專利名稱：微生物樣品快速檢測方法及其實施檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物樣品檢測技術(shù)，特別是涉及利用介孔生物芯片對生物樣品進行快速檢測的方法，以及用于實施該方法的微生物樣品快速檢測裝置。
背景技術(shù)：
病原微生物是看不見的危害，一直是人們所關(guān)注的熱點問題，其污染是一個重大的安全問題，嚴重影響人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計，全球每年有數(shù)十億人由于病原微生物而感染疾病。發(fā)達國家發(fā)生率也相當高，平均每年有1/3的人群感染。我國江蘇、安徽等地2001年發(fā)生大腸桿菌0157 H7污染，造成2萬人中毒，177人死亡的后果。沙門氏菌每年都會引起的數(shù)以百人的中毒事件爆發(fā)。上世紀80年代的上海，因為生吃毛蚶造成30萬 人罹患甲肝。據(jù)國家衛(wèi)生部統(tǒng)計，僅2011年第三季度微生物性食物中毒事件就發(fā)生35起，中毒人數(shù)達2279人，死亡5人，分別占總報告起數(shù)和中毒人數(shù)的47. 9%和70. 7%。引起中毒的主要微生物包括副溶血性弧菌、葡萄球菌、沙門氏菌和蠟樣芽胞桿菌。瘦肉精、三聚氰胺等化學污染物固然可怕，可由致病微生物引起的食源性疾病確是食品安全的頭號問題。病原微生物的檢測技術(shù)是預(yù)防和控制致病微生物引起的食源性疾病的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。常規(guī)的檢測技術(shù)大多依靠培養(yǎng)目標微生物的方法來確定樣品是否受到此微生物的污染，包括增菌、分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定等步驟。這種方法準確性、靈敏性都很高，但涉及的實驗較多，操作煩瑣，所需時間長，自動化程度低，而且一般一個檢驗程序只針對一種菌，不適于批量、大范圍快速檢測。為克服其不足，人們開發(fā)出了多種基于不同原理的新型快速檢測病原微生物的技術(shù)，這主要有聚合酶鏈式反應(yīng)法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法等。其中聚合酶鏈式反應(yīng)是一種體外選擇性擴增DNA或RNA的技術(shù)，即模板DNA引物以及4種脫氧核糖核苷三磷酸在DNA聚合酶的催化作用下所發(fā)生的酶促集合反應(yīng)，由變性、退火、延伸3個步驟組成，應(yīng)用該技術(shù)能在短時間內(nèi)對特定DNA序列作百萬倍擴增?；驍U增的技術(shù)設(shè)備由三部分構(gòu)成①模板DNA制備所需設(shè)備，主要為高速微量離心機或高速冷凍離心機PCR基因擴增儀DNA擴增結(jié)果判讀和測定設(shè)備，主要有水平低壓電泳儀、PCR核酸電泳槽以及紫外透射儀和DNA微量熒光計等，設(shè)備大，價格貴，不適應(yīng)于野外作業(yè)。病原微生物檢測中運用的PCR技術(shù)，大多是基于DNA水平的檢測技術(shù)，雖然快速特異，靈敏度較高，但最大問題是核酸污染和死菌造成假陽性和定量困難，其測定結(jié)果表現(xiàn)為有或無，僅可定性判別，無法定量分析。酶聯(lián)免疫吸附法，使用酶標儀作為配套儀器，具有很強的敏感性和特異性，但是需要反復(fù)洗板，操作復(fù)雜，費時費力。膠體金免疫層析法簡便快速，只需將處理好的樣品加入金標定量儀中試紙條的樣品孔內(nèi)即可判定結(jié)果，但是存在敏感性低的缺點，一般是定性測定，不能對相應(yīng)的檢測板讀出數(shù)據(jù)，優(yōu)良的金標診斷試劑也只能做到半定量。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的微生物快速檢測技術(shù)的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的旨在提供一種新的微生物快速檢測方法以及用于其實施的快速檢測裝置，以克服現(xiàn)有微生物快速檢測技術(shù)存在的只能進行定性測定，檢測敏感性低，操作復(fù)雜，費時費力，設(shè)備大，價格貴，不適應(yīng)于野外作業(yè)等不足。本發(fā)明解決其技術(shù)問題的微生物樣品快速檢測方法，主要包括以下工藝步驟(I)將抗體固定在介孔生物芯片微孔孔道面上；(2)將待測溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，使待測溶液所含待測物與固定在微孔孔道面上的抗體反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物，富集在微孔道內(nèi)；(3)將緩沖溶液泵入流過介孔生物芯片微孔孔道，對富集在微孔孔道內(nèi)的抗原-抗體復(fù)合物進行沖洗，洗除雜質(zhì)；(4)將含有熒光標記抗體或酶標記抗體的溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，使溶液中的標記抗體與抗原-抗體復(fù)合物中的抗原進行免疫反應(yīng)，形成夾心式結(jié)構(gòu)的 免疫復(fù)合物負載在抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物上；當標記抗體為酶標記抗體，則需在免疫反應(yīng)后泵入催化反應(yīng)溶液進行酶催化顯色反應(yīng)，形成有色物質(zhì)吸收檢測光，或者泵入酶促反應(yīng)發(fā)光劑，進行酶催化發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生化學發(fā)光；(5)將緩沖溶液泵入流過介孔生物芯片微孔孔道，沖洗游離的標記抗體；(6)用測量光對介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物進行照射，激發(fā)熒光標記抗體發(fā)出熒光，或者酶催化顯色反應(yīng)形成有色物質(zhì)吸收測量光形成透射光，或者酶催化發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生化學發(fā)光，介孔生物芯片出來的檢測光由透鏡聚焦耦合到光纖，傳輸?shù)焦鈾z測器進行檢測處理，經(jīng)檢測處理后的信號傳輸?shù)焦庑盘柼幚砜刂破?，輸出待測生物樣品的數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對待測物的定量測定在本發(fā)明的上述微生物樣品快速檢測方法中，步驟(2)中的反應(yīng)條件pH為7. (Γ7. 6，溫度為2(T42°C ;步驟(3)中的操作條件溫度為4 42°C ;步驟(4)中的免疫反應(yīng)條件PH為7. (Γ7. 6，溫度為2 42°C，酶催化顯色反應(yīng)條件pH為7. 0^7. 6，溫度為2(T42°C;步驟(5)中的反應(yīng)條件pH為7.0 7.6，溫度為2 42°C。反應(yīng)條件pH為7. 0 7· 6，溫度為20^42 0C ο在本發(fā)明的上述微生物樣品快速檢測方法中，所述抗體可通過物理吸附、化學鍵合和生物親和中之一或者組合的方式固定在介孔生物芯片微孔孔道面上。本發(fā)明的上述微生物樣品快速檢測方法可通過下述檢測裝置來實施。本發(fā)明提供的微生物樣品快速檢測裝置，其結(jié)構(gòu)主要包括測量光源、進樣泵、介孔生物芯片傳感器、出射光聚焦透鏡、光檢測器和信號處理控制器，所述介孔生物芯片傳感器由介孔生物芯片和位于介孔生物芯片兩側(cè)的進液室與集液室構(gòu)成，介孔生物芯片上的微孔孔道將進液室與集液室連通，進液室殼體設(shè)計有溶液進口接管，集液室殼體設(shè)計有排液出口接管，進樣泵出口與進液室殼體上的溶液進口接管連通，測量光源和出射光聚焦透鏡分別與介孔生物芯片對應(yīng)設(shè)置，出射光聚焦透鏡通過光纖與光檢測器連接，光檢測器與光信號處理器信號連接，由測量光源發(fā)射出的測量光從介孔生物芯片側(cè)壁進入介孔生物芯片照射介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物，激發(fā)的熒光、化學發(fā)光或者對入射光進行吸收產(chǎn)生的透射光從介孔生物芯片側(cè)壁出來，進入出射光聚焦透鏡，經(jīng)聚焦耦合進入光纖傳輸?shù)焦鈾z測器，將檢測到的光信號傳輸?shù)焦庑盘柼幚砜刂破?，?jīng)處理輸出待測生物樣品的生物數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對待測物的定量測定。
本發(fā)明提供的微生物樣品快速檢測裝置，可設(shè)置檢測用液儲槽，也可以不設(shè)置檢測用液儲槽。當不設(shè)置檢測用液儲槽時，裝置進樣泵的進口與另外配置的檢測用液儲存器連接，將檢測用液泵入介孔生物芯片傳感器。不設(shè)置檢測用液儲槽，檢測裝置結(jié)構(gòu)緊湊，但使用不夠方便。最好是設(shè)置檢測用液儲槽。檢測用液儲槽可設(shè)置為I個，也可設(shè)置為4個。檢測用液儲槽當設(shè)置為I個時，檢測用液中的待測溶液、緩沖溶液、含有標記抗體的溶液、催化反應(yīng)溶液分別按測定要求按一定順序依次注入檢測用液儲槽，由進樣泵分別泵入到介孔生物芯片傳感器。當標記抗體為熒光標記抗體時，則不需注入催化反應(yīng)溶液。最好是并聯(lián)設(shè)置4個檢測用液儲槽，各儲槽的出口通過連接管、控制閥分別與進樣泵的進口連接，依次分別注入待測溶液、緩沖溶液、含有標記抗體的溶液和催化反應(yīng)溶液，由進樣泵分別泵入到介孔生物芯片傳感器。當標記抗體為熒光標記抗體不需注入催化反應(yīng)溶液時，可閑置一個檢測用液儲槽。不同溶液泵入介孔生物芯片傳感器的間隔時間，取決于前一過程進行的情況，前一過程進行的快，間隔的時間就短，前一過程進行的慢，間隔的時間就長。本發(fā)明提供的微生物樣品快速檢測裝置可設(shè)置廢液池，也可以不設(shè)置廢液池。當不設(shè)置廢液池時，介孔生物芯片傳感器集液室排液接管可與另外配置的廢液槽連接。同樣 的道理，不設(shè)置廢液池，檢測裝置結(jié)構(gòu)緊湊，但使用不夠方便。最好是設(shè)置廢液池，廢液池進口通過連接管與集液室排液出口接管連接。本發(fā)明提供的微生物樣品快速檢測裝置，其介孔生物芯片傳感器的進液室與集液室的殼體，可均設(shè)計為圓筒形結(jié)構(gòu)、圓錐筒結(jié)構(gòu)，甚至為矩形筒結(jié)構(gòu)，或兩者為不同形狀的結(jié)構(gòu)。最好均設(shè)計為圓錐筒結(jié)構(gòu)，大端分別與介孔生物芯片兩側(cè)邊緣相聯(lián)接，進液室殼體錐端設(shè)置溶液進口接管，集液室殼體錐端設(shè)置有排液出口接管。在本發(fā)明提供的微生物樣品快速檢測裝置中，構(gòu)成介孔生物芯片傳感器的介孔生物芯片的形狀，考慮到加工的便利，通常設(shè)計為圓柱盤形。也可以是其他形狀，其中優(yōu)選狹長的矩形，以提高介孔生物芯片的利用率。所述介孔生物芯片可為整體結(jié)構(gòu)，也可為組合結(jié)構(gòu)。整體結(jié)構(gòu)的介孔生物芯片由整體介孔材料片制作，組合結(jié)構(gòu)介孔生物芯片由介孔生物芯片本體和分布在介孔生物芯片本體不同區(qū)域的介孔材料片構(gòu)成。將介孔生物芯片設(shè)計為組合結(jié)構(gòu)，可在不同的區(qū)域固定不同的抗體，進行不同的實驗。介孔生物芯片優(yōu)選整體結(jié)構(gòu)。介孔材料片由具有極高的比表面積、高度有序三維孔道結(jié)構(gòu)的介孔材料制作。介孔材料的選擇，首先要考慮其光學性質(zhì)，如透光性和背景熒光等。制作介孔生物芯片的介孔材料優(yōu)選娃基質(zhì)介孔材料、參雜娃基介孔材料、_■氧化欽基介孔材料、碳招憐酸基介孔材料、鋁基質(zhì)介孔材料或其他介孔材料中的一種，其他材料，如玻璃、石英、聚合物等如只要適用于光學檢測，也可以用來做基材。介孔材料中的微孔孔徑，一般不大于500Mm，通常為
20 300觸。介孔生物芯片傳感器進液室室殼與集液室室殼的制作材料，優(yōu)選聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、環(huán)氧樹脂、有機硅樹脂、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、氟樹脂、不飽和聚酯樹脂、三聚氰胺-甲醛樹脂、聚苯醚、聚砜、聚甲醛、尼龍、酰胺聚丙烯、聚氯乙烯、ABS樹脂等聚合物以及硅片、玻璃、石英、陶瓷等材料中的一種或者多種材料復(fù)合。在本發(fā)明提供的微生物樣品快速檢測裝置中，檢測用液進入通過介孔生物芯片的進樣種類、流速、流量和時間，由控制處理器通過控制閥和進樣泵來控制，控制閥按測試需要分別控制進樣種類，即控制待測樣品溶液、緩沖溶液、標記抗體溶液的進樣，通過進樣泵控制進樣的流速、流量和時間。本發(fā)明利用介孔材料制作介孔生物芯片，極大地提高了反應(yīng)表面積，提高了靈敏度。本發(fā)明事先在介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)表面固定有特異性的抗體，在待測溶液樣品泵入流過介孔生物芯片時，其所含病原微生物與固定在介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的抗體反應(yīng)從而被捕獲，實現(xiàn)待測微生物與溶液的分離、富集；然后泵入流過含有酶、或者熒光試劑標記的抗體溶液，標記抗體與待測微生物發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，在介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)形成夾心結(jié)構(gòu)(表面固定的抗體-微生物-酶或者熒光試劑標記的抗體)的免疫復(fù)合物，對介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的復(fù)合物實施測量光照射，激發(fā)復(fù)合物產(chǎn)生相應(yīng)的光效應(yīng)，即夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物中標記的熒光試劑受測量光激發(fā)產(chǎn)生熒光，或者夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物中標記的酶催化顯色反應(yīng)產(chǎn)生測量光吸收，或者酶催化發(fā)光劑反應(yīng)，產(chǎn)生化學發(fā)光，然后利用光檢測器對從介孔生物芯片出來的透射光、化學發(fā)光或熒光信號進行檢測，再通過光信號處理控 制器處理，輸出待測物的生物數(shù)據(jù)。即通過檢測酶催化反應(yīng)產(chǎn)物對光的吸收、化學發(fā)光強度或熒光標記抗體的熒光強度，實現(xiàn)對病原微生物或其它微生物物質(zhì)的檢測。本發(fā)明具有以下十分突出的有益技術(shù)效果I、由于本發(fā)明檢測生物樣品的介孔生物芯片傳感器所使用的芯片材料為介孔材料，能夠提供極高的比表面積，增大了抗體的固定量，因此最終增大了介孔生物芯片生物傳感器檢測的靈敏度和線性范圍。2、本發(fā)明用于快速檢測生物樣品的所述介孔生物芯片，其所具有的三維孔道結(jié)構(gòu)，增大了檢測物質(zhì)在芯片內(nèi)的通量，縮短了檢測時間和操作步驟。3、本發(fā)明用于快速檢測生物樣品的所述介孔生物芯片，其體內(nèi)的微孔孔道可以看成是毛細管的集成，因此抗體溶液可以通過毛細作用進入到孔道內(nèi)，這樣的芯片結(jié)構(gòu)使得抗體溶液的蒸發(fā)速度緩慢，便于抗體的固定，而且對比平板結(jié)構(gòu)，孔道內(nèi)相同體積的液體流經(jīng)的面積要更小，極大提高了價格昂貴的抗體溶液的固定效率，當然檢測的成本也隨之降低。本發(fā)明還具有其他一些方面的有益技術(shù)效果。


圖I為本發(fā)明的快速檢測生物樣品裝置的一種實施方式的整體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明的快速檢測生物樣品裝置中的介孔生物芯片傳感器的一種結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明的快速檢測生物樣品裝置中的介孔生物芯片傳感器的另一種結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為本發(fā)明利用介孔生物芯片快速檢測生物樣品的原理示意圖。在上述附圖中各圖示標號標識對象分別為1 一待測樣品溶液儲槽、2—緩沖溶液儲槽、3—標記抗體溶液儲槽、4 一催化反應(yīng)溶液儲槽、5—多路控制閥、6—進樣泵、7—光源、8—介孔生物芯片、9一出射光聚焦透鏡、10—光檢測器、11一光信號處理控制器、12—廢液池、13—管道一、14 一管道二、15—管道三、16—管道四、17—管道五、18—測量光、19 一管道六、20—熒光、21一光纖、22—信號傳輸線、23—溶液進口接管、24—溶液出口接管、25—集液室、26—微孔孔道、27—抗體、28—待測物質(zhì)(抗原)、29—標記抗體、30—管道七、31—透射光。
具體實施例方式下面結(jié)合

，給出本發(fā)明的實施例，并通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，以便于人們對本發(fā)明的理解。實施例I本實施例中，用于快速檢測生物樣品的檢測裝置的結(jié)構(gòu)如圖I和圖3所示，其檢測原理如附圖4所示。檢測裝置的結(jié)構(gòu)主要包括測量光源7、待測樣品溶液儲槽I、緩沖溶液儲槽2、標記抗體溶液儲槽3、催化反應(yīng)溶液儲槽4、多路控制閥5、進樣泵6、介孔生物芯片傳感器、廢液池12、出射光聚焦透鏡9、光檢測器10和信號處理控制器11，所述介孔生物芯片 傳感器由介孔生物芯片8和位于介孔生物芯片兩側(cè)的進液室與集液室25構(gòu)成，介孔生物芯片上的微孔孔道26將進液室與集液室連通，進液室殼體和集液室殼體均為錐筒結(jié)構(gòu)，大端分別與介孔生物芯片兩側(cè)邊緣相聯(lián)接，進液室殼體錐端設(shè)置溶液進口接管23，集液室殼體錐端設(shè)置有排液出口接管24。所述介孔生物芯片為圓柱盤狀的整體結(jié)構(gòu)，如附圖3所示，由硅基質(zhì)介孔材料制作，微孔孔道直徑約為50-300Mm。待測樣品溶液儲槽I、緩沖溶液儲槽
2、含有酶標記抗體溶液儲槽3和催化反應(yīng)溶液儲槽4并聯(lián)設(shè)置，分別通過管道一 13、管道二 14、管道三15和管道四16與多路控制閥5進口連通，多路控制閥5的出口通過管道五17與介孔生物芯片傳感器的進液室溶液進口接管23連通，介孔生物芯片傳感器的集液室排液出口接管24通過管道六19與廢液池連通。測量光源7和出射光聚焦透鏡9相對設(shè)置在介孔生物芯片8的側(cè)面壁上，出射光聚焦透鏡9通過光纖21與光檢測器10連接，光檢測器通過信號傳輸線22與光信號處理器11連接，測量光18從介孔生物芯片的側(cè)壁入射，從介孔生物芯片另一方向側(cè)壁透出進入聚焦透鏡9，經(jīng)聚焦透鏡聚焦耦合后的透射光31通過光纖進入光檢測器，經(jīng)光檢測器分光、選擇響應(yīng)信號處理后的檢測光，由信號傳輸線22傳輸至光信號處理控制器11，進行光信號的數(shù)據(jù)處理和存儲，輸出待測生物樣品的生物數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對待測物的定量測定。測量過程如下先將生物素標記的大腸埃希桿菌06抗體通過生物素-親和素反應(yīng)的方式固定在親和素修飾的介孔生物芯片微孔孔道面上，用牛血清白蛋白封閉，沖洗后，將待測樣品溶液注入其儲槽1，緩沖溶液，即PBS (O. 15M, pH=7. 4，)注入其儲槽2，含有辣根過氧化物酶標記的大腸埃希桿菌06抗體溶液注入其儲槽3，催化反應(yīng)溶液注入其儲槽4，利用多路控制閥5按一定順序?qū)⒋郎y樣品溶液儲槽、新鮮配制的催化反應(yīng)溶液(配比為四甲基聯(lián)苯胺(IOmg / 5ml無水乙醇)5ml、檸檬酸緩沖液(PH5. 5) 100ml、O. 75% H2O2 320微升)儲槽4、酶標記抗體溶液儲槽、催化反應(yīng)溶液儲槽與介孔生物芯片傳感器的進液室溶液進口接管23連通，同時將介孔生物芯片傳感器的集液室排液出口接管23與廢液池12連通。首先將待測溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，使待測溶液所含大腸埃希桿菌06與固定在微孔孔道面上的抗體反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物，富集在微孔道內(nèi)。本過程的反應(yīng)條件，溫度約37°C左右，pH約為7. 4。該過程進行3(Γ60分鐘后，將緩沖溶液泵入流過介孔生物芯片微孔孔道，對富集在微孔孔道內(nèi)的抗原-抗體復(fù)合物進行沖洗，洗除雜質(zhì)。本過程的操作條件，溫度約為20°C左右。該過程進行5 10分鐘后，將標記抗體溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，使溶液中的標記抗體與抗原-抗體復(fù)合物進行免疫反應(yīng)，形成抗體-抗原-標記抗體夾心式結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物；本過程的操作條件，溫度約37°C左右，pH約為7. 4。該過程進行3(Γ60分鐘后，將緩沖溶液泵入流過介孔生物芯片微孔孔道進行沖洗，本過程的操作條件，溫度20°C左右，pH約為7. 4。該過程進行5 10分鐘后，泵入催化反應(yīng)溶液進行催化反應(yīng)，生成藍色物質(zhì)，最后泵入2M硫酸溶液，藍色物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色產(chǎn)物，本過程的操作條件，溫度約37°C左右，pH約為5. 5，該過程進行1(Γ30分鐘。反應(yīng)過程的原理如附圖3所示。之后開啟測量光源7和出射光聚焦透鏡9，啟動光檢測器10和光信號處理控制器11，即可對測生物樣品進行定量測定。光源7發(fā)出的入射光18從介孔生物芯片8的側(cè)壁進入，照射介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的顯色反應(yīng)后黃色產(chǎn)物，測量光穿過芯片產(chǎn)生吸收效應(yīng)，穿過復(fù)合物從介孔生物芯片另一方向側(cè)壁透出的透射光31由聚焦透鏡9聚焦后耦合到光纖21，由光纖傳輸至光檢測器10，經(jīng)光檢測器分光、選擇響應(yīng)信號等檢測處理后，再由信號傳輸線 22傳輸至光信號處理控制器11，進行光信號的數(shù)據(jù)處理和存儲，輸出待測生物樣品的生物數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對大腸埃希桿菌06的定量測定。實施例2本實施例用于快速檢測生物樣品的檢測裝置和檢測方法與實施例I基本相同，所不同的地方是用于快速檢測生物樣品的檢測裝置只設(shè)置了一個檢測用液儲槽，所述介孔生物芯片為組合結(jié)構(gòu)，如附圖2所示，由介孔生物芯片本體和均勻分布固定在介孔生物芯片本體圓周6個區(qū)域的介孔材料片構(gòu)成，在不同區(qū)域介孔材料片的微孔孔道面上固定不同的抗原。檢測以熒光試劑作為標記抗體。檢測進行時，先將待測樣品溶液注入待測樣品溶液儲槽，然后將待測溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，在待測溶液所含待測物與固定在微孔孔道面上的免疫反應(yīng)結(jié)束后，緩沖溶液注入緩沖液儲槽，然后泵入緩沖溶液對微孔孔道面上的抗原-抗體復(fù)合物進行沖洗，沖洗結(jié)束后，再將含有熒光標記抗體的溶液注入標記抗體溶液儲槽，然后泵入芯片，使溶液中的熒光標記抗體與抗原-抗體復(fù)合物進行免疫反應(yīng)，形成抗體-抗原-熒光標記抗體復(fù)合物，最后泵入緩沖溶液進行清洗，不設(shè)催化反應(yīng)溶液儲槽，裝置整體結(jié)構(gòu)更為緊奏。光源7發(fā)出的入射光18從介孔生物芯片8的側(cè)壁進入，照射介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的抗體-抗原-熒光標記抗體復(fù)合物，激發(fā)熒光標記抗體產(chǎn)生的熒光，從介孔生物芯片側(cè)壁透出，熒光20由聚焦透鏡聚焦后耦合到光纖21，由光纖傳輸至光檢測器10，經(jīng)光檢測器分光、選擇響應(yīng)信號等檢測處理后，再由信號傳輸線22傳輸至光信號處理控制器11，進行光信號的數(shù)據(jù)處理和存儲，輸出待測生物樣品的生物數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對大腸埃希桿菌06的定量測定。
權(quán)利要求
1.一種微生物樣品快速檢測方法，其特征在于包括以下工藝步驟 (1)將抗體固定在介孔生物芯片微孔孔道面上； (2)將待測溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，使待測溶液所含待測物與固定在微孔孔道面上的抗體反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物，富集在微孔道內(nèi)； (3)將緩沖溶液泵入流過介孔生物芯片微孔孔道，對富集在微孔孔道內(nèi)的抗原-抗體復(fù)合物進行沖洗，洗除雜質(zhì)； (4)將含有熒光標記抗體或酶標記抗體的溶液泵入流過介孔生物芯片的微孔孔道，使溶液中的標記抗體與抗原-抗體復(fù)合物中的抗原進行免疫反應(yīng)，形成夾心式結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物負載在抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物上；當標記抗體為酶標記抗體，則需在免疫反應(yīng)后泵入催化反應(yīng)溶液進行酶催化顯色反應(yīng)，形成有色物質(zhì)吸收檢測光，或者泵入酶促反應(yīng)發(fā)光劑，進行酶催化發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生化學發(fā)光； (5)將緩沖溶液泵入流過介孔生物芯片微孔孔道，沖洗游離的標記抗體； (6)用測量光對介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物進行照射，激發(fā)熒光標記抗體發(fā)出熒光，或者酶催化顯色反應(yīng)形成有色物質(zhì)吸收測量光形成透射光，或者酶催化發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生化學發(fā)光，介孔生物芯片出來的檢測光由透鏡聚焦耦合到光纖，傳輸?shù)焦鈾z測器進行檢測處理，經(jīng)檢測處理后的信號傳輸?shù)焦庑盘柼幚砜刂破鳎敵龃郎y生物樣品的數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對待測物的定量測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微生物樣品快速檢測方法，其特征在于步驟(2)中的反應(yīng)條件pH為7· (Γ7. 6，溫度為2(T42°C ;步驟(3)中的操作條件溫度為4 42°C ;步驟(4)中的免疫反應(yīng)條件pH為7. (Γ7. 6，溫度為2 42°C，酶催化顯色反應(yīng)條件pH為7. (Γ7. 6，溫度為20 42°C;步驟(5)中的反應(yīng)條件:pH為7. 0 7· 6，溫度為2 42。。。反應(yīng)條件:pH為7. 0 7· 6，溫度為20 42°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微生物樣品快速檢測方法，其特征在于所述抗體通過物理吸附、化學鍵合和生物親和中之一的方式固定在介孔生物芯片微孔孔道面上。
4.實施權(quán)利要求I至3之一所述微生物樣品快速檢測方法的檢測裝置，其特征在于包括測量光源(7)、進樣泵(6)、介孔生物芯片傳感器、出射光聚焦透鏡(9)、光檢測器(10)和信號處理控制器(11)，所述介孔生物芯片傳感器由介孔生物芯片(8)和位于介孔生物芯片兩側(cè)的進液室與集液室(25)構(gòu)成，介孔生物芯片上的微孔孔道(26)將進液室與集液室連通，進液室殼體設(shè)計有溶液進口接管(23)，集液室(25)殼體設(shè)計有排液出口接管(24)，進樣泵(6)出口與進液室殼體上的溶液進口接管連通，測量光源和出射光聚焦透鏡分別與介孔生物芯片對應(yīng)設(shè)置，出射光聚焦透鏡通過光纖(21)與光檢測器連接，光檢測器與光信號處理控制器信號連接，由測量光源發(fā)射出的測量光從介孔生物芯片側(cè)壁進入介孔生物芯片照射介孔生物芯片微孔孔道內(nèi)的抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物，激發(fā)的熒光、化學發(fā)光或者對入射光進行吸收產(chǎn)生的透射光，從由介孔生物芯片側(cè)壁出來，進入出射光聚焦透鏡，經(jīng)聚焦耦合進入光纖傳輸?shù)焦鈾z測器，將檢測到的光信號傳輸?shù)焦庑盘柼幚砥?，?jīng)處理輸出待測生物樣品的生物數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對待測物的定量測定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物樣品快速檢測裝置，其特征在于還設(shè)置有檢測用液儲槽，檢測用液儲槽的出口通過連接管與進樣泵的進口連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物樣品快速檢測裝置，其特征在于并聯(lián)設(shè)置有4個檢測用液儲槽，分別用作待測溶液、緩沖溶液、含有標記抗體溶液和催化反應(yīng)溶液的儲槽，各檢測用液儲槽的出口通過連接管、控制閥分別與進樣泵的進口連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物樣品快速檢測裝置，其特征在于還設(shè)置有廢液池(12),廢液池進口通過連接管與集液室殼體上的排液出口接管(24)連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物樣品快速檢測裝置，其特征在于所述介孔生物芯片的形狀為圓柱盤形，其結(jié)構(gòu)為整體式結(jié)構(gòu)或組合式結(jié)構(gòu)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物樣品快速檢測裝置，其特征在于所述介孔生物芯片為組合結(jié)構(gòu)，由介孔生物芯片本體和設(shè)置在介孔生物芯片本體不同區(qū)域的介孔材料片構(gòu)成。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至9之一所述的微生物樣品快速檢測裝置，其特征在于所述進液室與集液室均為錐筒結(jié)構(gòu)，大端分別與介孔生物芯片相聯(lián)接，錐端設(shè)置有溶液進口接管(23)或排液出口接管(24)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物樣品快速檢測方法及其實施檢測裝置，是基于介孔生物芯片來實現(xiàn)的。檢測方法首先是在介孔生物芯片微孔孔道面上固定抗體，使測試樣品流經(jīng)固定有抗體的芯片微孔孔道，芯片就可以分離富集病原微生物或其它生物物質(zhì)，然后將含有熒光標記或酶標記抗體的溶液注入到芯片微孔孔道內(nèi)，形成夾心式的抗體-抗原-標記抗體免疫復(fù)合物，病原微生物或其它生物物質(zhì)是通過檢測熒光標記抗體的熒光強度或者酶催化反應(yīng)產(chǎn)物對光的吸收、化學發(fā)光的光強度，實現(xiàn)對待檢測微生物的檢測。由于介孔生物芯片具有數(shù)量眾多的微孔孔道，大大增加了反應(yīng)面積，因此采用本發(fā)明檢測微生物樣品，具有檢測靈敏度高，檢測快速的特點。
文檔編號G01N33/569GK102879565SQ20121036394
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者段憶翔, 于巧玲 申請人:四川大學