專利名稱：：細胞外cAMP依賴的蛋白激酶-ECPKA的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及細胞外cAMP依賴的蛋白激酶(ECPKA)作為細胞外癌癥檢測或治療監(jiān)測的蛋白質(zhì)標(biāo)記的應(yīng)用。背景枝術(shù)據(jù)統(tǒng)計，我國每年新增腫瘤患者160萬至170萬人，其中肺癌、肝癌、胃癌、食管癌和結(jié)直腸癌占新發(fā)病例的50%以上。《2005年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒》顯示，2004年間我國醫(yī)院病人常見病醫(yī)療費用中，用于惡性腫瘤的治療費用達24.51億元，幾乎相當(dāng)于腦血管病、缺血性心臟病和高血壓治療費用的總和(26.17億元)。癌癥給患者、家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。為了提高癌癥診斷和治療監(jiān)控的水平，尋找癌癥生物標(biāo)記物迫在眉睫。一些血清生物標(biāo)記物，包括癌胚抗原(CEA)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、異常DNA或RNA、神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、癌癥抗原(如CA125)和細胞角蛋白片段(如CYFRA21-1)等，已經(jīng)被用于評估癌癥診斷、預(yù)后、進展和治療效果。其中，最著名的是PSA(前列腺特異性抗原)。PSA是一種雄激素調(diào)節(jié)的絲氨酸蛋白酶，在正常和癌變的前列腺組織中均有表達。早在20世紀(jì)90年代，PSA就被列為前列腺癌生物標(biāo)記。但是，這些分子中沒有一種對于癌癥病人和正常人樣本有良好的特異性或敏感性，其缺點主要是它們也在正常組織中表達，或者由于病人不同或日間差別而使這些分子的濃度變化多樣。cAMP依賴的蛋白激酶(PKA)涉及許多細胞過程，如細胞增殖、基因誘導(dǎo)、代謝、血管發(fā)生、離子通道調(diào)控和細胞凋亡。因此，PKA與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展及對冶療的應(yīng)答密切相關(guān)。例如，福斯考林(forskolin)激活的PKA能直接激活雄激素受體，而不需要雄激素刺激。雄激素受體的異常激活導(dǎo)致前列腺腫瘤更加惡化和更難治療，且不再依賴雄激素。PKA由兩個不同的催化亞基(C)和兩個調(diào)節(jié)亞基(R)構(gòu)成。已經(jīng)證實，PKA存在3種催化亞基Ca、C卩和CY。調(diào)節(jié)亞基則有四種不同形式，分別為Rla、R陽、RIIa和RIIp。RII亞基在正常的、非增生組織中優(yōu)先表達，并能抑制細胞生長；RI亞基則能刺激細胞生長，并參與癌癥進程。例如，RIamRNA高表達的卵巢癌病人通常臨床分期增高且預(yù)后更差，對順鉑(cisplatin)治療的反應(yīng)降低。PKARIa在許多人類癌組織和細胞系中(包括乳腺癌、盲腸癌、肺癌和卵巢癌)存在過表達。另外，研究顯示Rla與細胞色素c氧化酶的vb亞基有相互作用，而后者涉及許多抗藥性的產(chǎn)生過程。由于在多種癌癥中存在過表達及其在癌癥發(fā)展中的重要角色，PKA己經(jīng)被提議作為癌癥治療的新型分子靶標(biāo)。但是由于該蛋白是一種胞內(nèi)蛋白，因此作為標(biāo)記物用于各種人類癌癥檢測時難度較大。
發(fā)明內(nèi)容本申請的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，在正常人的血清中，檢測不到或僅含有極微量的細胞外cAMP依賴的蛋白激酶(即ECPKA),但是，在癌癥患者中，普遍存在ECPKA表達水平很高的情況。經(jīng)常在腫瘤細胞中過表達的PKAI能促進ECPKA的分泌，乳腺癌、胰腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌等多種細胞均能分泌ECPKA，多種癌癥病人的血清ECPKA活性均比正常人有所升高。血清中的ECPKA能持續(xù)保持活性，但不能被額外加入的cAMP進一步激活，因此，可以將ECPKA作為蛋白質(zhì)標(biāo)記，通過檢測人體血清中的ECPKA的表達情況來進行癌癥的診斷，或者在癌癥治療的過程中通過監(jiān)測ECPKA的活性來進行治療監(jiān)測。因此，本發(fā)明的首要目的就在于提供一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA作為細胞外癌癥檢測的蛋白質(zhì)標(biāo)記的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA作為細胞外癌癥治療監(jiān)測的蛋白質(zhì)標(biāo)記的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施例中，分別測定了374例正常人血清樣品以及229例確診為癌癥患者的血清樣品中的ECPKA活性,結(jié)果顯示，癌癥病人血清中的ECPKA活性均值為10.98U/mL，是正常人血清ECPKA活性均值2.15U/mL的5.1倍。在癌癥病人血清中ECPKA活性升高，因此可用作檢測癌癥的蛋白質(zhì)標(biāo)記，這些癌癥包括胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、食道癌、肝癌和胰腺癌。在本發(fā)明的另一個實施例中，對乳腺癌、胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌七種癌癥患者的血清樣品使用統(tǒng)計分析軟件SPSS(社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包，SPSSInc.公司產(chǎn)品)做Logistic回歸分析，用哈斯默-賴默斯(Hosmer-Lemeshow)適合度檢驗來測試模型的適合程度，結(jié)果顯示，對于患胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、胃癌或肝癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于肺癌的病人，血清ECPKA為4U/mL的檢測點是最好的；對于乳腺癌的病人，血清ECPKA為2U/mL的檢測點是最好的。無論單獨使用還是聯(lián)合其他方法，ECPKA均可以在診斷和治療監(jiān)測多種癌癥中起到重要作用。聯(lián)合其他標(biāo)記物，或與成像技術(shù)如CT掃描聯(lián)用，能進一步提高ECPKA的效用?？傊?，ECPKA在檢測不同類型的癌癥中均有重要價值，且可以作為檢測和治療監(jiān)測的一個重要標(biāo)志物。圖1顯示了健康志愿者和癌癥病人中ECPKA的人群分布情況，其中A代表所有病人中ECPKA活性的頻率;B代表男性病人中ECPKA活性的頻率;C代表女性病人中ECPKA活性的頻率。圖2顯示了健康志愿者和癌癥病人中LDH的人群分布情況，其中A代表所有病人中LDH活性的頻率；B代表男性病人中LDH活性的頻率；C代表女性病人中LDH活性的頻率。正常的LDH水平在55和170U/L之間。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1、1.1、正常人血清樣品ECPKA活性測定取正常人血清樣品共374例(血清樣品的具體信息見表1所示)，根據(jù)已報道的高敏放射性檢驗方法(PharmacTher1993;60:265-288.)開展ECPKA的放射性分析，具體方法如下使用的試劑盒為AUSAcAMP-DependentProteinKinaseAssayKit(Catalog#1132)，按說明書操作，樣品與cAMP結(jié)合后，再與y32P-ATP和生物素化的多肽(Kemptide)組成的特異性PKA底物反應(yīng)。于30'C作用IO分鐘后，終止反應(yīng)并進行超濾離心，未結(jié)合的Y32P-ATP可通過超濾膜。用液閃儀(LS6000TA，Beckman;Irvine,CA)測量純化后的32P-多肽產(chǎn)物，按說明書計算PKA活性。一個ECPKA活性單位定義為30°C，1分鐘內(nèi)將1pmol32P從y32P-ATP轉(zhuǎn)移到回收蛋白上的酶量。線性范圍為0-250U/mL，日內(nèi)和日間變化小于5%。測定結(jié)果如表l和圖l所示。表l、不同年齡和性別的正常人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取確診為胃癌患者的血清樣品共45例(血清樣品的具體信息見表2所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結(jié)果如表2所示。表2、胃癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.3、肺癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診肺癌患者的血清樣品共63例(血清樣品的具體信息見表3所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l),測定結(jié)果如表3所示。表3、肺癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1.4、乳腺癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診乳腺癌患者的血清樣品共30例(血清樣品的具體信息見表4所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結(jié)果如表4所示。表4、乳腺癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.44(2.07)1.5、結(jié)腸癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診結(jié)腸癌患者的血清樣品共29例(血清樣品的具體信息見表5所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結(jié)果如表5所示。表5、結(jié)腸癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.6、食道癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診食道癌患者的血清樣品共24例(血清樣品的具體信息見表6所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結(jié)果如表6所示。表6、食道癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.7、肝癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診肝癌患者的血清樣品共28例(血清樣品的具體信息見表7所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l),測定結(jié)果如表7所示。表7、肝癌病人樣本中ECPKA活性男性女性總數(shù)年齡樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)20-00000030-19.020019.0240-1319.11(4.54)10.191417.76(4.41)50-727.76(13.87)20.44(0.29)921.69(11.33)60-32.43(1.59)0032.43(1.59)70-11.590011.59總數(shù)2518.43(4.67)30.36(0.19)2816.49(4.29)1.8、胰腺癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診胰腺癌患者的血清樣品共10例(血清樣品的具體信息見表8所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結(jié)果如表8所示。表8、胰腺癌病人樣本中ECPKA活性男性女性總數(shù)年齡樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)20-00000030-00000040-13.850013.8550-0012.1512.1560-412.88(7.01)24.62(0.12)610.12(4.76)70-0020.20(0.20)20.20(0.20)總數(shù)511.07(5.72)52.36(0.99)106.71(3.10)將表2到表8的各種癌癥患者的血清樣品ECPKA活性數(shù)據(jù)匯總，結(jié)果如表9所示;同時以表9的數(shù)據(jù)作圖，得到圖l所示的ECPKA人群分布情況圖。表9、不同年齡和性別的癌病人樣本中ECPKA活性年齡男性女性總數(shù)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)20-120.6511.48211.06(9.59)30-98.57(5.20)87.08(2.19)177.87(2.86)40-3217.10(3.47)1710.18(2.89)4914.70(2.50)50-3713.08(3.84)199.32(3.24)5611.80(2.75)60-4111.12(1.99)156.16(1.85)569.79(1.56)70-328.36(235)179.50(3.05)498.76(1.85)總數(shù)15212.20(1.40)778.60(0.74)22910.98(1.05)由表1—表9和圖1A的結(jié)果可見，雖然個體間ECPKA的活性水平有所差異，但在癌癥病人血清中ECPKA水平顯著高于正常人群，與健康對照相比，各種癌癥病人的血清ECPKA活性一致升高。癌癥病人血清中的ECPKA活性均值為10.98U/mL，是正常人2.15U/mL的5.1倍。另外從圖1B和圖1C可以看出，男性和女性血清樣本中，ECPKA無顯著性差異，說明性別不是影響血清ECPKA水平的因素。實施例2、作為質(zhì)量控制手段，乳酸脫氫酶(LDH)的活性水平與溶血、樣品制備以及保存有關(guān)，本實施例對實施例1中所使用的血清樣品的LDH的活性水平進行了定量。2.1、取實施例1的正常人血清樣品(共374例)，用LactateDehydrogenase(LD-L)kit測定LDH的活性水平，具體測定方法如下用LactateDehydrogenase(LD-L)kit(procedure#228-uv)(SigmaDiagnosticsInc.;St.Louis，MO)試劑盒，檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性。按說明書操作，在準(zhǔn)備好LDH試劑后，加入樣品，30'C放置30秒，30秒后立即記錄340nm處的吸光值。為了確定1分鐘內(nèi)的吸光值變化，3(TC放置60秒后，再次讀取340nrn的吸光值。按說明書計算LDB活性，日內(nèi)和日間變化小于5%。測定結(jié)果如表10所示。表10、不同年齡和性別的正常人樣本中LDH活性年齡男性女性總數(shù)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)20-4077.23(4.76)4380.43(4.40)8378.91(3.22)30-4174.44(4.16)4277.89(5.28)8376.18(3.36)40-4181.68(4.49)297637(5.76)7079.48(3.54)50-3978.86(4.96)3483.70(3.68)7381.12(3.15)60-2077.65(5.72)1284.96(4.45)3280.39(3.95)70-2184.24(6.61)1099.59(14.23)3390.44(6.20)V-必/r總數(shù)20278.65(2.02)17281.55(2.29)37479.99(1.52)2.2、取實施例1的癌癥患者的血清樣品(共229例)，用LactateDehydrogenase(LD-L)kit測定LDH的活性水平(具體方法同2.1)，測定結(jié)果如表ll。表11、不同年齡和性別的癌癥病人樣本中LDH的活性年齡男性女性總數(shù)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)樣本數(shù)平均值(SE)20-1158.67157.392108.03(50.64)30-9103.53(16.17)883.13(9.99)1793.93(9.81)40-32100.38(7.68)1785.49(10.25)4995.22(6.17)50-3785.50(9.40)1978.54(10.77)5683.13(7.16)60-4188.09(6.22)1596.89(11.58)5690.44(5.48)70-3283.08(8.46)1784.30(15.05)4983.50(7.51)總數(shù)15290.40(3.90)7785.12(3.10)22988.61(3.13)根據(jù)表10和11的結(jié)果作圖，得到圖2所示的LDH人群分布情況圖。由圖2A、表10和表11結(jié)果可見，LDH活性在正常人和癌癥病人中不存在顯著的差異。使用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0(社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包，SPSSInc.公司產(chǎn)品)做Logistic回歸分析顯示，低LDH活性的樣本中ECPKA的分布與正常LDH水平的樣本中ECPKA的分布相近，說明樣本的制備和保存過程未影響LDH水平。另外從圖2B和圖2C可以看出LDH在男性和女性中的水平有微小區(qū)別，但無統(tǒng)計學(xué)差異。實施例3、ECPKA作為生物標(biāo)記物的統(tǒng)計學(xué)分析為了確定ECPKA作為細胞外癌癥檢測的蛋白質(zhì)標(biāo)記的最佳數(shù)值范圍，用不同的ECPKA活性水平確定其表達對癌癥發(fā)生的預(yù)測值，本實施例對實施例1的癌癥患者的血清樣品(共229例)進行分析，選取的檢測點分別為l、2、4、8禾niOU/mL，用靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值PPV值和陰性預(yù)測值NPV值來計算每個檢測點的ECPKA水平，測定結(jié)果如表13所示。首先對靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值(PPV值)和陰性預(yù)測值(NPV值)做出如下解釋靈敏度是檢測出確定癌癥樣本的陽性概率；特異性是檢測出確定未患癌癥樣本的陰性試驗的概率；陽性預(yù)測值PPV值是給定陽性試驗中癌癥實際存在概率；陰性預(yù)測值NPV值是給定陰性試驗中無癌癥的概率。表12、評價一個實驗真實性的資料歸納表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以表12中所舉數(shù)據(jù)為例，靈敏度、特異性、PPV值和NPV值的計算公式如下:靈敏度za/(a+c)X100%特異度-d/(b+d)X100%陽性預(yù)測值(PPV)=a/(a+b)X100%陰性預(yù)測值(NPV)=d/(c+d)X100%表13、不同ECPKA檢測點的敏感度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表13的結(jié)果顯示，以統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果作為確定檢測點的依據(jù)，在一定的可信區(qū)間內(nèi)，兼顧特異性和敏感性，當(dāng)選擇ECPKA活性值10U/mL作為檢測點時，對陽性和陰性的預(yù)測值比低濃度更準(zhǔn)確。對靈敏度、特異性、PPV值和NPV值分析發(fā)現(xiàn)，28U/mL的檢測點能預(yù)測各種癌癥。如果選取8U/mL做為檢測點，對各種癌癥的檢測靈敏度為37%，特異性為95%，陽性預(yù)測值PPV為81%,陰性預(yù)測值NPV為71%。實施例4、ECPKA作為生物標(biāo)記物的Logistic回歸分析本實施例對實施例1所述乳腺癌、胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌七種癌癥患者的血清樣品使用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0(社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包，SPSSInc.公司產(chǎn)品)做Logistic回歸分析，用哈斯默-賴默斯(Hosmer-Lemeshow)適合度檢驗來測試模型的適合程度，結(jié)果見表14A和14B所示。表14A、所有樣本的Logistic回歸分析s*PKA指示物優(yōu)勢比95%可信區(qū)間#值22<25.83.9~8.7<0扁124<47.24.7~11.0<0細128<89.35.216.6<0扁1*回歸模型中其他變量性別、年齡#對于優(yōu)勢比的可信區(qū)間表14B、特定癌癥和對照樣本的Logistic回歸分析*iiX~~指示物優(yōu)勢比95%可信區(qū)間#值3.1~15.9〈0.00013.5~14.7O細l4.9~25.3<0扁13.3~13<0.00014.1~14.3<0細13.4~15.4O扁l2.0~12.10.00041.6~8.80,00210.58.60.32891.811.2O細l3.0~16.3O.00014.6~31.5〈0.00011.4~9.30.00661.5~8.70.00433.2~23.7<0扁12.0~12.10.00054.4~27.5O.000110.567.9<0.00013.60.9~14.40.07403.71.0~13.70.04894.10.8~22.20.0999*:Logistic回歸模型中其他變量性別、年齡。由于特異性腫瘤的樣本數(shù)很小，在Logistic回歸中使用連續(xù)的"年齡"，而非前面表格中使用的"年齡組"。#:對于優(yōu)勢比的可信區(qū)間。(樣本數(shù)=45)22<224<428<87.07.211.1肺癌(樣本數(shù)=63)22<224<428<86.57.77.3乳腺癌(樣本數(shù)=30)22<224<4》8<85.03.82.0結(jié)腸癌(樣本數(shù)=29)22<224<428<84.57.012.0食道癌(樣本數(shù)=24)22<224<428<83.63.68.7肝癌(樣本數(shù)=28)2228<2<4<84.911.126.7胰腺癌(樣本數(shù)-io)2228<2<4<8根據(jù)表14B的結(jié)果，選取具備最佳"優(yōu)勢比"和"95%可信區(qū)間"時所對應(yīng)的PKA活性值，作為最佳活性檢測點，具體結(jié)果如下-對于患胃癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患肺癌的病人，血清ECPKA為4U/mL的檢測點是最好的；對于患乳腺癌的病人，血清ECPKA為2U/mL的檢測點是最好的；對于患結(jié)腸癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患食道癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患肝癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患胰腺癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的。綜上所述，癌癥病人血清中的ECPKA活性均值遠高于正常人血清ECPKA活性均值，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，因此血清中的ECPKA可作為各種細胞外癌癥檢測或治療監(jiān)測的蛋白質(zhì)標(biāo)記，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。權(quán)利要求1、一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA的應(yīng)用，其特征在于，用作細胞外癌癥檢測的蛋白質(zhì)標(biāo)記。2、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細胞外癌癥檢測是檢測血清中ECPKA的活性是否過高。3、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測采用高敏放射性檢驗方法。4、如權(quán)利要求13中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥包括胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、食道癌、肝癌和胰腺癌。5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、胃癌或肝癌的血清ECPKA活性檢測點為8U/mL;肺癌的血清ECPKA活性檢測點為4U/mL;乳腺癌的血清ECPKA活性檢測點為2U/mL。6、一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA的應(yīng)用，其特征在于，用作細胞外癌癥治療監(jiān)測的蛋白質(zhì)標(biāo)記。7、如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療監(jiān)測是監(jiān)測血清中ECPKA的活性水平。8、如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述監(jiān)測采用高敏放射性檢驗方法。9、如權(quán)利要求68所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥包括胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、食道癌、肝癌和胰腺癌。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用細胞外cAMP依賴的蛋白激酶(ECPKA)作為人類細胞外癌癥檢測或治療監(jiān)測的標(biāo)記物的應(yīng)用。在正常人的血清中，檢測不到或僅含極微量的ECPKA，而大部分癌癥病人的血清中ECPKA的表達水平卻很高，因此，血清ECPKA可作為人類各種癌癥的標(biāo)記物，用于癌癥的檢測或監(jiān)控病人對治療的反應(yīng)。文檔編號G01N33/52GK101201351SQ20061014736公開日2008年6月18日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者張瑞穩(wěn),慧王申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院