(guī)模生產(chǎn)是生物芯片生產(chǎn)制造過(guò)程的重難點(diǎn)之一。

3、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行了諸多有益探索，如專利號(hào)為cn112723303a的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種通過(guò)旋涂方式制備微珠芯片的方法；專利號(hào)為cn111282604a的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種利用起泡劑產(chǎn)生的氣泡，規(guī)范已經(jīng)進(jìn)入生物化學(xué)芯片的微球的范圍制備生物芯片的方法；專利號(hào)為cn112725417a的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種采用電鍍方式制備微珠芯片的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行，對(duì)微珠芯片的制備方法繼續(xù)進(jìn)行探索，提供了一種微珠芯片的絲桿入孔式制備方法，通過(guò)絲桿涂布方式實(shí)現(xiàn)微球在硅板微孔中的順利掉落。

2、本發(fā)明提供的微珠芯片的絲桿入孔式制備方法的主體方案如下：在涂布機(jī)的涂布臺(tái)上設(shè)置硅片限定裝置，然后借助涂布機(jī)絲桿的來(lái)回移動(dòng)，對(duì)微球施加外力，將其推入硅片微孔內(nèi)。

3、本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

4、本發(fā)明的第一方面，提供了一種微珠芯片的絲桿入孔式制備方法，包括如下步驟：

5、a、二氧化硅微球裝載

6、將固體二氧化硅微球注入含分散劑的緩沖液中，經(jīng)過(guò)震蕩分散配制成濃度為5mg/ml～50mg/ml的單分散二氧化硅微球溶液；

7、b、微球入孔

8、將一定數(shù)量的帶有微孔的單晶硅板放在涂布機(jī)的涂布臺(tái)上，并在其上添加微球溶液，開(kāi)啟涂布機(jī)，通過(guò)涂布機(jī)上的絲桿運(yùn)動(dòng)，將二氧化硅微球進(jìn)行分散，并掉入到硅板的微孔中；涂布完成后，清洗硅板除去表面多余的二氧化硅微球及緩沖液，得到微珠芯片。

9、該兩個(gè)步驟的優(yōu)選技術(shù)方案如下：

10、一、步驟a：

11、(1)固體二氧化硅微球?yàn)楣矁r(jià)結(jié)合寡核苷酸鏈的二氧化硅微球，其制備方法包括以下步驟a-c：

12、a.二氧化硅微球表面修飾氨基

13、將粒徑為500nm～5um(優(yōu)選3um)的二氧化硅微球(cv<5.0％)配制成10mg/ml～200mg/ml的二甲苯懸浮液；加入硅烷化試劑(3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷)，硅烷化試劑在混合液中的體積濃度為10％以下，充分反應(yīng)，使二氧化硅微球表面修飾上氨基；

14、b.激活二氧化硅微球

15、將步驟a獲得的表面修飾上氨基的二氧化硅微球懸浮在乙腈中，微球的質(zhì)量濃度為10mg/ml～200mg/ml；加入二異丙基乙胺和三聚氰氯，搖晃反應(yīng)；用乙腈清洗去除多余反應(yīng)物，再讓二氧化硅微球懸浮在硼酸鈉緩沖液中，調(diào)ph值至7.5～8.5；

16、c.二氧化硅微球共價(jià)連接寡核苷酸鏈

17、將100nmol待連接的寡核苷酸鏈干粉用2m的氯化鈉溶液溶解，與步驟b獲得的二氧化硅微球硼酸鈉懸浮液混合，其中二氧化硅微球含量為10～100mg，震蕩反應(yīng)5～8小時(shí)后進(jìn)行1000～3000rpm離心處理，保留上清液；清洗、干燥。

18、(2)含分散劑的緩沖液中優(yōu)選含有聚合物，包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯氨酰、及其混合物等。

19、(3)將固體二氧化硅微球注入含分散劑的緩沖液后，震蕩分散條件為30min、2500rpm。

20、二、步驟b

21、(1)關(guān)于帶有微孔的單晶硅板

22、制備方式屬于現(xiàn)有技術(shù)，通過(guò)蝕刻方式在單晶硅板上設(shè)置規(guī)定深度的微孔，如：將光刻膠均勻旋涂到單晶硅板表面致使形成一層均勻的薄膜，利用光刻機(jī)將掩膜板上的圖案轉(zhuǎn)移到光刻膠上，在光刻膠鏤空的部分用等離子蝕刻技術(shù)在硅板表面蝕刻出密集排列的直徑與二氧化硅微球近似的小孔，小孔的深度約為1μm～2μm，利用化學(xué)溶劑將單晶硅板表面的光刻膠去除。并用大量去離子水清洗硅板表面3次，得到含規(guī)則排布的小孔的硅板。

23、(2)關(guān)于涂布機(jī)

24、涂布機(jī)結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有技術(shù)中涂布機(jī)類似，為了實(shí)現(xiàn)硅片限定，防止其被絲桿拉偏位置。本發(fā)明在涂布臺(tái)上設(shè)置有多個(gè)硅片放置框架，每個(gè)框架內(nèi)均勻設(shè)置有多個(gè)硅片框，硅片框的厚度低于硅片的厚度，以方便涂布操作。

25、優(yōu)選的，硅片放置框架個(gè)數(shù)為5個(gè)，每個(gè)框架內(nèi)均勻設(shè)置有12個(gè)硅片框，硅片框的厚度低于硅片的厚度約0.2mm。具體的，涂布臺(tái)上可放置75mm*25mm的芯片數(shù)量為12個(gè)、24個(gè)、36、48個(gè)、60個(gè)。

26、(3)關(guān)于分散涂布操作

27、將絲桿固定在涂布機(jī)上，將硅板逐一放在自制的涂布機(jī)模塊上，將涂布機(jī)模塊放在夾子里旋緊兩端固定，放下把手將刮刀落下，將二氧化硅微珠溶液加入到涂布機(jī)模塊上。旋轉(zhuǎn)微調(diào)器，使刮刀下降到底(聽(tīng)到咔咔聲)，按微分頭上zero鍵設(shè)置零點(diǎn)，置零后反方向旋轉(zhuǎn)微調(diào)器設(shè)定涂布厚度。開(kāi)機(jī)點(diǎn)擊屏幕任意處，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)界面。點(diǎn)擊“設(shè)置速度”后方輸入框，點(diǎn)擊數(shù)字輸入試驗(yàn)需要的速度，按“確定”鍵保存。將涂布的液體置于刮刀前，點(diǎn)擊屏幕“開(kāi)始”按鍵。涂布完成后，提起刮刀起落把手，點(diǎn)擊“復(fù)位”，清潔刮刀，取出涂布機(jī)模塊，將硅板逐一取出，使用buffer和水清洗，得到一組裝載二氧化硅微球的硅板。

28、工藝參數(shù)方面，每個(gè)硅片放置框架內(nèi)滴入二氧化硅微球溶液5000ul～50000ul；進(jìn)行二氧化硅微球分散時(shí)，涂布機(jī)的涂布速度為2-180mm/s，涂布機(jī)絲桿規(guī)格精度0.003mm，有效涂布寬度30cm，涂布厚度為2-10μm。

29、涂布機(jī)涂布區(qū)域?yàn)?0cm寬，40cm長(zhǎng)。

30、結(jié)果顯示，采用本發(fā)明的絲桿入孔式使微珠的入孔率達(dá)到97.6％～99.6％，可單次實(shí)現(xiàn)60片硅板鋪入，適宜大規(guī)模制備微珠芯片。

31、本發(fā)明第二方面，提供了一種微珠芯片，采用上述第一方面所述的方法制備得到。

32、本發(fā)明的第三方面，提供一種如上所述的微珠芯片在制備生物芯片中的應(yīng)用。

33、發(fā)明的作用與效果

34、效果方面，采用本發(fā)明的絲桿入孔式使微珠的入孔率達(dá)到97.6％～99.6％。

35、生產(chǎn)效率方面，本發(fā)明可單次實(shí)現(xiàn)60片硅板的鋪入，大大提升了微珠芯片微球入孔的生產(chǎn)效率。

36、投入成本方面，本發(fā)明通過(guò)對(duì)現(xiàn)有涂布機(jī)進(jìn)行芯片限定位置改進(jìn)，即可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)操作和技術(shù)效果，生產(chǎn)投入成本低，有助于進(jìn)行工業(yè)化推廣。