專(zhuān)利名稱(chēng)：Uplc-tqd聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種屬于藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
萬(wàn)古霉素是由一種鏈霉菌產(chǎn)生的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖肽類(lèi)抗生素，其分子式為 C66H74C1N9O24。主要用于葡萄球菌(包括耐青霉素和耐新青霉素株)、難辨梭狀芽胞桿菌等所致的系統(tǒng)感染和腸道感染，如心內(nèi)膜炎、敗血癥、偽膜性腸炎等。萬(wàn)古霉素可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，對(duì)金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等作用強(qiáng)，對(duì)難辨校狀芽孢桿菌、炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌等作用也良好。與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性，極少耐藥菌株。妥布霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，分子式C18H37N509。妥布霉素能夠聯(lián)結(jié)在30S 和50S的聯(lián)結(jié)位置，阻礙70S復(fù)合物的形成，使mRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。主要對(duì)革蘭陰性菌，如綠膿桿菌、大腸桿菌、克雷白桿菌、腸桿菌屬、變形桿菌、枸櫞酸桿菌有效。臨床主要用于敏感細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染，如革蘭陰性菌特別是綠膿桿菌、大腸桿菌及肺炎桿菌等引起的燒傷感染、敗血癥、呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、膽囊膽道感染及軟組織嚴(yán)重感染等。萬(wàn)古霉素可能發(fā)生以下不良反應(yīng)，大多由于過(guò)量或快速滴注引起，并明顯與產(chǎn)品純度不夠有關(guān)。1.過(guò)敏反應(yīng)與“紅頸綜合征”本品過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率約為5%，主要表現(xiàn)為皮疹、發(fā)熱、寒戰(zhàn)及過(guò)敏樣反應(yīng)。靜脈滴注過(guò)量或速度過(guò)快時(shí)可能發(fā)生“紅頸綜合征”，表現(xiàn)為紅斑，面頸部甚至胸部潮紅，藥物熱，低血壓，甚至發(fā)生休克樣反應(yīng)。原因可能與組織胺大量釋放有關(guān)。2.腎損害過(guò)量用藥或腎功能不全時(shí)可能發(fā)生嚴(yán)重腎損害，表現(xiàn)為血尿、尿量過(guò)多或減少，甚至發(fā)生尿毒癥。3.耳毒性耳鳴，聽(tīng)力減退，甚至聽(tīng)力喪失引起不可逆耳聾。耳毒性可在早期產(chǎn)品純度存在問(wèn)題時(shí)報(bào)道較多，現(xiàn)已少見(jiàn)。耳毒性可因合用其它有耳、 腎毒性藥物而加重。4.其它不良反應(yīng)如靜脈炎；肌內(nèi)注射時(shí)局部疼痛，組織壞死；口服給藥治療偽膜性腸炎時(shí)可發(fā)生食欲減退，惡心嘔吐等消化道反應(yīng)。妥布霉素常見(jiàn)的不良反應(yīng)為眼局部的毒副作用與過(guò)敏反應(yīng)，如眼瞼發(fā)癢與紅腫、 結(jié)膜紅斑，發(fā)生率低于3% ；局部應(yīng)用其他氨基糖甙類(lèi)抗生素也會(huì)出現(xiàn)這些不良反應(yīng)。尚無(wú)應(yīng)用妥布霉素出現(xiàn)其他不良反應(yīng)的臨床報(bào)道。但是如果將眼用妥布霉素眼膏與氨基糖甙類(lèi)抗生素全身聯(lián)合用藥，就應(yīng)注意監(jiān)測(cè)血清中總的藥物濃度。創(chuàng)傷性骨髓炎通常由開(kāi)放性骨折的術(shù)后感染，其次為閉合骨折切開(kāi)復(fù)位或其他骨關(guān)節(jié)術(shù)后出現(xiàn)感染所致。因其病情復(fù)雜、病程漫長(zhǎng)，并發(fā)、后遺癥多，臨床治療極為棘手，對(duì)病人的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重后果。目前顯微外科皮瓣植入合并抗生素應(yīng)用是骨髓炎治療的主要手段，皮瓣植入與常規(guī)手術(shù)比具有創(chuàng)傷小、愈合快，并發(fā)后遺癥減少等優(yōu)點(diǎn)，載藥載體一次性給藥大大地降低了抗生素用量，在創(chuàng)傷性骨髓炎的治療中有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
目前萬(wàn)古霉素含量測(cè)定的主要方法有分光光度法，高效液相法，固相萃取高效液相法，高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法，超高液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。妥布霉素的含量測(cè)定方法主要有濁度法，光度法，酸性染料比色法，高效液相蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)，高效液相柱前衍生化法，柱后衍生化高效液相色譜法，離子交換-脈沖積分安倍法，電噴霧離子阱質(zhì)譜法，高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法等。因此，對(duì)聯(lián)合應(yīng)用萬(wàn)古霉素及妥布霉素的骨髓炎患者聯(lián)合應(yīng)用萬(wàn)古霉素及妥布霉素的病，建立同時(shí)測(cè)定引流組織液樣本中的萬(wàn)古霉素及妥布霉素含量的方法，能夠?yàn)樗幬餄舛葯z測(cè)提供方法，達(dá)到提高藥物使用效率，降低毒副反應(yīng)的目的。同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素和妥布霉素含量的方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道及專(zhuān)利公開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的檢測(cè)方法，為臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)提供方案。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種應(yīng)用超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-TQD)，同時(shí)測(cè)定引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，該方法包括以下的步驟
1)對(duì)照品的配制
精密稱(chēng)取萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品，分別置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，備用；
2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
精密稱(chēng)取阿替洛爾對(duì)照品，置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，備用；
3)樣品溶液制備
精密量取骨髓炎患者術(shù)后引流組織液，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，精密加入乙腈沉淀蛋白，充分渦旋，高速離心后，分離上清液；上清液中加入適量二氯甲烷，充分渦旋，進(jìn)行液液萃取，高速離心，定量吸取上清液，加等量純水稀釋?zhuān)吹脴悠啡芤海瑐溆茫?br> 4)流動(dòng)相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸乙腈溶液，作為流動(dòng)相A相，備用；精密量取純水，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸水溶液，作為流動(dòng)相B相，備用；
5)色譜條件的設(shè)置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為2. 1 X IOOmm，填料內(nèi)徑為1. 7 μ m的色譜柱；柱溫為45°C，流動(dòng)相流速為0. 3ml/min ；取步驟1)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，進(jìn)行梯度洗脫；采用二極管整列檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)；
6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化
選擇三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，正離子模式下，采用MRM掃描模式，萬(wàn)古霉素m/z :725-144 ；妥布霉素 m/z =468-324 ；阿替洛爾 m/z :267-74 ；
取步驟1)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，進(jìn)行質(zhì)譜分析，并由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜7)樣品測(cè)定
取步驟3)的樣品溶液，分別定量進(jìn)樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測(cè)定，分別得到萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品、阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物以及樣品的總離子流圖，樣品圖譜中，與萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品以及阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處，為引流液樣品中的待測(cè)萬(wàn)古霉素與妥布霉素，以及定量加入的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物；
8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制
精密吸取步驟1)的對(duì)照品溶液，置于容量瓶中，加純水，稀釋成梯度濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液以及妥布霉素對(duì)照品溶液，備用；
9)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備
取骨髓炎患者空白組織液多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度對(duì)照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標(biāo)樣品溶液，在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定；以萬(wàn)古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程，為萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=35. 522x+0. 1351，r=0. 9981 ；以妥布霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)妥布霉素濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程，為妥布霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=16. 593x-0. 0327， r=0. 9959 ；其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，χ為被測(cè)物質(zhì)量濃度； 10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算
記錄萬(wàn)古霉素，妥布霉素和阿替洛爾的峰面積，計(jì)算萬(wàn)古霉素與內(nèi)標(biāo)阿替洛爾峰面積的比值和妥布霉素與內(nèi)標(biāo)阿替洛爾峰面積的比值，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出萬(wàn)古霉素和妥布霉素的質(zhì)量濃度；即為組織引流液中兩種藥物的局部濃度。作為進(jìn)一步改進(jìn)，上述的步驟5)中流動(dòng)相梯度洗脫程序如下0-1. OOmin， 5%A 相和 95%B 相；1. 00min-4. OOmin, 40%A 相和 60%B 相；4. 00min-4. 50min,99%A 相和 1%B 相；4. 50min-6. 50min,99%A 相和 1%B 相；6. 50min-7. OOmin, 5%A 相和 95%B 相； 7. OOmin-lO. OOmin, 5%A相和95%B相，進(jìn)行梯度洗脫。作為進(jìn)一步改進(jìn)，上述的步驟6)的質(zhì)譜參數(shù)條件如下毛細(xì)管電壓3KV，提取電壓 30V,錐孔電壓3V，源溫度150°C，去溶劑溫度400°C，去溶劑氣750L/hr，錐孔氣50L/hr，碰撞氣流速0. 15mL/min ；妥布霉素二級(jí)質(zhì)譜碰撞能20V，MRM掃描時(shí)間0. 4 Imin ；阿替洛爾二級(jí)質(zhì)譜碰撞能22V，MRM掃描時(shí)間2. 5 3. 5min ；萬(wàn)古霉素二級(jí)質(zhì)譜碰撞能15V，MRM掃描時(shí)間 3. 3 4min。作為進(jìn)一步改進(jìn)，上述的步驟8)定量稀釋成濃度梯度為10mg/mL、5mg/mL、2. 5mg/ mL、lmg/mL、0. 5mg/mL、0. lmg/mL 的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和 lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、 0. lmg/mL,0. 05mg/mL、0. 025mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液。作為進(jìn)一步改進(jìn)，上述的步驟9)中取0. 4mL骨髓炎患者空白組織液6份，編號(hào) 1 6號(hào)，1號(hào)加入0. lmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 025mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;2號(hào)加入0. 5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 05mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;3號(hào)加入lmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. Olmg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;4號(hào)加入2. 5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 25mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;5號(hào)加入5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 5mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50μ L ;6號(hào)加入lOmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L0本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案及步驟，具有以下的特點(diǎn)
1、方法先進(jìn)性
超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)較先進(jìn)的分析檢測(cè)手段，與傳統(tǒng)的液相色譜、氣相色譜、光譜分析方法比，聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，采用MRM掃描模式，大大提高方法靈敏度及準(zhǔn)確度。本發(fā)明首次采用該技術(shù)同時(shí)測(cè)定骨髓炎患者組織液中萬(wàn)古霉素和妥布霉素的含量，方法先進(jìn)可行，能夠?yàn)樵撀?lián)用技術(shù)開(kāi)展多組分化合物的同時(shí)定量測(cè)定應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；
2、方法快捷高效，低損耗
采用超高效液相色譜技術(shù)，所有化合物在^iin內(nèi)完成分析檢測(cè)，快捷方便；流動(dòng)相流速0. 3ml/min，進(jìn)樣量2μ L，大大減少流動(dòng)相消耗，所需的樣品量極少；能夠滿(mǎn)足大批量樣品檢測(cè)的需要，最終實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用；
3、臨床應(yīng)用前景及作用良好
藥物濃度檢測(cè)作為臨床安全、合理用藥的重要手段，能夠提供體內(nèi)藥物濃度數(shù)據(jù)。本方法建立的方法能夠?yàn)槿f(wàn)古霉素及妥布霉素的藥物濃度監(jiān)測(cè)提供切實(shí)可行的方法，臨床應(yīng)用前景良好，能夠?yàn)榕R床合理用藥，提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費(fèi)用，發(fā)揮積極的作用。


圖1為對(duì)照品紫外色譜圖與質(zhì)量色譜圖。圖2為樣品紫外色譜圖與質(zhì)量色譜圖。圖3為妥布霉素質(zhì)譜圖。圖4為萬(wàn)古霉素質(zhì)譜圖。圖5為內(nèi)標(biāo)物阿替洛爾質(zhì)譜圖。圖6為妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。圖7為萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，該方法包括以下的步驟。
1)對(duì)照品的配制
精密稱(chēng)取萬(wàn)古霉素對(duì)照品lOOmg、妥布霉素對(duì)照品10mg，分別置于IOmL容量瓶中，加入純水溶解，分別定量配成質(zhì)量濃度為lOmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液，備用。2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
精密稱(chēng)取阿替洛爾對(duì)照品5. Omg，置于IOmL容量瓶中，加入純水溶解，精密吸取上述溶液0. anl，置于IOmL容量瓶中，加入純水溶解，配成質(zhì)量濃度為0. Olmg/mL的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)溶液，備用。
3)樣品溶液制備
精密量取骨髓炎患者術(shù)后引流組織液0. 5mL，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2) 的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)溶液25 μ L，渦旋混勻，精密加入乙腈0. 5mL沉淀蛋白，充分渦旋，14000r/ min高速離心Smin后，分離上清液；上清液中加入0. 5mL 二氯甲烷，充分渦旋，進(jìn)行液液萃取，14000r/min高速離心8min，吸取上清液200 μ L，加等量純水稀釋?zhuān)吹脴悠啡芤?，備用?)流動(dòng)相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸乙腈溶液，作為流動(dòng)相A相，備用；精密量取純水，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸水溶液，作為流動(dòng)相B相，備用。5)色譜條件的設(shè)置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為2. IXlOOmm，填料內(nèi)徑為 1. 7 μ m的色譜柱；柱溫為4 5 °C，流動(dòng)相流速為0. 3mL/m i η ；取步驟1)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣2 μ L，優(yōu)化的流動(dòng)相梯度洗脫程序0-1.00min，5%A相和 95%B 相；1.00min-4.00min，40%A 相和 60%B 相；4. OOmin-4. 50min，99%A 相和 1%B 相；4. 50min-6. 50min,99%A 相和 1%B 相；6. 50min-7. 00min,5%A 相和 95%B 相； 7. OOmin-lO. OOmin, 5%A相和95%B相，進(jìn)行梯度洗脫；采用二極管整列檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)。6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化
選擇三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Waters TQD)，正離子模式下，采用MRM掃描模式，萬(wàn)古霉素m/ ζ 725 144 ；妥布霉素m/z :468 324 ；阿替洛爾m/z :267 74。取步驟1)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣2 μ L，在優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)條件下(毛細(xì)管電壓3KV，提取電壓30V，錐孔電壓3V，源溫度150°C，去溶劑溫度400°C，去溶劑氣750L/hr，錐孔氣50L/hr，碰撞氣流速0. 15mL/min。妥布霉素二級(jí)質(zhì)譜碰撞能20V，MRM 掃描時(shí)間0. 4 Imin ；阿替洛爾二級(jí)質(zhì)譜碰撞能22V，MRM掃描時(shí)間2. 5 3. 5min ；萬(wàn)古霉素二級(jí)質(zhì)譜碰撞能15V，MRM掃描時(shí)間3. 3 ％iin。)進(jìn)行質(zhì)譜分析，由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量色譜圖。7)樣品測(cè)定
取步驟3)的樣品溶液，分別進(jìn)樣2 μ L，在步驟5)與步驟6)的條件下，測(cè)定，分別得到萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品、阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物以及樣品的質(zhì)量色譜圖(mass chromatogram), 樣品色譜中，與萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品以及阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處，為引流液樣品中的待測(cè)萬(wàn)古霉素與妥布霉素，以及定量加入的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物；且各物質(zhì)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖一致。8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制
各精密吸取步驟1)的對(duì)照品溶液，置于容量瓶中，加純水，定量稀釋成濃度梯度為 10mg/mL、5mg/mL、2. 5mg/mL、lmg/mL、0. 5mg/mL、0. lmg/mL 的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液以及 lmg/ mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. lmg/mL、0. 05mg/mL、0. 025mg/mL 的妥布霉素對(duì)照品溶液，配對(duì)備用。9)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備
取0. 4mL骨髓炎患者空白組織液6份，編號(hào)1 6號(hào)，1號(hào)加入0. lmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 025mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;2號(hào)加入0. 5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 05mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;3號(hào)加入lmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 01mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;4號(hào)加入2. 5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 25mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;5號(hào)加入5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 5mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;6號(hào)加入10mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L。按照步驟3)方法操作，得到梯度加標(biāo)樣品溶液；在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定。以萬(wàn)古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程，為萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=35. 522χ+0. 1351 (r=0. 9981)； 以妥布霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)妥布霉素濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程， 為妥布霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=16. 593x-0. 0327 (r=0. 9959)。其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，χ為被測(cè)物質(zhì)量濃度。
10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算
記錄萬(wàn)古霉素，妥布霉素和阿替洛爾的峰面積，計(jì)算萬(wàn)古霉素與內(nèi)標(biāo)阿替洛爾峰面積的比值和妥布霉素與內(nèi)標(biāo)阿替洛爾峰面積的比值，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出萬(wàn)古霉素和妥布霉素的質(zhì)量濃度。即為組織引流液中兩種藥物的局部濃度。
權(quán)利要求
1.超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)對(duì)照品的配制精密稱(chēng)取萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品，分別置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，備用；2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱(chēng)取阿替洛爾對(duì)照品，置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，備用；3)樣品溶液制備精密量取骨髓炎患者術(shù)后引流組織液，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，精密加入乙腈沉淀蛋白，充分渦旋，高速離心后，分離上清液；上清液中加入適量二氯甲烷，充分渦旋，進(jìn)行液液萃取，高速離心，定量吸取上清液，加等量純水稀釋?zhuān)吹脴悠啡芤?，備用?)流動(dòng)相溶液的配制精密量取色譜純乙腈，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸乙腈溶液，作為流動(dòng)相A相，備用；精密量取純水，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸水溶液，作為流動(dòng)相B相，備用；5)色譜條件的設(shè)置選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為2. 1 X IOOmm，填料內(nèi)徑為1. 7 μ m的色譜柱；柱溫為45°C，流動(dòng)相流速為0. 3ml/min ；取步驟1)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，進(jìn)行梯度洗脫；采用二極管整列檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)；6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化選擇三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，正離子模式下，采用MRM掃描模式，萬(wàn)古霉素m/z :725-144 ；妥布霉素 m/z =468-324 ；阿替洛爾 m/z :267-74 ；取步驟1)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，進(jìn)行質(zhì)譜分析，并由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖；7)樣品測(cè)定取步驟3)的樣品溶液，分別定量進(jìn)樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測(cè)定，分別得到萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品、阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物以及樣品的總離子流圖，樣品圖譜中，與萬(wàn)古霉素、妥布霉素對(duì)照品以及阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處，為引流液樣品中的待測(cè)萬(wàn)古霉素與妥布霉素，以及定量加入的阿替洛爾內(nèi)標(biāo)物；8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制精密吸取步驟1)的對(duì)照品溶液，置于容量瓶中，加純水，稀釋成梯度濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液以及妥布霉素對(duì)照品溶液，備用；9)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備取骨髓炎患者空白組織液多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度對(duì)照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標(biāo)樣品溶液，在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定；以萬(wàn)古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程，為萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=35. 522x+0. 1351，r=0. 9981 ；以妥布霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)妥布霉素濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程，為妥布霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=16. 593x-0. 0327， r=0. 9959 ；其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，χ為被測(cè)物質(zhì)量濃度； 10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算記錄萬(wàn)古霉素，妥布霉素和阿替洛爾的峰面積，計(jì)算萬(wàn)古霉素與內(nèi)標(biāo)阿替洛爾峰面積的比值和妥布霉素與內(nèi)標(biāo)阿替洛爾峰面積的比值，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出萬(wàn)古霉素和妥布霉素的質(zhì)量濃度；即為組織引流液中兩種藥物的局部濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟5)中流動(dòng)相梯度洗脫程序如下 0-1. 00min，5%A 相和 95%Β 相；1. 00min-4. OOmin，40%A 相和 60%B 相；4. 00min-4. 50min,99%A 相和 1%B 相；4. 50min-6. 50min,99%A 相和 1%B 相；6. 50min-7. OOmin, 5%A 相和 95%B 相； 7. OOmin-lO. OOmin, 5%A相和95%B相，進(jìn)行梯度洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟6)的質(zhì)譜參數(shù)條件如下毛細(xì)管電壓3KV，提取電壓30V，錐孔電壓3V，源溫度150°C，去溶劑溫度400°C，去溶劑氣750L/hr，錐孔氣50L/hr，碰撞氣流速0. 15mL/min ；妥布霉素二級(jí)質(zhì)譜碰撞能20V，MRM掃描時(shí)間0. 4 Imin ；阿替洛爾二級(jí)質(zhì)譜碰撞能22V，MRM掃描時(shí)間2. 5 3. 5min ；萬(wàn)古霉素二級(jí)質(zhì)譜碰撞能15V, MRM掃描時(shí)間3. 3 4min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟8)定量稀釋成濃度梯度為IOmg/ mL、5mg/mL、2. 5mg/mL、lmg/mL、0. 5mg/mL、0. lmg/mL 的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和 lmg/mL、 0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. lmg/mL、0. 05mg/mL、0. 025mg/mL 的妥布霉素對(duì)照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟9)中取0. 4mL骨髓炎患者空白組織液6份，編號(hào)1 6號(hào)，1號(hào)加入0. lmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 025mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;2號(hào)加入0. 5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 05mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;3號(hào)加入lmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. Olmg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;4號(hào)加入2. 5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 25mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L ;5號(hào)加入5mg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和0. 5mg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50μ L ;6號(hào)加入lOmg/mL的萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對(duì)照品溶液各50 μ L0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種屬于藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的檢測(cè)方法。超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定組織引流液中萬(wàn)古霉素與妥布霉素含量的方法，該方法包括以下的步驟1)對(duì)照品的配制；2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制；3)樣品溶液制備；4)流動(dòng)相溶液的配制；5)色譜條件的設(shè)置；6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化；7)樣品測(cè)定；8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制；9)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備；10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算。本發(fā)明具有以下的特點(diǎn)1、方法先進(jìn)性；2、方法快捷高效，低損耗；3、臨床應(yīng)用前景及作用良好。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102539573SQ20121000385
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳人杰, 壽旦, 張春, 沈立鋒, 董宇 申請(qǐng)人:浙江省中醫(yī)藥研究院