專利名稱：一種煙草hplc指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙草品質(zhì)分級(jí)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草HPLC指紋圖譜的分析方法及在烤煙質(zhì)量分析、烤煙品牌識(shí)別和打葉配方中的用途。
背景技術(shù)：
指紋圖譜系指將分析對(duì)象經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的儀器分析手段得到的能夠標(biāo)示該對(duì)象特性的共有峰的圖譜。指紋圖譜技術(shù)具有模糊指紋特征分析、宏觀推斷分析等特點(diǎn)，是進(jìn)行復(fù)雜物質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效手段。指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于中藥品質(zhì)分析和判斷及農(nóng)產(chǎn)品朔源等領(lǐng)域。鑒于此，近年來(lái)，一些研究者對(duì)指紋圖譜技術(shù)在煙草科研與生產(chǎn)上應(yīng)用的理論和實(shí)踐問(wèn)題進(jìn)行了有益的探索。經(jīng)檢索，中國(guó)發(fā)明專利中指紋圖譜應(yīng)用的發(fā)明專利申請(qǐng)涉及煙草和中成藥鑒定等多個(gè)方面。經(jīng)檢索目前的相關(guān)專利文獻(xiàn)如下
申請(qǐng)?zhí)枮?00810196806. 7文獻(xiàn)涉及一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜分析方法。它是采用高效液相色譜分析方法測(cè)定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對(duì)特征峰進(jìn)行分析，建立指紋圖譜特征峰總面積與煙葉樣品感官質(zhì)量的回歸關(guān)系模型；以感官質(zhì)量為依變量y，指紋圖譜總面積χ為因變量，建立兩者的回歸關(guān)系模型為:Y = 72. 04974+0. 1388*LN(X) *LN(X)或 Y = X/ (0. 011081*Χ+13· 247)；根據(jù)所測(cè)樣品的指紋圖譜總面積X，計(jì)算出感官質(zhì)量Y。本發(fā)明具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)， 實(shí)際操作中可節(jié)省大量的人力物力財(cái)力，使用方便，能夠代替利用傳統(tǒng)的感官評(píng)吸方法對(duì)煙葉醇化質(zhì)量的判定。申請(qǐng)?zhí)枮?00810196807. 1文獻(xiàn)涉及一種烤煙醇化品質(zhì)判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法。它是采用高效液相色譜分析方法測(cè)定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對(duì)特征峰進(jìn)行分析，建立特征峰主成分值與煙葉樣品感官質(zhì)量的回歸關(guān)系模型；以感官評(píng)吸值Y為依變量，7個(gè)主成分值A(chǔ)l至Α7為因變量， 建立特征峰主成分值與感官評(píng)吸值的多元回歸模型
Y = 85. 64+1. 34Α1+1. 21Α2+0. 27Α3-0. 40Α4-1. 17Α5-0. 46Α6+0. 48Α7 根據(jù)分析所得到的主成分值Α，計(jì)算出感官質(zhì)量Y。具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，實(shí)際操作中可節(jié)省大量的人力物力財(cái)力，使用方便，能夠代替利用傳統(tǒng)的感官評(píng)吸方法對(duì)煙葉醇化質(zhì)量的判定。申請(qǐng)?zhí)枮?1119925. 3的文獻(xiàn)涉及中藥丹參水溶性提取物HPLC指紋圖譜建立的方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。首先制備供試品溶液，取丹參藥材粉末(過(guò)30目篩)4.00g，加水 50ml，精密稱重，回流提取2小時(shí)，放冷至室溫，補(bǔ)足失水，取2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，離心，取上清液作為供試品溶液。再配制對(duì)照品溶液，取丹參素鈉、原兒茶醛對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋，制成每Iml中含丹參素鈉20 μ g，原兒茶醛5. 0 μ g，作為對(duì)照品溶液。測(cè)定法是分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各20μ 1、10μ 1，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，計(jì)算，即得。建立丹參標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。將待測(cè)丹參樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，比較其異同。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握，能從色譜的整體特征面貌上把握丹參的品種和質(zhì)量情況，可將其作為丹參質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別的指標(biāo)之一。申請(qǐng)?zhí)枮?3147783. 6文獻(xiàn)涉及一種使用高速逆流色譜(HSCCC)制訂中藥指紋圖譜的方法。該方法包括制備各批次中藥材的粗提物；通過(guò)TLC確定主要化合物類型；選取 HSCCC使用的溶劑體系；使用高速逆流色譜儀純化中藥材的粗提物；使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)洗脫液，繪制各組份的紫外吸收與洗脫時(shí)間的關(guān)系圖；通過(guò)HPLC和UV-Vis確定粗提物中各組份的對(duì)應(yīng)性；判斷共有指紋峰；綜合中藥指紋圖譜方法學(xué)考察資料的數(shù)據(jù)即構(gòu)成指紋圖譜。該法首次將HSCCC應(yīng)用于中藥指紋圖譜的制訂，是對(duì)現(xiàn)有方法的重要補(bǔ)充，其精密度和重現(xiàn)性明顯優(yōu)于TLC，又解決了 HPLC難以分析/分離高粘度和易填料吸附的樣品以及儀器耗材昂貴的問(wèn)題。申請(qǐng)?zhí)枮?00410066701. 1文獻(xiàn)涉及一種中藥指紋圖譜的制作方法，是一個(gè)用裂解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)來(lái)制作中藥指紋圖譜的方法，該方法包括下列三步步驟1、中藥材的裂解；2、GC/MS分析；3、計(jì)算機(jī)處理，獲得標(biāo)識(shí)混合體系的彩色二維條形碼，即是使得計(jì)算機(jī)能夠識(shí)別中藥的指紋圖譜。通過(guò)對(duì)同一藥材或不同藥材的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行精確的類似度比較，根據(jù)類似度的大小，人們可對(duì)中藥材進(jìn)行鑒別。因而本發(fā)明制作方法可用來(lái)快速有效地鑒別中藥材，控制中藥材的質(zhì)量，為提高中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化程度提供一個(gè)重要的手段。申請(qǐng)?zhí)枮?00610(^9707. 0文獻(xiàn)涉及一種治療心血管疾病的中藥組合物及其指紋圖譜分析方法。該中藥組合物由人參、蟾酥、牛黃、肉桂、麝香、冰片、蘇合香七味藥材或者七味藥材的提取物組成。這種中藥組合物的非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分的指紋圖譜具有一定數(shù)量的特征峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積符合一定的比例。本發(fā)明對(duì)于發(fā)展我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥，促進(jìn)人類健康具有十分重大的意義。申請(qǐng)?zhí)枮?01010106834. 2的文獻(xiàn)涉及天麻生化指紋圖譜分類與品質(zhì)鑒定技術(shù)及其應(yīng)用，涉及中藥和天然藥物的鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)技術(shù)。本發(fā)明提供了分離和檢測(cè)天麻生化成分的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)最佳流動(dòng)相(梯度濃度乙腈溶液)和最佳檢測(cè)波長(zhǎng)Ol9nm)以及其他基本條件，提供了測(cè)定天麻生化指紋圖譜的技術(shù)和計(jì)算天麻有效成分天麻素含量的公式和方法。本發(fā)明不僅能用于天麻生化指紋圖譜的測(cè)定、天麻品種的分類、天麻品質(zhì)的鑒定和評(píng)價(jià)，還能用于天麻適宜種植地區(qū)確定和天麻真?zhèn)舞b別。上述專利文獻(xiàn)多是中藥指紋圖譜的分析及其應(yīng)用，只有二份涉及烤煙的指紋圖譜建立及其應(yīng)用。該二份烤煙指紋圖譜文獻(xiàn)均是采用多元分析方法預(yù)測(cè)烤煙的感官評(píng)吸值， 由于感官評(píng)吸受人為主觀因素影響，評(píng)吸值變異大、重現(xiàn)性差，因此上述二個(gè)專利文獻(xiàn)的應(yīng)用具有局限性。中草藥指紋圖譜的測(cè)定對(duì)象和分析對(duì)象與烤煙有根本的不同，雖然其科學(xué)原理可以作為參考，但其技術(shù)方法不能照搬。另外，過(guò)去建立的烤煙和中草藥指紋圖譜均是采用共有峰圖譜，沒(méi)有考慮非共有峰的作用，在實(shí)際應(yīng)用中，理論上存在誤判的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有考慮指紋圖譜非共有峰、僅靠預(yù)測(cè)烤煙的感官評(píng)吸值來(lái)進(jìn)行品質(zhì)分析的缺陷，尋找一種高效經(jīng)濟(jì)的烤煙品質(zhì)分級(jí)方法及其應(yīng)用技術(shù)途徑。本發(fā)明尋找一種能夠反映烤煙的特征品質(zhì)的指紋圖譜分析方法，并提出具體的應(yīng)用技術(shù)途徑。本發(fā)明提出的指紋圖譜分析方法能夠科學(xué)的將烤煙進(jìn)行分類，切實(shí)降低烤煙評(píng)吸工作量，提高打葉配方生產(chǎn)水平，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種煙草HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，其特征步驟為
1)、烤煙成分提取以甲醇為提取劑，提取條件為液固比v/g為20— 40，提取溫度為 20 30°C，超聲波提取時(shí)間50 60min，離心分離后取上清液過(guò)0. 45Mm的濾膜，濾液為待測(cè)溶液；
2)、HPLC指紋圖譜分析取步驟1)的待測(cè)溶液，采用HPLC進(jìn)行指紋圖譜分析，得到烤煙原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，分析條件為C18色譜柱，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0. 08 0. 2%的甲酸；梯度洗脫程序不同分析時(shí)間時(shí)，流動(dòng)相A與B體積比分別是0min時(shí)為0 5 95 100，30min 時(shí)為 20 25 75 80，45min 時(shí)為 30 40 60 70，55min 時(shí)為 50 60:40 50并保持5 min，停止色譜分析；65min時(shí)，A與B的體積比為0 5:95 100 ； 保持aiiin后運(yùn)行5min ；其體積流量范圍0. 8-1.2 ml/min ；柱溫20 30°C，檢測(cè)波長(zhǎng) 250nm ；
3)、指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立通過(guò)計(jì)算機(jī)編程技術(shù)，將步驟2)得到的烤煙原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)；
4)、主成份一聚類分析法判定煙草品質(zhì)級(jí)別采用主成份分析法對(duì)步驟3)的烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，提取主成份，對(duì)不同樣品的主成份值進(jìn)行聚類分析；或者直接對(duì)步驟3)的烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，以達(dá)到對(duì)不同品質(zhì)的煙葉進(jìn)行分類的目的。所述步驟3)的分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的時(shí)長(zhǎng)為l-5min。所述步驟1)的超聲波頻率為20 80MHz，離心機(jī)離心力為5，000 12，000 g，離心時(shí)間8 15min。所述步驟2)的色譜柱為C18色譜柱。本發(fā)明方法涉及在烤煙品質(zhì)分類及品牌煙葉識(shí)別中的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出分時(shí)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并直接將指紋圖譜信息轉(zhuǎn)化為烤煙品質(zhì)的分類結(jié)果，理論上更為完善、方法上更為科學(xué)、實(shí)際上更好操作。本發(fā)明的烤煙HPLC指紋圖譜包括共有峰和非共有峰。所謂共有峰是在供研究樣品的指紋圖譜中都出現(xiàn)的特征峰。共有峰數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單明了，但其缺點(diǎn)是忽視了非共有峰的作用和貢獻(xiàn)。不可否認(rèn)，一定條件下，可能正是非共有峰的作用和貢獻(xiàn)決定了煙葉的品質(zhì)和級(jí)別的差異性。基于這一嶄新的指導(dǎo)思想，實(shí)施本發(fā)明的核心技術(shù)是建立HPLC分時(shí)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的方法，這一方法充分考慮到了非共有峰的貢獻(xiàn)，通過(guò)對(duì)分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行主成份一聚類分析，從而確定烤煙品質(zhì)級(jí)別，達(dá)到烤煙品質(zhì)分級(jí)的目的。HPLC指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)建立的方法是，通過(guò)人工和計(jì)算機(jī)編程技術(shù)使原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)。理論上，任何時(shí)間段都可以選用來(lái)進(jìn)行建庫(kù)。一般是時(shí)間段越短、信息量越豐富。通常根據(jù)計(jì)算要求，可以選1至5min不等。比如，為選取合適的時(shí)間段，采用lmin、2min、;3min和5min這四個(gè)時(shí)間段，分別將60min的圖譜剪切成60、30、20禾口 12個(gè)時(shí)段圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從不同時(shí)間段選取的結(jié)果來(lái)看，Imin和^iin時(shí)間段太短，特征峰之間還是會(huì)出現(xiàn)漂移；而5min時(shí)間段包含的穩(wěn)定性不高的特征峰太多。最終選取:3min時(shí)間段來(lái)對(duì)烤煙指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，采用甲醇提取液，HPLC分析建立的煙草特征提取物色譜圖基線平穩(wěn)、響應(yīng)峰多、分離度好(如圖1)。對(duì)樣品提取液連續(xù)進(jìn)樣5次，比較保留時(shí)間和峰面積的精密性和重現(xiàn)性，結(jié)果表明，峰面積RSD<3%以下。取烤煙樣品提取液相隔池，4h，他， 8h，10h, 12h進(jìn)行方法穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果RSD<3%以下，表明該方法很穩(wěn)定。另外，選取10個(gè)樣本指紋圖譜，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入和數(shù)據(jù)匹配，以平均數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜(如圖2)。從圖2指紋圖譜共有模式和匹配結(jié)果可以看出，有48個(gè)峰為10個(gè)批次樣品所共有(表1)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)共有峰峰面積占總峰面積的90%以上。相似度分析表明，10批次樣品指紋圖譜的相似度在0. 98以上(表2)， 表明所建立的指紋圖譜完全符合技術(shù)規(guī)范。本發(fā)明首次提出了指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的概念并提出了相應(yīng)的計(jì)算軟件和方法 (圖3)。分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的提出是為了快速處理指紋圖譜數(shù)據(jù)，降低人為操作失誤，最大程度利用圖譜潛在信息，包括非共有峰對(duì)煙葉品質(zhì)的影響。同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的客觀性，降低人為誤差，使數(shù)據(jù)整理工作變的簡(jiǎn)單方便，實(shí)現(xiàn)指紋圖譜工業(yè)化的目的。本發(fā)明采用HPLC技術(shù)獲得指紋圖譜，采用分時(shí)軟件構(gòu)建指紋圖譜的分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)主成份一聚類分析實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草品質(zhì)的分類。本發(fā)明的HPLC指紋圖譜分析新技術(shù)，能夠提高煙草HPLC指紋圖譜分析的科學(xué)性，對(duì)于提高烤煙質(zhì)量分級(jí)水平及提高煙草生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的
眉、ο本發(fā)明的技術(shù)原理是
烤煙的指紋圖譜是烤煙多種品質(zhì)復(fù)雜成分的集合，如同人的指紋的唯一性一樣，烤煙的指紋圖譜是一定品質(zhì)特征的反映。采用科學(xué)的方法對(duì)烤煙指紋圖譜進(jìn)行表征和分析，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)烤煙品質(zhì)的分類。采用HPLC技術(shù)建立的指紋圖譜包括共有峰和非共有峰，顯然，可能正是非共有峰的作用和貢獻(xiàn)決定了煙葉的品質(zhì)和級(jí)別的差異性。然而，過(guò)去有關(guān)指紋圖譜的分析均是采用共有峰，而忽視了非共有峰的作用和貢獻(xiàn)。而且，HPLC指紋圖譜共有峰和非共有峰眾多， 靠人工辨別，很容易導(dǎo)致錯(cuò)誤。本發(fā)明提出分時(shí)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的概念和分析技術(shù)，是為了快速處理指紋圖譜數(shù)據(jù)，降低人為操作失誤，最大程度地利用圖譜的潛在信息，包括非共有峰對(duì)煙葉品質(zhì)的影響。同時(shí)，降低人為誤差，使數(shù)據(jù)整理工作變的簡(jiǎn)單方便，實(shí)現(xiàn)指紋圖譜分析自動(dòng)化的目的。本發(fā)明的有益效果是
1)本發(fā)明的分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，簡(jiǎn)單、實(shí)用、運(yùn)行成本低；
2)指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的更能反映烤煙的品質(zhì)特征，以此為基礎(chǔ)的品質(zhì)分析方法，更科學(xué)，更完善；
2)本發(fā)明采用的烤煙品質(zhì)判定方法，能夠取代人工評(píng)吸方法實(shí)現(xiàn)對(duì)烤煙品質(zhì)的判定及在打葉配方中的應(yīng)用，避免了人的主觀錯(cuò)誤，提高了打葉配方中烤煙品質(zhì)判定的科學(xué)性，在實(shí)際運(yùn)用中顯著提高經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 本發(fā)明的烤煙甲醇特征提取物HPLC指紋圖譜圖；圖2 本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)條件下，選用的云南烤煙10批次樣品甲醇提取物HPLC指紋圖譜及其共有模式。圖3 本發(fā)明提出的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)分時(shí)數(shù)據(jù)軟件視窗示意圖。圖4:本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)條件下，2010年云南省典型產(chǎn)區(qū)C3F等級(jí)煙葉指紋圖譜聚類分析。圖5 本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)條件下，2010年云南省典型產(chǎn)區(qū)B2F等級(jí)煙葉指紋圖譜聚類分析。圖6 本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)條件下，2010年云南省典型產(chǎn)區(qū)X2F等級(jí)煙葉指紋圖譜聚類分析。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不限于實(shí)施例。實(shí)施例1
本發(fā)明提供的煙草HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，經(jīng)過(guò)下列步驟
1)烤煙提取以甲醇為提取劑，具體提取條件是液固比(v/g)為30，提取溫度25°C， 頻率為40 MHz的超聲波中提取60min，離心機(jī)(10，000 g)離心8min ；離心后取上清液，過(guò) 0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測(cè)溶液；
2)取步驟1)的待測(cè)溶液進(jìn)行指紋圖譜分析HPLC，具體條件為C18色譜柱(250 mmX 4.6mm，5Mm)，乙腈為流動(dòng)相A，0. 1% (ν/ν)的甲酸為流動(dòng)相B ；梯度洗脫程序不同分析時(shí)間時(shí)，流動(dòng)相A與B體積比分別是0min時(shí)為5: 95 ；30min時(shí)為20:80 ；45min時(shí)為 30:70 ；55min時(shí)為55:45，保持5 min停止色譜分析，65min時(shí)，A與B的體積比為5:95 ；保持anin后運(yùn)行5min ；其體積流量0. 8ml/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm ；
3)指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立通過(guò)計(jì)算機(jī)編程技術(shù)使原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，時(shí)間段越短，信息量越豐富，根據(jù)計(jì)算要求，選取:3min時(shí)間段來(lái)對(duì)烤煙指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析；
4)主成份一聚類分析法判定煙草品質(zhì)級(jí)別采用主成份分析法對(duì)烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，提取主成份，對(duì)不同樣品的主成份值進(jìn)行聚類分析，即最短距離法，達(dá)到對(duì)不同品質(zhì)的煙葉進(jìn)行分類的目的。實(shí)施例2
本發(fā)明提供的煙草HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，經(jīng)過(guò)下列步驟
1)烤煙提取以甲醇為特征提取劑，具體提取條件是液固比(v/g)為40，提取溫度 30°C，頻率為80 MHz的超聲波中提取50min，離心機(jī)(5，000 g)離心15min ；離心后取上清液，過(guò)0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測(cè)溶液；
2)取步驟1)的待測(cè)溶液進(jìn)行指紋圖譜分析HPLC，具體條件為C18色譜柱(250 mmX 4.6mm，5Mm)，乙腈為流動(dòng)相A，0.2% (ν/ν)的甲酸為流動(dòng)相B ；梯度洗脫程序不同分析時(shí)間時(shí)，流動(dòng)相A與B體積比分別是=Omin時(shí)為0: 100 ；30min時(shí)為25:75 ；45min時(shí)為 40:60 ；55min時(shí)為50:50，保持5 min停止色譜分析，65min時(shí)，A與B的體積比為0:100 ；保持aiiin后運(yùn)行5min ；其體積流量1. 2ml/min，柱溫30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm ；
3)指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立通過(guò)計(jì)算機(jī)編程技術(shù)使原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，時(shí)間段越短，信息量越豐富，根據(jù)計(jì)算要求，選取^iin時(shí)間段來(lái)對(duì)烤煙指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析；
4)主成份一聚類分析法判定煙草品質(zhì)級(jí)別采用主成份分析法對(duì)烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，提取主成份，對(duì)不同樣品的主成份值進(jìn)行聚類分析，即最短距離法，達(dá)到對(duì)不同品質(zhì)的煙葉進(jìn)行分類的目的。實(shí)施例3
供試煙葉品種K326，等級(jí)為C3F，分別取自云南省16個(gè)不同煙葉產(chǎn)區(qū)。所有煙樣在 2010年分別收集上來(lái)，經(jīng)云南省煙葉公司統(tǒng)一復(fù)烤后制成煙絲。將煙絲樣品在60°C下烘干，用植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，用塑料袋密封，置于超低溫冰箱(-80°C)中保存待測(cè)。按照實(shí)施例1的分析方法進(jìn)行分析，得出不同樣品的聚類圖(如圖4)。通過(guò)聚類分析圖4可以看出，在距離為0. 1左右時(shí)，可以將云南省各個(gè)產(chǎn)區(qū)C3F等級(jí)煙葉分成4類第一類煙葉產(chǎn)區(qū)是富源、沾益、馬龍和楚雄；第二類是宣威、會(huì)澤、昆明、保山、麗江和思茅；第三類是麒麟、羅平、紅河和文山；第四類是臨滄和昭通。實(shí)施例4
供試煙葉品種K326，等級(jí)為B2F，分別取自云南省17個(gè)不同煙葉產(chǎn)區(qū)。按照實(shí)施例2 的制備方法和分析方法進(jìn)行分析，得出不同樣品的聚類圖(如圖5)。通過(guò)聚類分析圖5可以看出，在距離為0. 1左右時(shí)，可以將云南省各個(gè)產(chǎn)區(qū)B2F等級(jí)煙葉分成3類第一類煙葉產(chǎn)區(qū)是大理、師宗、楚雄、宣威；第二類是玉溪、昆明、昭通、沾益、文山、麒麟、保山；第三類是陸良、臨滄、紅河、羅平、富源、思茅。實(shí)施例5
供試煙葉品種K326，等級(jí)為X2F，分別取自云南省14個(gè)不同煙葉產(chǎn)區(qū)。按照實(shí)施例1 的制備方法和分析方法進(jìn)行分析，得出不同樣品的聚類圖(如圖6)。通過(guò)聚類分析圖6可以看出，可以將云南省各個(gè)產(chǎn)區(qū)X2F等級(jí)煙葉分成2類第一類煙葉產(chǎn)區(qū)是宣威、易門(mén)、富源、祿勸、臨滄、羅平、楚雄、大理和景東；第二類是保山、紅河、 昭通、馬龍和麒麟。表1烤煙10批次樣品指紋圖譜共有峰的出峰時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種煙草HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，其特征步驟在于1)、烤煙成分提取以甲醇為提取劑，提取條件為液固比v/g為20— 40，提取溫度為 20 30°C，超聲波提取時(shí)間50 60min，離心分離后取上清液過(guò)0. 45Mm的濾膜，濾液為待測(cè)溶液；2)、HPLC指紋圖譜分析取步驟1)的待測(cè)溶液，采用HPLC進(jìn)行指紋圖譜分析，得到烤煙原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，分析條件為C18色譜柱，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0. 08 0. 2%的甲酸；梯度洗脫程序不同分析時(shí)間時(shí)，流動(dòng)相A與B體積比分別是0min時(shí)為0 5 95 100，30min 時(shí)為 20 25 75 80，45min 時(shí)為 30 40 60 70，55min 時(shí)為 50 60:40 50并保持5 min，停止色譜分析；65min時(shí)，A與B的體積比為0 5:95 100 ； 保持aiiin后運(yùn)行5min ；其體積流量范圍0. 8-1.2 ml/min ；柱溫20 30°C，檢測(cè)波長(zhǎng) 250nm ；3)、指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立通過(guò)計(jì)算機(jī)編程技術(shù)，將步驟2)得到的烤煙原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)；4)、主成份一聚類分析法判定煙草品質(zhì)級(jí)別采用主成份分析法對(duì)步驟3)的烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，提取主成份，對(duì)不同樣品的主成份值進(jìn)行聚類分析；或者直接對(duì)步驟3)的烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，以達(dá)到對(duì)不同品質(zhì)的煙葉進(jìn)行分類的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草HPLC指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，其特征在于所述步驟1)的超聲波頻率為20 80MHz，離心機(jī)離心力為5，000 12，000 g，離心時(shí)間8 15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草HPLC指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，其特征在于所述步驟3)的分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)的時(shí)長(zhǎng)為l-5min。
4.一種如權(quán)利要求1所述的方法在烤煙品質(zhì)分類及品牌煙葉識(shí)別中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種煙草HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立方法，經(jīng)過(guò)烤煙成分提取、HPLC指紋圖譜分析，得到烤煙原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)計(jì)算機(jī)編程技術(shù)，將烤煙原始指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，采用主成份分析法對(duì)烤煙指紋圖譜分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，以達(dá)到對(duì)不同品質(zhì)的煙葉進(jìn)行分類的目的。本發(fā)明能客觀的描述烤煙指紋圖譜的信息特征，更科學(xué)地反映煙草的內(nèi)在品質(zhì)，能取代傳統(tǒng)的人工評(píng)吸及普通化學(xué)測(cè)定等方法在烤煙品質(zhì)判定實(shí)際中應(yīng)用，對(duì)于提高煙草品質(zhì)評(píng)價(jià)的科學(xué)性及提高烤煙生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。本發(fā)明的特征是，利用指紋圖譜分時(shí)軟件建立烤煙指紋圖譜的分時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)主成份－聚類分析方法建立烤煙質(zhì)量分類體系。本發(fā)明還公開(kāi)了這一方法在烤煙品質(zhì)分級(jí)、打葉配方及品牌識(shí)別中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102507829SQ20111036563
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者何云燕, 何結(jié)望, 劉磊, 唐徐紅, 尹曉東, 李琳, 涂書(shū)新, 矣躍平, 袁仕信, 閻鐵軍 申請(qǐng)人:云南省煙草煙葉公司