專利名稱：一種早期乳腺癌血清診斷試劑及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種早期乳腺癌血清診斷試劑及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。研究顯示，乳腺癌發(fā)病率占婦科腫瘤的31%，死亡率在腫瘤中居第二位，且近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率有升高趨勢(shì)，已成為威脅我國(guó)女性健康的首要惡性腫瘤。乳腺癌目前雖無(wú)特殊的預(yù)防措施，但是它屬于一種早期易治易控的腫瘤，若能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，預(yù)后情況一般比較好。臨床上，部分乳腺癌因早期發(fā)現(xiàn)而取得了理想的治療療效，但大部分患者因發(fā)現(xiàn)較晚錯(cuò)失了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，當(dāng)前以及將來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，爭(zhēng)取早期診斷將是乳腺癌防治的一項(xiàng)基本策略。診斷早期乳腺癌的方式，在診斷發(fā)現(xiàn)方面主要是自查異常(如乳腺自查等)或醫(yī)院體檢(如采用乳腺鉬靶X線攝影、乳腺彩色多譜勒超聲檢查、乳腺導(dǎo)管內(nèi)視鏡檢查、乳腺導(dǎo)管灌洗、CT和磁共振等，若有無(wú)法辨別的腫塊或膿腫可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)穿刺檢查)，在確診方面則為病理組織檢查。但在臨床中存在如下缺陷一、目前的自查異常或醫(yī)院體檢，在診斷的早期性提示方面仍顯滯后，特別是對(duì)于那些由于腫塊較小、或者浸潤(rùn)較輕、成膨脹性生長(zhǎng)、 表現(xiàn)為光滑、活動(dòng)、邊界清楚，與良性腫瘤不易區(qū)別的早期乳腺癌患者，漏檢率較高，或者當(dāng)診斷發(fā)現(xiàn)時(shí)已過(guò)了最佳的早期治療時(shí)機(jī)；二、由于涉及社會(huì)文化倫理等方面問(wèn)題，一些年輕女性對(duì)于乳腺檢查容易忽視或產(chǎn)生抗拒心理，上述的醫(yī)院體檢方法對(duì)處于早期階段的乳腺癌患者，特別是年輕患者的診斷能力更為有限；三、病理學(xué)檢查雖是腫瘤確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”， 但非手術(shù)患者作病理學(xué)檢查存在取材所致的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)等原因，因此不被普遍應(yīng)用。目前，隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于就乳腺癌方面的體檢和未確診者，大多作外周血乳腺癌相關(guān)指標(biāo)的檢查，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便可行，但仍存在如下缺點(diǎn)一、現(xiàn)有指標(biāo)在早期的表達(dá)是微量的，且敏感性和特異性低，故檢出率偏低；二、現(xiàn)有指標(biāo)在臨床診斷中相對(duì)不穩(wěn)定，使部分患者錯(cuò)過(guò)早期診斷機(jī)會(huì)。另外，術(shù)后患者的療效監(jiān)察和復(fù)發(fā)診斷，也同樣存在缺乏理想外周血檢測(cè)指標(biāo)的問(wèn)題。因此，發(fā)現(xiàn)理想的早期診斷指標(biāo)，其意義十分重大。目前在國(guó)內(nèi)外，本領(lǐng)域當(dāng)前的研究重點(diǎn)有如下四個(gè)方面
①全基因組層面篩選新指標(biāo)
現(xiàn)有的血清學(xué)指標(biāo)中，對(duì)乳腺癌診斷價(jià)值大的不多，特別缺少早期診斷有價(jià)值的指標(biāo)。 缺乏理想診斷指標(biāo)，原因可能是未能全面篩選相關(guān)指標(biāo)；近年來(lái)全基因組表達(dá)的檢測(cè)已有較大突破，可以進(jìn)行噬菌體展示技術(shù)、全基因組芯片技術(shù)等檢測(cè)，因此國(guó)內(nèi)外已開始從全基因組層面篩選各類腫瘤新的、有價(jià)值指標(biāo)，這種方案可以發(fā)現(xiàn)新的診斷指標(biāo)，故成為研究熱
；ο②多指標(biāo)聯(lián)合診斷模型的開發(fā)腫瘤標(biāo)志物診斷價(jià)值未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)的另一原因，可能是腫瘤不同類型、不同時(shí)期表達(dá)的指標(biāo)不同有關(guān)，因此期望用單一指標(biāo)解決各階段的診斷問(wèn)題不現(xiàn)實(shí)。國(guó)內(nèi)外已有多指標(biāo)聯(lián)合診斷的研究報(bào)道，本課題組曾對(duì)12種常用指標(biāo)聯(lián)合診斷進(jìn)行研究，取得較好效果。 多指標(biāo)聯(lián)合診斷，能提高診斷的準(zhǔn)確度。③尋找外周血中能反映腫瘤早期病變的指標(biāo)
在以外周血檢查為主要手段篩查腫瘤的現(xiàn)階段，外周血指標(biāo)是否理想，決定著早期診斷效果的好壞。對(duì)多數(shù)腫瘤而言，目前仍缺少理想的診斷指標(biāo)。腫瘤特異蛋白最早表達(dá)在病灶組織，但這種表達(dá)在早期是微量的，加上即使病灶組織表達(dá)，也未必分泌到外周血，所以有必要從早期表達(dá)指標(biāo)中找出能分泌到外周血中的指標(biāo)。近年有試圖利用抗體為指標(biāo)， 實(shí)現(xiàn)早期診斷的研究；其理論依據(jù)是，病灶細(xì)胞一旦有表達(dá)蛋白的改變，就會(huì)通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，抗體可以從血液中檢測(cè)到，并且現(xiàn)有方法學(xué)可以檢測(cè)到血液中微量的抗體。除此，還有檢測(cè)外周血中微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞、微RNA為診斷指標(biāo)的研究、DNA水平的基因突變等。④新方法學(xué)的開發(fā)和應(yīng)用
方法學(xué)的靈敏度、特異性是評(píng)價(jià)其優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)，蛋白檢測(cè)主要有蛋白芯片技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、酶免疫技術(shù)等，mRNA檢測(cè)主要有核酸芯片技術(shù)、RT-PCR技術(shù)等。噬菌體展示技術(shù)是近年用于新指標(biāo)篩選的重要手段。噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建腫瘤蛋白文庫(kù)，以此篩選血清中特異性指標(biāo)已有部分報(bào)道， Zhong Li等報(bào)道了肺癌中的研究結(jié)果，取得較好效果，其產(chǎn)品診斷非小細(xì)胞肺癌的敏感性達(dá)90 %、特異性達(dá)95 %，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高出現(xiàn)有的任何其它診斷方法。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的類似研究，主要還局限在肺癌、前列腺癌和卵巢癌，而在乳腺癌方面的報(bào)道并不多見(jiàn)。從發(fā)展趨勢(shì)看，乳腺癌等的診斷指標(biāo)篩選，主要是從全基因組層面展開；蛋白質(zhì)是直接起生理作用的物質(zhì)形式，因此也較DNA或RNA層面的研究更有價(jià)值；噬菌體展示技術(shù)可表達(dá)導(dǎo)入的單個(gè)基因，便于特定蛋白的針對(duì)性研究。因此，應(yīng)用噬菌體展示構(gòu)建全基因組蛋白文庫(kù)，篩查新的蛋白質(zhì)指標(biāo)，已成重要研究趨勢(shì)。有鑒于此，本發(fā)明人作為專門從事乳腺癌診斷檢測(cè)的醫(yī)生，結(jié)合在該領(lǐng)域多年工作的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)上述問(wèn)題及前沿技術(shù)進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤研究，本案由此產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服乳腺癌現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物不理想問(wèn)題，旨在提高乳腺癌早期診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率，利用一種特異性、敏感性強(qiáng)的診斷標(biāo)志物制備診斷穩(wěn)定性好、檢測(cè)方便的用于乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的診斷試劑。本發(fā)明用于乳腺癌的早期診斷與鑒別診斷，更有利于乳腺癌患者的診斷和治療，達(dá)到提高乳腺早期診斷敏感性和和準(zhǔn)確性的目標(biāo)。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種進(jìn)行乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種早期乳腺癌血清診斷試劑，所述診斷試劑以FTHl，或者FTHl聯(lián)合hnRNPF為診斷標(biāo)志物，可檢測(cè)分離的待測(cè)血清中FTHl抗體，或者FTHl與hnRNPF的對(duì)應(yīng)抗體，用于乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)。一種早期乳腺癌血清診斷試劑，包括FTHl ELISA板，F(xiàn)THl ELISA板先由應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)的FTHl抗原或商業(yè)化購(gòu)得的FTHl抗原包埋酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜，洗滌后5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)形成；還包括可配合FTHl ELISA板對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG、顯色劑A、B和終止液；FTHl ELISA板可由酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處讀取OD值，以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值進(jìn)行判斷，比值彡2. 0，判斷為陽(yáng)性， 比值< 2. 0，判斷為陰性，陰性對(duì)照OD值低于0. 05作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)笪弁。進(jìn)一步，一種早期乳腺癌血清診斷試劑，還包括hnRNPF ELISA板，hnRNPF ELISA 板先由應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)的hnRNPF抗原或商業(yè)化購(gòu)得的hnRNPF抗原包埋酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜，洗滌后5%BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)形成；還包括可配合hnRNPF ELISA板對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG、顯色劑A、B和終止液；hnRNPF ELISA板可由酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值，以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，結(jié)合FTHl ELISA 板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，進(jìn)行判斷，陰性對(duì)照OD值低于0. 05作0. 05 計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。一種進(jìn)行乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的方法，包括以下步驟
(1)配液應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)FTHl抗原制成T7噬菌體液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買FTHl抗原液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買FTHl抗原粉制成FTHl抗原液；
(2)FTH1ELISA板的制備將T7噬菌體液或FTHl抗原液包被于酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；經(jīng)洗滌后，5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)；
(3)標(biāo)本收集和處理抽待測(cè)外周血，分離待測(cè)血清；
(4)FTHl ELISA板的檢測(cè)在酶標(biāo)板的每孔中加入1 100稀釋的待測(cè)血清室溫孵育1 小時(shí)；洗滌后加入1:10 000稀釋的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫放置1小時(shí)；洗滌后加入顯色劑A、B各1滴，37°C孵育15分鐘，立即加入終止液；
(5)讀板在酶標(biāo)儀下450nm波長(zhǎng)處讀取OD值；
(6)根據(jù)OD值的陰性、陽(yáng)性判斷結(jié)果以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值進(jìn)行判斷，比值彡2. 0，判斷為陽(yáng)性，比值< 2. 0，判斷為陰性，陰性對(duì)照OD值低于0. 05作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。進(jìn)一步，一種進(jìn)行乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的方法，還包括以下步驟
(1)配液應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)hnRNPF抗原制成T7噬菌體液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買hnRNPF抗原液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買hnRNPF抗原粉制成hnRNPF抗原液；
(2)hnRNPF ELISA板的制備將T7噬菌體液或hnRNPF抗原液包被于酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；經(jīng)洗滌后，5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)；(3)標(biāo)本收集和處理抽待測(cè)外周血，分離待測(cè)血清；
(4)hnRNPF ELISA板的檢測(cè)在酶標(biāo)板的每孔中加入1 100稀釋的待測(cè)血清室溫孵育 1小時(shí)；洗滌后加入1:10 000稀釋的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫放置1小時(shí)；洗滌后加入顯色劑A、B各1滴，37°C孵育15分鐘，立即加入終止液；
(5)讀板在酶標(biāo)儀下450nm波長(zhǎng)處讀取OD值；
(6)根據(jù)OD值的陰性、陽(yáng)性判斷結(jié)果以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，結(jié)合FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，進(jìn)行判斷，陰性對(duì)照OD值低于0. 05 作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。進(jìn)一步，所述第(6)步中根據(jù)hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD 值的比值，結(jié)合FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值進(jìn)行判斷，是指 hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值或者FTHl ELISA板待測(cè)血清 OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，任一比值彡2.0，即判斷為陽(yáng)性。從而明顯提高乳腺癌診斷效果。本方法的理論依據(jù)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)(侯振江，張宗英.乳腺癌腫瘤標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述2008，14(2): 224-226)在多種癌癥的早期階段、癥狀尚未出現(xiàn)，甚至病理學(xué)檢測(cè)都不能發(fā)現(xiàn)變化時(shí)，癌癥患者血液中就有了針對(duì)癌癥的抗體。由于抗體更早出現(xiàn)在血清中，采用該技術(shù)方案可以達(dá)到更早期診斷的效果。本研究首先將噬菌體文庫(kù)與正常對(duì)照組血清中的抗體結(jié)合，棄掉結(jié)合的噬菌體， 即剔除非特異性噬菌體。剩下的噬菌體再與乳腺癌患者的血清中的抗體結(jié)合，能特異結(jié)合的噬菌體被收集并被擴(kuò)增。此為一輪正負(fù)親和篩選，如此反復(fù)四輪，使能與乳腺癌特異性抗體結(jié)合的噬菌體將得到足夠程度的富集。本發(fā)明人通過(guò)分離和研究健康女性血清和乳腺癌患者血清，經(jīng)乳腺癌T7噬菌體文庫(kù)處理，選擇到與乳腺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的特異噬菌體克隆，再對(duì)這些特異性克隆噬菌體作PCR擴(kuò)增、測(cè)序，經(jīng)全基因組表達(dá)譜中篩選比對(duì)，找到可用于乳腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物，最終研制出可便于臨床應(yīng)用的早期乳腺癌血清診斷試劑。本發(fā)明用于乳腺癌的早期診斷與鑒別診斷，提高乳腺癌早期診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率，更有利于乳腺癌患者的診斷和治療。以此解決乳腺癌現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物不理想問(wèn)題，達(dá)到提高乳腺早期診斷敏感性和和準(zhǔn)確性的目標(biāo)。該乳腺癌診斷標(biāo)志物(hnRNPF :heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F, FTHl ferritin heavy chain 1)是從全基因組表達(dá)譜中篩選得到，選擇時(shí)具有最大的全面性，即最大的代表性。該乳腺癌診斷標(biāo)志物(hnRNPF、FTHl)經(jīng)乳腺癌患者病灶組織、癌旁組織、正常對(duì)照組驗(yàn)證，是乳腺癌特異性標(biāo)志物。該乳腺癌診斷標(biāo)志物(hnRNPF、FTHl)不但在乳腺癌病灶組織特異性高表達(dá)，而且患者血清中也同步高表達(dá)，經(jīng)驗(yàn)證，血清中該標(biāo)志物高表達(dá)對(duì)乳腺癌的診斷具有較現(xiàn)有其他指標(biāo)更高的準(zhǔn)確性。該乳腺癌血清標(biāo)志物是一種抗體，而如前述檢測(cè)血清中相應(yīng)抗體可達(dá)到更早期的診斷效果，這與以往報(bào)道和應(yīng)用的抗原診斷標(biāo)志物有完全不同的理念和效果。即本發(fā)明不但篩選到新的乳腺癌血清標(biāo)志物，并且是用其抗體為檢測(cè)對(duì)象的一種新方案。
本技術(shù)方案公開的乳腺癌診斷標(biāo)志物具有較高的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率，因此據(jù)此制作的診斷試劑所需的待檢血清非常少，再加上目前抗體檢測(cè)技術(shù)成熟，可以極微量的情況下檢測(cè)到其存在，彌補(bǔ)了抗原或者其他現(xiàn)有的診斷標(biāo)志物在微量情況難檢測(cè)到的不足，加上抗體更早出現(xiàn)在血清中，從達(dá)到早期診斷之目的。本發(fā)明開發(fā)的試劑，通過(guò)乳腺癌、乳腺良性腫瘤、其他癌癥(非乳腺癌)患者及正常人血清應(yīng)用的驗(yàn)證，具體見(jiàn)具體實(shí)施方式
部分。以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為噬菌體淘洗乳腺癌特異表達(dá)蛋白的過(guò)程。圖2為插入乳腺癌特異基因的噬菌。圖3為乳腺癌噬菌體展示肽庫(kù)。A為原始庫(kù)，B為擴(kuò)增庫(kù)。圖4為部分噬菌體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖。M: DL 2000 Marker ;1 16隨機(jī)克隆的插入片段PCR結(jié)果。圖 5 為 hnRNPF mRNA 禾口 FTHl mRNA 的 RT-PCR 部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖。A :hnRNPF mRNA部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖，B :FTH1 mRNA部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖；M :DL2000 mark，1、2、3、4為乳腺癌病灶組織，5、6為乳腺癌旁組織，7、8為乳腺良性腫瘤組織，9為陰性對(duì)照用去離子水代替底物。圖6為hnRNPF mRNA和FTHl mRNA在不同組織中的表達(dá)。圖7為兩指標(biāo)在乳腺癌患者術(shù)前血清與健康女性血清中的表達(dá)差異分析。圖8為兩指標(biāo)在血清及癌灶組織中的表達(dá)比較。圖9為hnRNPF、FTH與CA15-3單項(xiàng)或聯(lián)合診斷乳腺癌的ROC曲線。圖10為ROC曲線下面積及95%可信區(qū)間。圖11為兩指標(biāo)早期診斷乳腺癌的價(jià)值。圖12為兩指標(biāo)與乳腺癌臨床分期的關(guān)系。圖13為兩指標(biāo)與乳腺癌病理分型的關(guān)系。圖14為兩指標(biāo)與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。圖15為hnRNPF抗體血清檢測(cè)ELISA酶標(biāo)板照片。圖16為FTHl抗體血清檢測(cè)ELISA酶標(biāo)板照片。
具體實(shí)施例方式—、本發(fā)明所用標(biāo)本來(lái)源、試劑耗材和主要儀器 1、標(biāo)本來(lái)源
經(jīng)本人及其家屬同意，乳腺癌新鮮組織共40例，取自于醫(yī)院乳腺和甲狀腺外科2009年 5月至2010年5月手術(shù)的患者，病灶及癌旁組織切下后迅速轉(zhuǎn)移到液氮罐，-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫蝗橄侔┗颊哐鍢?biāo)本共273例，按照臨床分期、病理分型及轉(zhuǎn)移分組；同時(shí)取M例正常女性和40例患有其他腫瘤的女性患者血清樣本作為對(duì)照組，-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。具體臨床資料見(jiàn)表1。表1乳腺癌患者、他癌癥患者和正常對(duì)照人群的主要臨床病理資料
權(quán)利要求
1.一種早期乳腺癌血清診斷試劑，其特征在于所述診斷試劑以FTH1，或者FTHl聯(lián)合 hnRNPF為診斷標(biāo)志物，可檢測(cè)分離的待測(cè)血清中FTHl抗體，或者FTHl與hnRNPF的對(duì)應(yīng)抗體，用于乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)。
2.一種早期乳腺癌血清診斷試劑，其特征在于包括FTHl ELISA板，該FTHl ELISA板先由應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)的FTHl抗原或商業(yè)化購(gòu)得的FTHl抗原包埋酶標(biāo)板， 4°C過(guò)夜，洗滌后5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)形成；還包括可配合FTHl ELISA板對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG、顯色劑A、B和終止液；FTHl ELISA板可由酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值，以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值進(jìn)行判斷，比值> 2. 0，判斷為陽(yáng)性，比值< 2. 0，判斷為陰性，陰性對(duì)照OD值低于0. 05作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD 值計(jì)算。
3.如權(quán)利要求2所述的一種早期乳腺癌血清診斷試劑，其特征在于還包括hnRNPF ELISA板，該hnRNPF ELISA板先由應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)的hnRNPF抗原或商業(yè)化購(gòu)得的hnRNPF抗原包埋酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜，洗滌后5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)形成；還包括可配合hnRNPF ELISA板對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG、顯色劑A、B和終止液；hnRNPF ELISA板可由酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值，以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD 值的比值，結(jié)合FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，進(jìn)行判斷，陰性對(duì)照OD值低于0. 05作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。
4.一種進(jìn)行乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的方法，其特征在于包括以下步驟(1)配液應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)FTHl抗原制成T7噬菌體液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買FTHl抗原液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買FTHl抗原粉制成FTHl抗原液；(2)FTH1ELISA板的制備將T7噬菌體液或FTHl抗原液包被于酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；經(jīng)洗滌后，5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)；(3)標(biāo)本收集和處理抽待測(cè)外周血，分離待測(cè)血清；(4)FTHl ELISA板的檢測(cè)在酶標(biāo)板的每孔中加入1 100稀釋的待測(cè)血清室溫孵育1 小時(shí)；洗滌后加入1:10 000稀釋的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫放置1小時(shí)；洗滌后加入顯色劑A、B各1滴，37°C孵育15分鐘，立即加入終止液；(5)讀板在酶標(biāo)儀下450nm波長(zhǎng)處讀取OD值；(6)根據(jù)OD值的陰性、陽(yáng)性判斷結(jié)果以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值進(jìn)行判斷，比值彡2. 0，判斷為陽(yáng)性，比值< 2. 0，判斷為陰性，陰性對(duì)照OD值低于0. 05作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。
5.如權(quán)利要求4所述的一種進(jìn)行乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的方法，其特征在于還包括以下步驟(1)配液應(yīng)用乳腺癌T7噬菌體特異表達(dá)hnRNPF抗原制成T7噬菌體液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買hnRNPF抗原液，或者直接商業(yè)化購(gòu)買hnRNPF抗原粉制成hnRNPF抗原液；(2)hnRNPF ELISA板的制備將T7噬菌體液或hnRNPF抗原液包被于酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；經(jīng)洗滌后，5% BSA/PBS室溫封閉2小時(shí)；(3)標(biāo)本收集和處理抽待測(cè)外周血，分離待測(cè)血清；(4)hnRNPF ELISA板的檢測(cè)在酶標(biāo)板的每孔中加入1 100稀釋的待測(cè)血清室溫孵育 1小時(shí)；洗滌后加入1:10 000稀釋的HRP偶聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫放置1小時(shí)；洗滌后加入顯色劑A、B各1滴，37°C孵育15分鐘，立即加入終止液；(5)讀板在酶標(biāo)儀下450nm波長(zhǎng)處讀取OD值；(6)根據(jù)OD值的陰性、陽(yáng)性判斷結(jié)果以先后經(jīng)噬菌體、鼠抗噬菌體一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加樣孔作為陰性對(duì)照孔，以未包被噬菌體的加樣孔作為空白對(duì)照孔；用空白對(duì)照孔調(diào)零后，根據(jù)hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，結(jié)合FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，進(jìn)行判斷，陰性對(duì)照OD值低于0. 05 作0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。
6.如權(quán)利要求5所述的一種進(jìn)行乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)的方法，其特征在于所述第(6)步中根據(jù)hnRNPF ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，結(jié)合FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值進(jìn)行判斷，是指hnRNPF ELISA 板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值或者FTHl ELISA板待測(cè)血清OD值/陰性對(duì)照平均OD值的比值，任一比值彡2. 0，即判斷為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種早期乳腺癌血清診斷試劑及其檢測(cè)方法，所述診斷試劑采用的腫瘤標(biāo)志物為FTH1，或者FTH1聯(lián)合hnRNPF，檢測(cè)待測(cè)血清中FTH1抗體，或者FTH1與hnRNPF的對(duì)應(yīng)抗體，用于乳腺癌早期診斷或術(shù)后療效監(jiān)測(cè)；本發(fā)明開發(fā)的試劑，通過(guò)乳腺癌、乳腺良性腫瘤、其他癌癥(非乳腺癌)患者及正常人血清應(yīng)用的驗(yàn)證。本發(fā)明用于乳腺癌的早期診斷與鑒別診斷，旨在提高乳腺癌早期診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率，更有利于乳腺癌患者的診斷和治療。以此解決乳腺癌現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物不理想問(wèn)題，達(dá)到提高乳腺早期診斷敏感性和準(zhǔn)確性的目標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102393458SQ201110246380
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者李志國(guó), 董學(xué)君 申請(qǐng)人:紹興市人民醫(yī)院