專(zhuān)利名稱(chēng)：色譜試劑盒及色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及進(jìn)行用于提高檢測(cè)靈敏度的信號(hào)放大操作的色譜試劑盒及色譜方法。
背景技術(shù)：
免疫測(cè)定方法中的免疫色譜法由于操作簡(jiǎn)便、在短時(shí)間內(nèi)即可進(jìn)行測(cè)定，因而通常被廣泛利用。作為免疫色譜法中使用的免疫反應(yīng)，廣泛使用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)或夾心型反應(yīng)。其中，在免疫色譜法中夾心型反應(yīng)為主流，在其典型例中，為了對(duì)試樣中的由抗原構(gòu)成的待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行以下的操作。首先，通過(guò)將利用針對(duì)作為待測(cè)物質(zhì)的抗原的抗體進(jìn)行了致敏的微粒作為固相微粒固定化在色譜載體上、或者將該抗體本身直接固定在色譜載體上，由此制備具有反應(yīng)部位的色譜載體。另一方面，使能夠與待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體致敏標(biāo)記微粒，從而制備致敏標(biāo)記微粒。使該致敏標(biāo)記微粒與試樣一起在色譜載體上色譜地移動(dòng)。通過(guò)以上的操作，在形成于色譜載體的反應(yīng)部位上，經(jīng)固定化的抗體變?yōu)楣潭ɑ圐RU，致敏標(biāo)記微粒介由作為待測(cè)物質(zhì)的抗原特異地結(jié)合在其上。結(jié)果變成致敏標(biāo)記微粒被反應(yīng)部位捕獲，通過(guò)目視判定由此產(chǎn)生的信號(hào)的有無(wú)或程度，可以測(cè)定試樣中待測(cè)物質(zhì)的存在的有無(wú)或其量。免疫色譜法中，為了避免由于敏感度低而無(wú)法檢測(cè)到抗原(假陰性)的問(wèn)題，有時(shí)進(jìn)行將檢測(cè)信號(hào)放大的方法。作為信號(hào)放大的方法，有時(shí)使用堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶等酶作為標(biāo)記，也有時(shí)通過(guò)使用含有銀的化合物和用于銀離子的還原劑對(duì)選自金屬膠體標(biāo)記及金屬硫化物標(biāo)記的標(biāo)記進(jìn)行敏化(銀放大)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。使用了上述放大的免疫色譜記載于專(zhuān)利文獻(xiàn)3及非專(zhuān)利文獻(xiàn)I等中,特別是專(zhuān)利文獻(xiàn)2及專(zhuān)利文獻(xiàn)3中記載了使用2液的放大液來(lái)進(jìn)行放大。但是，專(zhuān)利文獻(xiàn)2及專(zhuān)利文獻(xiàn)3中并未記載在使用2液的放大液進(jìn)行放大時(shí)用于判斷開(kāi)始添加第2液的時(shí)機(jī)的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2002-202307號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)2010-71827號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :日本特開(kāi)2011-99724號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Journal of Chromatography, 878 (2010) 271-27
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題如上所述，在色譜法中，有時(shí)使用催化放大的溶液和進(jìn)行放大的溶液這2液來(lái)進(jìn)行放大。此時(shí)，色譜載體上的欲放大的部位必須被第I液充滿，但隨著支撐體的長(zhǎng)度或流速及外部環(huán)境的溫度等不同，第I液(還原劑等)的流動(dòng)速度會(huì)發(fā)生變化。因此，當(dāng)以時(shí)間指定第2液的添加時(shí)期時(shí)，則存在下述問(wèn)題在被第I液充滿之前添加第2液會(huì)發(fā)生放大故障，或者為了防止放大故障的發(fā)生而需要過(guò)分晚地設(shè)定第2液的添加時(shí)期。另外，當(dāng)在屋外進(jìn)行測(cè)定或者在短期間內(nèi)測(cè)定大量檢體等情況下，還可以預(yù)想到會(huì)有無(wú)法準(zhǔn)備所需數(shù)量的鐘表的狀況。S卩，本發(fā)明要解決的課題在于提供可容易地確認(rèn)色譜載體上的欲放大部位被第I液充滿、可以防止發(fā)生由于在被第I液充滿之前添加第2液所導(dǎo)致的放大故障的色譜試劑盒及色譜方法。用于解決課題的方法本發(fā)明人等為了解決上述課題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用催化放大的溶液和進(jìn)行放大的溶液這2液進(jìn)行放大的色譜試劑盒及色譜方法中，通過(guò)設(shè)置用于在視覺(jué)上顯示添加進(jìn)行放大的溶液的時(shí)機(jī)的手段，成功地防止了放大故障的發(fā)生。本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而完成。S卩，根據(jù)本發(fā)明，提供一種色譜試劑盒，其相對(duì)于含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣的展開(kāi)方向從上游方向至下游方向依次具有下述區(qū)域(I)具有用針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過(guò)的標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域；和(2)具有針對(duì)·待測(cè)物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或者針對(duì)上述第一結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域，且所述色譜試劑盒進(jìn)一步具有(3 )具有顯色試劑的區(qū)域，該顯色試劑用于對(duì)在檢測(cè)上述標(biāo)記物質(zhì)時(shí)為了放大標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)而使用的2種放大試劑中的第I放大試劑進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選具有顯色試劑的區(qū)域位于上述標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的下游。優(yōu)選上述顯色試劑是與離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。優(yōu)選上述顯色試劑是與Fe2+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。優(yōu)選上述顯色試劑是具有菲繞啉骨架的化合物。優(yōu)選上述顯色試劑是與H+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。優(yōu)選上述標(biāo)記物質(zhì)為金屬膠體。優(yōu)選上述金屬膠體為金膠體。優(yōu)選本發(fā)明的色譜試劑盒內(nèi)置有為了放大標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)而使用的2種放大試劑。優(yōu)選第I放大試劑是用于銀離子的還原劑、第2放大試劑是含有銀的化合物。優(yōu)選第I放大試劑是含有2價(jià)鐵離子的試劑。優(yōu)選色譜試劑盒至少含有具有標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域的標(biāo)記物質(zhì)保持襯墊、具有標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的結(jié)合物質(zhì)固定化膜以及吸水襯墊，且上述顯色試劑被擔(dān)載于結(jié)合物質(zhì)固
定化膜。優(yōu)選上述顯色試劑是在將含有待測(cè)試樣的水溶液或含有第I放大試劑的水溶液的任一者進(jìn)行展開(kāi)時(shí)實(shí)質(zhì)上不會(huì)在結(jié)合物質(zhì)固定化膜中移動(dòng)的顯色試劑。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明，提供一種色譜方法，其包含下述工序(I)在形成了待測(cè)物質(zhì)和用針對(duì)上述待測(cè)物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過(guò)的標(biāo)記物質(zhì)的復(fù)合體的狀態(tài)下進(jìn)行展開(kāi)、在具有針對(duì)上述待測(cè)物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或針對(duì)上述第一結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域上將標(biāo)記物質(zhì)捕獲的工序；(2)使為了將被上述標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域捕獲的標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)進(jìn)行放大而使用的2種放大試劑中的第I放大試劑從標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的上游方向向標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的下游方向展開(kāi)的工序；(3)通過(guò)檢測(cè)具有顯色試劑的區(qū)域上的物理或化學(xué)變化來(lái)確認(rèn)標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域被第I放大試劑充滿的工序；以及(4)在確認(rèn)到標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域被第I放大試劑充滿后使上述2種放大試劑中的第2放大試劑充滿標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的工序。優(yōu)選第I放大試劑是用于銀離子的還原劑、第2放大試劑是含有銀的化合物。優(yōu)選第I放大試劑是含有2價(jià)鐵離子的試劑。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的色譜試劑盒及色譜方法，通過(guò)設(shè)置用于在視覺(jué)上顯示添加進(jìn)行放大的溶液的時(shí)機(jī)的手段，可以防止放大故障的發(fā)生。


圖1表示實(shí)施例1中使用的試劑盒的實(shí)施方式。在構(gòu)成本發(fā)明試劑盒外部的上部的構(gòu)件上設(shè)置有作為第2放大試劑的銀離子溶液的填充孔。在下部的構(gòu)件上，在粘合片材上依次配置有用于輸送作為第I放大試劑的還原劑溶液的襯墊、作為標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域的金膠體保持襯墊、具有作為標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的抗體固定化線的抗體固定化膜、以及作為具有顯色試劑的區(qū)域的吸水襯墊。如圖1所示，相對(duì)于含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣的展開(kāi)方向來(lái)定義為上游、下游。圖2表示實(shí)施例2及實(shí)施例3中使用的試劑盒的實(shí)施方式。在構(gòu)成本發(fā)明試劑盒外部的上部的構(gòu)件上設(shè)置有作為第2放大試劑的銀離子溶液的填充孔及作為第I放大試劑的還原劑溶液的添加孔。在下部的構(gòu)件上，在粘合片材上依次配置有用于輸送作為第I放大試劑的還原劑溶液的襯墊、作為標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域的金膠體保持襯墊、具有作為標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的抗體固定化線和作為具有顯色試劑的區(qū)域的顯色試劑固定化線的抗體固定化膜、以及吸水襯墊。與圖1同樣，相對(duì)于含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣的展開(kāi)方向來(lái)定義為上游、下游。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的色譜試劑盒及色譜方法中，可以在視覺(jué)上判斷添加在以提高待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度為目的而進(jìn)行放大操作時(shí)所使用的2種放大試劑的時(shí)機(jī)。1.用于檢測(cè)第I放大試劑的顯色試劑本發(fā)明的色譜試劑盒具有下述區(qū)域具有用于對(duì)為了放大標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)而使用的2種放大試劑中的第I放大試劑進(jìn)行檢測(cè)的顯色試劑的區(qū)域。本發(fā)明中，作為用于對(duì)第I放大試劑進(jìn)行檢測(cè)的顯色試劑，例如優(yōu)選使用與離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。對(duì)于第I放大試劑，會(huì)在本說(shuō)明書(shū)中后面敘述，但例如當(dāng)?shù)贗放大試劑為含有2價(jià)鐵離子(Fe2+)的試劑時(shí)，作為其顯色試劑，可以使用與Fe2+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。作為與Fe2+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物，可以使用通過(guò)與Fe2+離子形成絡(luò)合物而能夠顯色的化合物。作為與Fe2+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物的具體例子，可以使用具有菲繞啉骨架的化合物[例如1，10-菲繞啉、5-甲基菲繞啉、5-硝基菲繞啉、紅菲繞啉(4，7- 二苯基-1，10-菲繞啉)或紅菲繞啉二磺酸等]或者具有聯(lián)二吡啶骨架的化合物[例如2，2'-聯(lián)二吡啶等]，可以優(yōu)選使用具有菲繞啉骨架的化合物。另外，當(dāng)含有待測(cè)試樣的水溶液與含有第I放大試劑的水溶液的PH不同時(shí)，為了檢測(cè)第I放大試劑，可優(yōu)選使用通過(guò)質(zhì)子引起結(jié)構(gòu)變化、從而色調(diào)發(fā)生變化的試劑。特別是含有第I放大試劑的水溶液為酸性(pH小于7、質(zhì)子濃度高)時(shí)，作為酸性區(qū)域用的pH指示劑而公知的作為顯色試齊U的與H+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物(例如甲基橙、甲基紅、剛果紅及甲基黃等重氮系的顯色試劑，以及百里香酚藍(lán)、溴甲酚綠、溴甲酚紫及溴百里香酚藍(lán)等磺酸內(nèi)酯系的顯色試齊U)等可以根據(jù)含有放大試劑的水溶液的PH來(lái)適當(dāng)選擇使用。上述中，可以更優(yōu)選地使用1，10-菲繞啉、紅菲繞啉或溴甲酚綠。在將含有待測(cè)試樣的水溶液或含有第I放大試劑的水溶液進(jìn)行展開(kāi)時(shí)，優(yōu)選顯色試劑不在結(jié)合物質(zhì)固定化膜上移動(dòng)，因而優(yōu)選顯色試劑的LogP (在水和辛醇中的分配系數(shù))為4. 0以上、更優(yōu)選為5. 0以上。作為L(zhǎng)ogP，可以使用實(shí)測(cè)值，但作為簡(jiǎn)便判斷的方法，也可以使用由化學(xué)結(jié)構(gòu)等獲得的計(jì)算值。作為計(jì)算LogP的方法,優(yōu)選在CambridgeSoft公司的ChemDrawPro version 12中使用的計(jì)算方法。將代表性的顯色試劑的響應(yīng)性及LogP (根據(jù)ChemDrawPro version 12)不于以下的表I中。表I
權(quán)利要求
1.一種色譜試劑盒，其相對(duì)于含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣的展開(kāi)方向從上游方向至下游方向依次具有下述區(qū)域 (1)具有用針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過(guò)的標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域；和 (2)具有針對(duì)所述待測(cè)物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或針對(duì)所述第一結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域， 所述色譜試劑盒進(jìn)一步具有(3)具有顯色試劑的區(qū)域，所述顯色試劑用于對(duì)在檢測(cè)所述標(biāo)記物質(zhì)時(shí)為了放大標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)而使用的2種放大試劑中的第I放大試劑進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的色譜試劑盒，其中，所述具有顯色試劑的區(qū)域位于所述標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其中，所述顯色試劑是與離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其中，所述顯色試劑是與Fe2+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其中，所述顯色試劑是具有菲繞啉骨架的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其中，所述顯色試劑是與H+離子發(fā)生反應(yīng)而顯色的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其中，所述標(biāo)記物質(zhì)是金屬膠體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的色譜試劑盒，其中，所述金屬膠體是金膠體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其內(nèi)置有為了放大標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)而使用的2種放大試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的色譜試劑盒，其中，所述第I放大試劑是用于銀離子的還原齊 ，所述第2放大試劑是含銀的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的色譜試劑盒，其中，所述第I放大試劑是含有2價(jià)鐵離子的試劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的色譜試劑盒，其至少含有具有標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域的標(biāo)記物質(zhì)保持襯墊、具有標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的結(jié)合物質(zhì)固定化膜以及吸水襯墊，所述顯色試劑被擔(dān)載于結(jié)合物質(zhì)固定化膜。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的色譜試劑盒，其中，所述顯色試劑是在將含有待測(cè)試樣的水溶液或含有所述第I放大試劑的水溶液的任一者進(jìn)行展開(kāi)時(shí)不會(huì)在結(jié)合物質(zhì)固定化膜中移動(dòng)的顯色試劑。
14.一種色譜方法，其包含下述工序 (1)在形成了待測(cè)物質(zhì)和用針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過(guò)的標(biāo)記物質(zhì)的復(fù)合體的狀態(tài)下進(jìn)行展開(kāi)、在具有針對(duì)所述待測(cè)物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或針對(duì)所述第一結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域上將所述標(biāo)記物質(zhì)捕獲的工序； (2)使為了將被所述標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域捕獲的標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)進(jìn)行放大而使用的2種放大試劑中的第I放大試劑從標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的上游方向向標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的下游方向展開(kāi)的工序；(3)通過(guò)檢測(cè)具有顯色試劑的區(qū)域上的物理或化學(xué)變化來(lái)確認(rèn)所述標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域被第I放大試劑充滿的工序；以及 (4)在確認(rèn)到所述標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域被第I放大試劑充滿后使所述2種放大試劑中的第2放大試劑充滿標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域的工序。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的色譜方法，其中，第I放大試劑是用于銀離子的還原劑，第2放大試劑是含銀的化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的色譜方法，其中，第I放大試劑是含有2價(jià)鐵離子的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠容易地確認(rèn)色譜上欲放大的部位被第1液充滿、能夠防止發(fā)生在被第1液充滿之前添加第2液所導(dǎo)致的放大故障的色譜試劑盒及色譜方法。本發(fā)明的色譜試劑盒相對(duì)于含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣的展開(kāi)方向從上游方向至下游方向依次具有下述區(qū)域具有用針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過(guò)的標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)保持區(qū)域和具有針對(duì)所述待測(cè)物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或針對(duì)所述第一結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)捕獲區(qū)域，所述色譜試劑盒進(jìn)一步具有具有顯色試劑的區(qū)域，所述顯色試劑用于對(duì)在檢測(cè)所述標(biāo)記物質(zhì)時(shí)為了放大標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)而使用的2種放大試劑中的第1放大試劑進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103033610SQ201210368059
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者和田淳彥, 森干永 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社