方法
【專利摘要】在此披露了Akt3作為一種生物標(biāo)志物用于檢測一位受試者中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的用途以及Akt3抑制劑用以治療癌癥的用途。還披露了用于通過測量Akt3表達(dá)和/或活性來檢測一位受試者中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生的不同方法。
【專利說明】方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物研發(fā)和癌癥治療的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)激酶的領(lǐng) 域，并且更具體而言涉及對(duì)癌癥的預(yù)后和治療的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] Akt
[0004] Akt (蛋白激酶B)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，已知其涉及于不同的細(xì)胞過程 中，包括增殖、運(yùn)動(dòng)、生長、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、生存和細(xì)胞死亡。Akt是PI3K/Akt通路的H個(gè)主要 組分（磯脂醜肌醇3-激酶，其枯抗劑PTEN和Akt)之一。在該通路中的組分的突變屬于癌 癥中最頻繁觀察到的突變，并且發(fā)現(xiàn)于高達(dá)70%的乳癌中。在人類中，有H個(gè)Akt家族成 員，Akt UAkt 2和Akt3,它們是從不同的基因轉(zhuǎn)錄。關(guān)于Akt的多數(shù)研究公開物提及Aktl 或Akt而沒有特別說明哪個(gè)家族成員，導(dǎo)致在家族成員之間不加區(qū)分的泛-Akt抗體的廣泛 使用。H種亞型中，關(guān)于Akt3已知最少。事實(shí)上，最近的綜述文章"在乳腺發(fā)育和癌癥中的 關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)，在乳腺上皮細(xì)胞中PI3激酶的信號(hào)傳導(dǎo)下游：在3個(gè)Akt中的作用化ey signalling nodes in mammary gland development and cancer. Signalling downstream of PI3 kinase in mammary epithelium:a play in 3 Akts)'，（威肯登（Wickenden) JA 和 沃森（Watson)CJ，《乳癌研究〉〉（Breast Cancer Research) 2010,12,202)中，Akt3 提及僅S 次：一次用W確立其存在，一次用W指出它顯現(xiàn)具有在正常乳腺發(fā)育中的小作用，并且一次 用W指出它在懷孕和哺乳期間不影響StatSa磯酸化。
[000引對(duì)于AktU Akt2和Akt3在正常發(fā)育中的作用已經(jīng)在基因敲除小鼠中進(jìn)行了研 究，掲露了 Aktl對(duì)于整體生長是重要的（基因敲除小鼠大體上是健康的，但具有降低的生 長），Akt2主要涉及葡萄糖代謝（基因敲除小鼠正常生長但顯示具有膜島素耐受性），并 且Akt3在腦發(fā)育中是重要的（參見，例如達(dá)姆勒值ummler)B，亨明斯化emmings)BA，P邸/ Akt亞型在發(fā)育與疾病中的生理作用（Physiological roles of P邸/Akt isoforms in development and disease).《生物化學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)KBiochem Soc Trans) 2007 :35:231-巧。 Aktl和Akt2的更普遍作用由它們遍及全身的廣泛表達(dá)表明，而Akt3在腦、腎和也臟中具有 更受限制的表達(dá)。
[0006] Akt被視為一種用于癌癥治療的受關(guān)注祀標(biāo)，并且Akt抑制單獨(dú)地或與標(biāo)準(zhǔn)的癌 癥化療劑組合已經(jīng)被假定為可W降低細(xì)胞調(diào)亡闊值并優(yōu)先殺死癌細(xì)胞（林黎（Lindley) CW，《醫(yī)藥化學(xué)當(dāng)前論題》（化rr Top Med化em)，10,458, 2010)。最近的綜述意圖抑制作為 癌癥中最常見的突變家族成員的Akt成員關(guān)鍵點(diǎn)Akt2,并且表明Aktl和Akt2的抑制將是 最優(yōu)的（梅特曼（Mattmann)ME等人"用小分子和生物巧驚U抑制Akt;專利格局的歷史性觀 點(diǎn)和當(dāng)前狀態(tài)（Inhibition of Akt with small molecules and biologies !historical perspective and current status of the patent landscape)'，，《關(guān)于醫(yī)療專利的專家觀 點(diǎn)》巧Xpert Opinion on Hierapeutic Patents) ,21，1309,2011)。與其他激酶相比，在此 綜述中覆蓋的許多化合物對(duì)Akt具有弱的選擇性并且總體上聚焦于Akt 1。在此綜述中評(píng)論 的在不同家族成員之間具有選擇性的化合物占優(yōu)勢地抑制Aktl和/或Akt2而不是Akt3。
[0007] 盡管在該文獻(xiàn)中占優(yōu)勢地聚焦于Aktl，Akt3過表達(dá)已經(jīng)與若干癌癥相關(guān)，包括黑 色素瘤（《癌癥研究HCancer Res. )200410月1 ;64 (19) :7002-10)和卵巢癌（《癌癥發(fā)現(xiàn)》 (Cancer Discov. )20121 月 1;2 (1):56-67)。
[000引若干專利公開物涉及Akts的用途。
[0009] WO 2010/091354化李莫法特癌癥研究公司化Lee Moffat Cancer Institute, Inc.))涉及在一位受試者中診斷癌癥的方法，該方法涉及對(duì)酪氨酸176-磯酸 化的AKTl而非AKT3的表達(dá)水平進(jìn)行確定。
[0010] US 20120040842(貝克炬aker)，等人）在一個(gè)大量基因陣列中列出了 Akt3,該些 基因可W被評(píng)估來確定結(jié)直腸癌的預(yù)后。然而，Akt3未被選作一個(gè)優(yōu)選標(biāo)志物。
[0011] US 20120028264(沙吉（Shaq)等人）在一個(gè)大量基因陣列中列出了 Akt3(表3A)， 該些基因的表達(dá)水平可W在評(píng)估一位受試者中的前列腺癌的可能性中來確定。Akt3的顯著 性未被確切提及。
[0012] US 20120021983(西西里斯（Tsichlis)等人）涉及通過評(píng)估受試者的Akt亞型譜 尤其是Aktl和Akt2的比例，通過將該譜與正常的Akt亞型譜進(jìn)行比較而對(duì)潛在癌癥和已 存在癌癥的進(jìn)展進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法。
[0013] US 20120003209(翻譯基因組學(xué)研究院（The Translational Genomics Research Insti化te))涉及用于基于Aktl和Akt2的表達(dá)水平鑒別侵入性惡性膠質(zhì)瘤的方法和 試劑盒。發(fā)現(xiàn)Akt3mRNA表達(dá)在非腫瘤性腦標(biāo)本中是高的而在神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤中是降低的 [[0130]]。并且發(fā)現(xiàn)Akt3表達(dá)在長期存活患者中是顯著更高的。
[0014] US 8133684(埃伯索爾德（Aebersold)等人）披露了確定前列腺細(xì)胞中的雄激素 反應(yīng)，在長串可能的前列腺癌生物標(biāo)志物清單中提及Akt3。
[0015] 上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)
[0016] 上皮細(xì)胞組織構(gòu)成身體的四個(gè)基底組織類型之一，其余的是結(jié)締組織、肌肉和神 經(jīng)組織。上皮細(xì)胞特征在于形成極化細(xì)胞層的趨向連同強(qiáng)的細(xì)胞間連接。因此，與其他細(xì) 胞類型相比，上皮細(xì)胞不能自由移動(dòng)并且顯示很少的遷移。相比之下，間質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞（例 女口，成纖維細(xì)胞）缺乏強(qiáng)的細(xì)胞間連接，并且可W作為單獨(dú)的細(xì)胞移動(dòng)。它們可W是高度能 動(dòng)的，并且能夠遷移通過細(xì)胞外基質(zhì)。
[0017] 上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)是一種天然細(xì)胞程序，其中個(gè)別上皮細(xì)胞失去上 皮細(xì)胞的基因表達(dá)模式和行為特征，而取而代之開始看起來為、行動(dòng)為典型間質(zhì)細(xì)胞并且 表達(dá)為間質(zhì)細(xì)胞的典型基因。在此過程中它們失去粘附性和頂端-基底極性，并且獲得遷 移并侵入細(xì)胞外基質(zhì)的能力。EMT不是不可逆的。稱為間質(zhì)細(xì)胞-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（MET)的 錯(cuò)誤過程導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞特征的丟失W及細(xì)胞-細(xì)胞粘附和頂端-基底極性的重新建立。
[0018] EMT在胚胎發(fā)育過程中尤其重要。它在原腸胚形成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在原 腸胚形成中由單一上皮細(xì)胞層組成的胚胎發(fā)育成具有H層經(jīng)典胚層即外胚層、中胚層和內(nèi) 胚層。在脊椎動(dòng)物發(fā)育中略微晚期中，EMT產(chǎn)生神經(jīng)晴細(xì)胞。該些細(xì)胞遷移通過胚，并且產(chǎn) 生許多不同的結(jié)構(gòu)，包括周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)節(jié)、骨W及臉和頭的軟骨、色素細(xì)胞W及神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞。另外多輪MET和EMT對(duì)于從中胚層和內(nèi)胚層形成內(nèi)部器官來說是必不可少的。 [001引 EMT與疾病
[0020] 相比于它在胚胎發(fā)育期間的重要性，EMT程序在健康成人中是很少激活的。然而， 在對(duì)損傷或疾病導(dǎo)致的炎癥的反應(yīng)中它被誘導(dǎo)：EMT在傷口愈合和組織修復(fù)中發(fā)揮作用， 并且在器官退行性疾?。ɡ缒I纖維化）期間發(fā)生。
[002。 另外EMT日趨被理解為在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。癌（Carcinomas)是上皮 細(xì)胞癌癥，并且為了使轉(zhuǎn)移發(fā)生，個(gè)別細(xì)胞必須逃離原發(fā)性腫瘤并且經(jīng)歷一系列遷移。該些 包括從原發(fā)性腫瘤遷移至局部循環(huán)或淋己系統(tǒng)中，W及從脈管系統(tǒng)外滲并且在轉(zhuǎn)移部位處 建立?，F(xiàn)在存在好的和越來越多的證據(jù)證實(shí)在腫瘤細(xì)胞與它們的微環(huán)境之間的相互作用可 W導(dǎo)致在一些腫瘤細(xì)胞中EMT的誘導(dǎo)。所得到的增加的細(xì)胞遷移和該些細(xì)胞的侵入潛力進(jìn) 而增強(qiáng)了使轉(zhuǎn)移得W建立的可能性。受體酪氨酸激酶Axl,是一種慢性骨髓性白血病關(guān)聯(lián)的 癌基因，近來已顯示是侵入-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵EMT誘導(dǎo)效應(yīng)子（WO 2010/103388)。
[0022] 連同增加轉(zhuǎn)移潛力的作用，EMT程序近來已經(jīng)與癌癥干細(xì)胞（CSC)相關(guān)。該些細(xì) 胞已經(jīng)被假定為代表具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞的一個(gè)子集，該些特征即產(chǎn)生所有的發(fā)現(xiàn) 于具體癌癥中的細(xì)胞類型的能力W及由此形成新腫瘤的能力。雖然CSC可W僅代表腫瘤中 的很小一部分細(xì)胞，它們被認(rèn)為對(duì)存在的抗癌藥具有特定耐受性。即使藥物治療可W殺死 腫瘤中的大多數(shù)細(xì)胞，但單個(gè)存活的CSC可W由此導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)。近來證據(jù)表明在EMT 與CSC表型之間的重疊，表明了 EMT還可W在化療之后的癌癥復(fù)發(fā)和耐藥性腫瘤的發(fā)展中 發(fā)揮作用。
[0023] EMT表型的穩(wěn)固生物標(biāo)志物可W用于鑒別處于發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的特定風(fēng) 險(xiǎn)中的患者，而祀標(biāo)于已經(jīng)經(jīng)歷EMT的細(xì)胞的新穎藥物將降低在常規(guī)治療之后的轉(zhuǎn)移和復(fù) 發(fā)。
[0024] EMT激活劑（例如，轉(zhuǎn)錄因子Slug)增加Aktl活性/表達(dá)。還已知的是Aktl激活 (例如，十四焼基化變體MyrAktl)誘導(dǎo)了 EMT激活劑（例如轉(zhuǎn)錄阻遏物，絲奈爾（Snail), 《癌基因》(Oncogene. )200711 月 22 ;26 (53) :7445-56.電子出版巧pub) 20076 月 1)，并且還 導(dǎo)致生物標(biāo)志物從上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的。
[00幼發(fā)明概述
[0026] 出乎意料地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Akt3在人類細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT和癌癥干細(xì)胞性狀中發(fā)揮 著中也作用。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞或表達(dá)組成型活性Aktl的細(xì)胞相比，組成型 活性的Akt3顯著地增加細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤和乳腺球的能力。另外，Akt3的抑制能夠逆 轉(zhuǎn)EMT和CSC性狀。
[0027] 鑒于在領(lǐng)域中聚焦于Aktl和Akt2,該是出乎意料的。
[0028] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Akt3是Axl受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)的生物標(biāo)志物。更確切地，AktS已 經(jīng)顯示為是針對(duì)上皮細(xì)胞中Axl信號(hào)傳導(dǎo)的生物標(biāo)志物。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Akt3參與導(dǎo)致EMT 的維持的反饋回路中。AktS的另外的應(yīng)用，例如癌癥干細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，將從本披 露中變得清楚。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種選擇有用于預(yù)防、抑制或治療Akt3相關(guān)病癥的 藥物化合物的方法，該方法包括提供一組候選藥物化合物用于測試，在一個(gè)測試系統(tǒng)中測 試候選藥物化合物對(duì)Akt3活性的作用，并且基于對(duì)Akt3活性的抑制選擇一種候選藥物化 合物。
[0030] 可替代地，本發(fā)明提供了一種選擇有用于治療轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的候選藥物化 合物的方法，該方法包括提供一組候選藥物化合物用于測試，在一個(gè)測試系統(tǒng)中測試候選 藥物化合物對(duì)Akt3活性的作用，并且基于其對(duì)Akt3活性的抑制選擇一種候選藥物化合物。
[0031] 根據(jù)另一方面，提供了一種選擇有用于預(yù)防或抑制EMT的候選藥物化合物的方 法，該方法包括提供一組候選藥物化合物用于測試，在一個(gè)測試系統(tǒng)中測試候選藥物化合 物對(duì)Akt3活性的作用，并且基于對(duì)Akt3活性的抑制選擇一種候選藥物化合物。
[0032] 高度有利的是能夠在一個(gè)體外測試系統(tǒng)中確定候選藥物化合物的有效水平，從而 預(yù)測體內(nèi)反應(yīng)。該有利于確定藥物化合物的有效最低劑量水平，并且還有利于W劑量依 賴的方式驗(yàn)證藥物祀標(biāo)。用W預(yù)測對(duì)一種藥物的體內(nèi)反應(yīng)的特別有用的途徑是通過經(jīng)由 RNA干擾對(duì)祀標(biāo)基因的常規(guī)選擇性敲除。用于此類方法中的核巧酸的有效產(chǎn)生描述于WO 2009/082488 中。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種選擇有用于預(yù)防、抑制或治療Akt3相關(guān)病癥 的候選藥物化合物的方法，該方法包括選擇性地降低一種測試細(xì)胞中的Akt3的表達(dá)，使該 測試細(xì)胞接觸該候選藥物化合物，并且確定該候選藥物化合物對(duì)Akt3活性抑制的作用。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種選擇有用于預(yù)防、抑制或治療Akt3相關(guān)病 癥的化合物的方法，該方法包括選擇性地將一種體外測試系統(tǒng)中Akt3的表達(dá)降低至一個(gè) 低水平，使該測試系統(tǒng)接觸一種候選藥物化合物，并且選擇抑制Akt3活性的候選藥物化合 物。
[00巧]根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種鑒別患有Akt3相關(guān)病癥的受試者的方法， 該方法包括評(píng)估該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3的表達(dá)或活性水平。 總體上，可W相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品來確定在一位受試者中或一個(gè)衍生自受試者的樣品中的 表達(dá)或活性的水平，如在此所述。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種鑒別具有發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的特定 風(fēng)險(xiǎn)的一位受試者的方法，該方法包括評(píng)估該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的 Akt3的表達(dá)或活性的水平，增加的Akt3表達(dá)或活性的水平指示該受試者發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐 藥性癌癥的增加的風(fēng)險(xiǎn)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種鑒別一位受試者中癌癥干細(xì)胞的存在的方 法，該方法包括確定該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3表達(dá)或活性的水 平，增加的Akt3的表達(dá)或活性指示癌癥干細(xì)胞（CSC)的存在。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種鑒別一位經(jīng)歷EMT的受試者的方法，該方 法包括確定該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3表達(dá)或活性的水平，AktS 的表達(dá)或活性的增加指示EMT的發(fā)生。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種對(duì)受試者中的癌癥相關(guān)結(jié)果進(jìn)行預(yù)后的方 法，該方法包括評(píng)估該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3活性或表達(dá)。
[0040] 在一些實(shí)施例中，相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品，Akt3活性或表達(dá)的增加指示出對(duì)用一種 癌癥治療劑（例如，一種抑制或逆轉(zhuǎn)EMT的勝任物）進(jìn)行的治療的敏感性。該藥劑可W如 在此所述，例如Akt3抑制劑或Axl抑制劑。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種鑒別Axl活性的方法，該方法包括確定該 受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3表達(dá)或活性的水平，增加的Akt3活性或 表達(dá)與Axl活性相關(guān)。
[0042] 已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)Akt3的表達(dá)或活性的水平與Akt2的表達(dá)或活性的水平呈反 相關(guān)。本發(fā)明的方法和用途包括對(duì)一位受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt2 的表達(dá)或活性的水平進(jìn)行評(píng)估。降低的Akt2表達(dá)或活性的水平可W指示；（i)該受試者患 有一種Akt3相關(guān)病癥；（ii)發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的增加的風(fēng)險(xiǎn)；（iii) 一種癌癥干細(xì) 胞的存在；和/或Qv化MT的發(fā)生。
[0043] 在一些實(shí)施例中，對(duì)Akt2和Akt3兩者的表達(dá)或活性的水平進(jìn)行評(píng)估。對(duì)兩種反 相關(guān)的生物標(biāo)志物進(jìn)行評(píng)估可W增加測定的可靠性。
[0044] 在一些實(shí)施例中，Akt3的表達(dá)水平是通過相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品而言確定編碼 Akt3的基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行評(píng)估，其中該拷貝數(shù)的增加指示增加的Akt3表達(dá)水平?？截?數(shù)（即基因重復(fù)事件）可W使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定，例如使用DNA芯片，如在 江 Qiang)等人（江 Qiang) Q, Ho YY,郝化ao)L，尼克爾斯貝里奧斯（Nichols Berrios) C， 查克拉瓦蒂（化akravarti)A.在候選基因中拷貝數(shù)變體是希爾施普龍病的遺傳修飾因子 (Copy number variants in candidate genes are genetic modi円ers of Hirschsprung disease). PLoS One. 2011 ;6 巧））中描述的。
[004引在一些實(shí)施例中，其中Akt3(或Ak。）的表達(dá)水平是通過確定Akt3(或Akt2)蛋 白質(zhì)或mRNA的水平來評(píng)估的。用于確定蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平的方法在本領(lǐng)域中是熟知 的，如在此所述。
[0046] 在一些實(shí)施例中，Akt3活性是通過確定Akt3的磯酸化來評(píng)估的，其中Akt3的磯 酸化指示活性Akt3。Akt3磯酸化可W被確定為在絲氨酸472處，如在此所述?？商娲鼗?另外地，磯酸化可W被確定為在蘇氨酸305處和/或酪氨酸174處。該種編號(hào)是指Akt3序 列，相應(yīng)的Aktl殘基對(duì)應(yīng)地是S473、T308和Y176。
[0047] 在不受理論限制的情況下，認(rèn)為在蘇氨酸305處的磯酸化在Akt3向細(xì)胞核的定位 中是重要的，會(huì)導(dǎo)致在酪氨酸174和絲氨酸472處的磯酸化W及Akt3的激活。在一些實(shí)施 例中，Akt3活性是通過確定Akt3蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位來評(píng)估的，其中定位于細(xì)胞核中指示 活性Akl: 3。
[0048] 在一些實(shí)施例中，Akt3活性是通過確定下游祀標(biāo)（例如，與EMT關(guān)聯(lián)的基因）的 表達(dá)水平來評(píng)估的。在另外的實(shí)施例中，Akt3激酶活性可W通過確定底物蛋白質(zhì)（例如， SNAIL)或膚的磯酸化來評(píng)估，例如如在圖奧米（Tuomi)等人2009 (Sci Signal. 20096月 302(77))中所述。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療一位患有Akt3相關(guān)病癥的受試者的方 法，該方法包括使該受試者接觸一種Akt3抑制劑或藥物化合物，該Akt3抑制劑或藥物化合 物被選擇作為或衍生自一種通過根據(jù)本發(fā)明的第一方面所述的方法獲得的候選化合物。
[0050] 本發(fā)明的另外方面包括一種抑制一位受試者中的EMT的方法，該方法包括使該受 試者接觸一種能夠抑制Akt3活性的化合物。
[0051] 本發(fā)明的另外方面提供了一種抑制一位受試者中的癌癥干細(xì)胞的方法，該方法包 括使該受試者接觸一種能夠抑制Akt3活性的化合物。
[0052] 本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或抑制一位患有癌癥的受試者中的耐藥性的方法，該方 法包括使該受試者接觸一種能夠抑制Akt3活性的化合物。
[0053] 本發(fā)明還提供了 Akt3抑制劑在治療Akt3相關(guān)病癥如癌癥中的用途。
[0054] 本發(fā)明還提供了 Akt3抑制劑在EMT的抑制中的用途。
[0055] 本發(fā)明還提供了用于在如在此所述的治療的方法中使用的Akt3抑制劑。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了能夠抑制Akt3活性的化合物在一位患有癌癥 的受試者中預(yù)防、抑制或治療耐藥性中的用途，該方法包括使該受試者接觸一種能夠抑制 Akt3活性的化合物。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的方法鑒別的或者用于根據(jù)本發(fā)明的方法或用途中的Akt3抑制劑可 W用作一種單一療法或與其他癌癥治療的組合療法，如下所述。
[0058] 合適的化療劑包括：
[0059] 焼化劑，包括焼基賴酸鹽例如白消安；
[0060] 氮芥例如苯下酸氮芥、環(huán)磯醜胺、雌氮芥、異環(huán)磯醜胺、二氯甲基二己胺、美法侖、 W及烏拉莫司汀，己帰亞胺衍生物例如喔替派；
[0061] 亞硝基脈例如卡莫司汀、洛莫司汀、W及鏈佐星，H氮帰例如達(dá)卡己嗦、丙卡己脫、 W及替莫哇胺，W及
[0062] 笛化合物例如順笛、卡笛、奧沙利笛、賽特笛、W及化笛奧納笛（onnaplatin)、四笛 (tetraplatin)、螺笛（sprioplatin)、異丙笛、氯代（二亞己基二氨基）-笛（II)氯化物、 二氯（亞己基二氨基）-笛（II)、二氨基（2-己基丙二酸根）合笛（II)、（1，2-二氨基環(huán)己 焼）丙二酸根合笛（II)、（4-駿基駄）-(1,2-二氨基環(huán)己焼）合笛（II)、（1，2-二氨基環(huán)己 焼）-(異巧樣酸根）合笛（II)、W及（1，2-二氨基環(huán)己焼）-順式-(丙麗酸根）合笛（II);
[0063] 抗代謝物，包括葉酸枯抗物例如甲氨噪嶺、普美曲塞（permetrexed)、雷替曲塞、W 及H甲曲沙，
[0064] 嚼巧類似物例如阿扎胞巧、卡培他濱、阿糖胞巧、依達(dá)曲沙、氣尿巧、氣尿嚼巧、吉 西他濱、W及曲沙他濱，W及
[0065] 嘿嶺類似物例如克拉屈濱、氯脫氧腺巧、克羅拉濱、氣達(dá)拉濱、琉基嘿嶺、噴司他 下、W及硫鳥嘿嶺；
[0066] 天然產(chǎn)物，包括抗腫瘤抗生素例如博來霉素、更生霉素、光輝霉素、絲裂霉素、米巧 意釀、泊非羅霉素、W及意環(huán)類，如道諾霉素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、W及戊柔比 星，
[0067] 有絲分裂抑制劑例如長春花生物堿長春花堿、文韋西爾（放線菌素）、長春新堿、 長春地辛、W及長春瑞濱，
[0068] 酶例如k天冬醜胺酶和陽GA-天冬醜胺酶，
[0069] 微管聚合物穩(wěn)定劑例如紫杉焼紫杉醇和多西他賽，
[0070] 拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑例如喜樹堿伊立替康和拓?fù)涮婵?，W及
[0071] 拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑例如鬼白毒素、安嚇巧、依巧泊巧、替尼泊巧、洛索意釀W及 放線菌素；
[0072] 激素和激素枯抗劑，包括雄激素例如氣甲睪麗和睪內(nèi)醋，
[0073] 抗雄激素例如比卡魯胺、環(huán)丙孕麗、氣他米特、W及尼魯米特，
[0074] 皮質(zhì)類固醇例如地塞米松和強(qiáng)的松，
[00巧]芳香酶抑制劑例如氨魯米特、阿那曲哇、依西美坦、福美司坦、W及來曲哇，
[0076] 雌激素例如己帰雌酷，
[0077] 抗雌激素例如氣維司群、雷洛昔芬、它莫西芬、W及巧瑞米芬（toremifine)，
[0078] 促黃體激素釋放激素（LHRH)激動(dòng)劑和枯抗劑例如阿己瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞 林、亮丙瑞林、組氨瑞林、德索瑞林（desorelin)、醋酸那法瑞林W及曲普瑞林，
[0079] 孕麗例如醋酸甲輕孕麗W及醋酸甲地孕麗，W及
[0080] 甲狀腺激素例如左旋甲狀腺素W及楓塞羅寧；
[0081] P邸通路抑制劑，包括脈立福辛、鹽酸恩扎斯巧瑞（enzastaurin hy化ochloride)、 W及曲西立濱，
[0082] P13K抑制劑例如塞瑪福爾（semaphore)和SF1126, W及
[0083] MTOR抑制劑例如雷帕霉素和類似物；
[0084] CDK抑制劑，包括瑟立西克立（seliciclib)、埃爾沃茨迪（alvocidib)、W及7-輕 基十字抱堿；
[0085] C0X-2抑制劑，包括塞來昔布；
[0086] HDAC抑制齊[|，包括曲古抑菌素A、辛二醜苯胺氧巧酸（subero^anilide hydroxamic acid)、W及衣多星（chlamydocin)；
[0087] DNA甲基化酶抑制劑，包括替莫哇胺；W及
[0088] 其他雜項(xiàng)藥劑，包括六甲蜜胺、H氧化二神、薩力多胺、來那度胺、硝酸嫁、左旋咪 哇、米巧坦、輕基脈、奧曲膚、丙卡己脫、蘇拉明、光動(dòng)力化合物如甲氧沙林和撲吩姆軸，W及 蛋白酶體抑制劑例如測替佐米。
[0089] 分子祀向治療劑，包括：
[0090] 功能性治療劑，包括基因治療劑，
[0091] 反義治療劑，
[0092] 酪氨酸激酶抑制劑例如鹽酸埃羅替尼、吉非替尼、甲賴酸伊馬替尼、W及瑟馬沙尼 (semaxanib)，
[009引 Raf抑制劑例如索拉非尼，W及
[0094] 基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑例如類視黃醇（retinoid)和類視黃醇X受體合成物（rexinoid)， 例如阿達(dá)帕林、貝沙羅汀、反式視黃酸、9-順式-視黃酸、W及N-(4-輕苯基）維甲醜胺擬 及
[0095] 表型定向治療劑，包括單克隆抗體例如阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、替坦異 貝莫單抗、利妥昔單抗、W及曲妥單抗，免疫毒素例如吉妥珠單抗奧哇米星，放射免疫偶聯(lián) 物例如I-巧西妥莫抗體（tositumob油），W及
[009引 癌癥疫苗。
[0097] 生物治療劑，包括：
[0098] 干擾素例如干擾素-[a ] 2a和干擾素-[a ] 2b，W及
[0099] 白介素例如阿地白介素、地尼白介素（denileukin diftitox)、W及奧 普瑞白介素。Axl抑制劑，包括1-化7-二氨-5H-苯并化7]環(huán)庚[1，2-C]化 嗦-3-基）-N3-((7-(S)-化咯焼-1-基）-6,7,8,9-四氨-5H-苯并[7]輪 帰-2-基）2, 4- H哇-3, 5-二胺炬GB324/R428)，C冊(cè)451098 (羅氏）和 Axl 抑制劑， 描述于 PCT/US07/089177、PCT/US2010/021275 和 PCT/EP2011/004451 中，通過引用結(jié)合于 此。
[0100] 除了該些旨在對(duì)抗癌癥細(xì)胞的藥劑之外，抗癌療法還包括使用保護(hù)劑或輔佐劑， 包括：
[0101] 細(xì)胞保護(hù)劑例如氨磯汀W及右雷佐生，
[0102] 麟酸鹽例如帕米麟酸鹽W及哇來麟酸鹽，W及
[0103] 刺激因子例如依泊亭、達(dá)泊亭（darbeopetin)、非格司亭、PEG-非格司亭、W及沙 格司亭。
[0104] 許多組合化療方案在本領(lǐng)域中是已知的，例如W下組合：卡笛/紫杉醇、卡培他濱 /多西他賽、氣尿嚼巧/左旋咪哇、氣尿嚼巧/亞葉酸、甲氨噪嶺/亞葉酸、W及曲妥單抗/ 紫杉醇，單獨(dú)地或另外與卡笛組合，等等。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明的另外一方面，提供了一種選擇患者優(yōu)選人類患者W便治療一種Akt3 相關(guān)病癥的方法，該方法包括鑒別具有升高的Akt3活性或表達(dá)的患者，并且選擇由此鑒別 的患者用于治療。可W根據(jù)如在此所述的本發(fā)明的方法對(duì)患者進(jìn)行鑒別。
[0106] 優(yōu)選該Akt3相關(guān)病癥是癌癥。該癌癥可W是W下癌癥中的一種或多種：白血病， 例如但不限于，急性白血病，急性淋己細(xì)胞性白血病，急性髓細(xì)胞性白血病例如成髓細(xì)胞 性、早幼粒細(xì)胞性、髓單核細(xì)胞性、單核細(xì)胞性、紅白血病白血病W及骨髓增生異常綜合征， 慢性白血病例如但不限于慢性髓細(xì)胞性（粒細(xì)胞性）白血病、慢性淋己細(xì)胞性白血病、毛 細(xì)胞白血??；真性紅細(xì)胞增多癥；淋己瘤例如但不限于何杰金氏病、非何杰金氏病；多發(fā)性 骨髓瘤，例如但不限于冒煙型多發(fā)性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細(xì)胞白 血病、孤立性漿細(xì)胞瘤W及髓外漿細(xì)胞瘤；華氏巨球蛋白血癥；未確定顯著性的單克隆丙 種球蛋白病；良性單克隆丙種球蛋白病；重鏈疾??；骨和結(jié)締組織肉瘤，例如但不限于骨肉 瘤、成骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、惡性巨細(xì)胞瘤、骨纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組 織肉瘤、血管肉瘤（血管瘤）、纖維肉瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋己管肉 瘤、轉(zhuǎn)移性癌癥、神經(jīng)銷膜瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤；腦瘤，例如但不限于神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形 細(xì)胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非膠質(zhì)瘤、聽神經(jīng)瘤、頗咽管瘤、成神經(jīng)管 細(xì)胞瘤、腦膜瘤、成松果體細(xì)胞瘤、松果體母細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦淋己瘤；乳癌，包括但不限于 腺癌、小葉（小細(xì)胞）癌、管內(nèi)癌、髓性乳癌、粘液性乳癌、管狀乳癌、乳頭乳癌、原發(fā)性癌、佩 吉特氏病、W及炎性乳癌；腎上腺癌，例如但不限于嗜鉛細(xì)胞瘤W及腎上腺皮質(zhì)癌；嗜鉛細(xì) 胞瘤，例如但不限于乳頭狀或甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌W及甲狀腺未分化癌；膜腺癌， 例如但不限于膜島瘤、胃泌素瘤、膜高血糖素瘤、血管活性腸膚瘤、生長激素抑制素分泌瘤、 W及類癌瘤或膜島細(xì)胞瘤；垂體癌，例如但不限于庫興氏病、催乳素分泌瘤、肢端服大癥、W 及尿崩病（di油etes insipius);眼癌，例如但不限于眼內(nèi)黑色素瘤（0州Iar melanoma)如 虹膜黑色素瘤、脈絡(luò)膜黑色素瘤、W及睫狀體黑色素瘤，W及成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；陰道癌，例如 鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、W及黑色素瘤；外陰癌，例如鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底細(xì)胞癌、 肉瘤、W及佩吉特氏??；宮頸癌，例如但不限于鱗狀細(xì)胞癌和腺癌；子宮癌，例如但不限于 子宮內(nèi)膜癌W及子宮肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮性癌、交界性腫瘤、生殖細(xì)胞瘤、 W及間質(zhì)瘤；食管癌，例如但不限于鱗癌、腺癌、腺樣囊性癌（adenoid cyctic carcinoma)、 粘液表皮樣癌、腺鱗癌、肉瘤、黑色素瘤、漿細(xì)胞瘤、巧狀癌、W及燕麥細(xì)胞（小細(xì)胞）癌；胃 癌，例如但不限于腺癌、真菌樣生長（息肉狀）、潰瘍、表淺擴(kuò)散型、廣泛擴(kuò)散型（difTusely spreading)、惡性淋己瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、W及癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌，例如但 不限于肝細(xì)胞癌W及肝母細(xì)胞癌，膽癌例如腺癌；膽管細(xì)胞癌，例如但不限于乳頭狀、結(jié)節(jié) 狀、W及彌散型癌；肺癌，例如非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌（表皮樣癌）、腺癌、大細(xì)胞癌W及 小細(xì)胞肺癌；睪丸癌，例如但不限于胚組織瘤、精原細(xì)胞瘤、未分化型、經(jīng)典（典型）型、精母 細(xì)胞型、非精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、崎胎瘤癌、絨毛膜癌（卵黃囊瘤），前列腺癌例如但不限 于前列腺癌、平滑肌肉瘤、W及橫紋肌肉瘤；生殖器癌癥，例如陰莖癌；口腔癌，例如但不限 于鱗狀細(xì)胞癌；基底癌癥化asal cancer);唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮樣癌、 W及腺樣囊性癌；咽癌，例如但不限于鱗狀細(xì)胞癌W及巧狀體；皮膚癌，例如但不限于基底 細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌W及黑色素瘤，淺表擴(kuò)散性黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、惡性雀斑疲樣 黑色素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤；腎癌，例如但不限于腎細(xì)胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉 瘤、移行細(xì)胞癌（腎孟和/或輸尿管）；維爾姆斯瘤；膀脫癌，例如但不限于移行細(xì)胞癌、鱗 狀細(xì)胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌癥包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋己管內(nèi)皮肉 瘤、間皮瘤、滑膜瘤、成血管細(xì)胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌 W及乳頭狀腺癌。優(yōu)選地，該癌癥是選自乳癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肺癌 或神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌。更優(yōu)選該癌癥是轉(zhuǎn)移性乳癌。
[0107] 轉(zhuǎn)移性癌癥的治療取決于原發(fā)性腫瘤位于什么地方。當(dāng)乳癌擴(kuò)散至肺部時(shí)，例如， 它仍然是乳癌，并且治療是由乳房內(nèi)的轉(zhuǎn)移性癌源頭確定的，而不是由它現(xiàn)在處于肺部中 的事實(shí)確定的。大約5%的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性癌但未能鑒別到原發(fā)性腫瘤。該些轉(zhuǎn)移性癌癥 的治療是由它們的位置而非它們的源頭指示的。轉(zhuǎn)移性癌癥是通過原始腫瘤的組織（如果 已知的話）命名的。例如，已經(jīng)擴(kuò)散至腦部的乳癌稱為對(duì)腦部的轉(zhuǎn)移性乳癌。
[010引可W對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法鑒別或選擇的患者進(jìn)行治療、或選擇W便治療。例如，女口 果Akt3表達(dá)顯示在原發(fā)性腫瘤中下調(diào)，該可W用于推斷增加的轉(zhuǎn)移可能性。該信息可W用 作指導(dǎo)治療方案，即更具侵入性的抗癌手術(shù)、化療或放療治療（如乳房根治術(shù)）。在一些實(shí) 施例中，治療包括給予Akt3和/或Axl抑制劑，可任選地與在此所述的或本領(lǐng)域中已知的 另外一種治療劑組合。優(yōu)選地，Axl抑制劑是BGB324/R428。
[0109] 本發(fā)明還提供了對(duì)EMT的抑制劑敏感的細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有不足W預(yù)防EMT的 Akt3表達(dá)水平。優(yōu)選地，該些細(xì)胞系是人類細(xì)胞系。
[0110] 本發(fā)明還提供了一種鑒別抑制Akt3活性的化合物的方法，該方法包括使來自根 據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的細(xì)胞接觸一種測試化合物，并且確定在該細(xì)胞中Akt3活性的抑制。 [01U] 本發(fā)明的一方面涉及Akt3作為一種生物標(biāo)志物W檢測一位受試者中上皮細(xì)胞向 間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的發(fā)生的用途。在一些實(shí)施例中，AktS的表達(dá)和/或激活的增加指示 上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的發(fā)生。
[0112] 轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)方部位是由實(shí)體瘤造成死亡的最常見原因（古普培（Gupta) 2006,斯波 恩（Sporn) 1996)。為了實(shí)現(xiàn)此結(jié)果，腫瘤細(xì)胞失去上皮抑制物，重新限定連接復(fù)合體并且獲 得侵入性運(yùn)動(dòng)性W打破穿過基底膜邊界。該些轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)而內(nèi)滲進(jìn)入淋己和造血循環(huán)中， 傳播至身體內(nèi)的遠(yuǎn)方部位。該些轉(zhuǎn)移細(xì)胞的少數(shù)成功地外滲穿過毛細(xì)血管壁，并且在稀有 情況下定殖外部組織基質(zhì)（溫伯格（Weinberg)等人）。該一惡性過程是由一種發(fā)育程序上 皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)協(xié)助，該發(fā)育程序中在原腸胚形成和器官發(fā)生期間上皮細(xì)胞 短暫地采取間質(zhì)細(xì)胞表型，W允許單細(xì)胞侵入性移動(dòng)遠(yuǎn)離上皮層（哈爾化all)，1985 ;蒂里 (Thienr) ,2002)。EMT程序是由形成素信號(hào)傳導(dǎo)通路的背景激活啟動(dòng)的，該些通路誘導(dǎo)轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)因子包括扭曲蛋白（Twist)、Snail、Slug和Zeb2的表達(dá)，該些因子改變連接復(fù)合體 蛋白質(zhì)的表達(dá)（蒂里（Thiery)和斯利曼（SLeeman) 2006)。EMT基因表達(dá)譜反映了表型轉(zhuǎn) 變、E-巧粘素和細(xì)胞角蛋白的抑制，伴隨波形蛋白和N-巧粘素的誘導(dǎo)（溫伯格（Weinberg) 等人2007)。
[0113] 術(shù)語"標(biāo)志物"或"生物標(biāo)志物"在此用來指代一種基因或蛋白質(zhì)，當(dāng)上皮細(xì)胞向 間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)發(fā)生時(shí)，該基因或蛋白質(zhì)在一個(gè)衍生自細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的樣品中的表 達(dá)被改變或調(diào)節(jié)，例如上調(diào)或下調(diào)。在該生物標(biāo)志物是一種蛋白質(zhì)時(shí)，表達(dá)的調(diào)節(jié)或改變涵 蓋通過不同的翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。
[0114] 翻譯后修飾是共價(jià)加工事件，其通過蛋白質(zhì)水解切割或通過添加修飾基團(tuán)至一個(gè) 或多個(gè)氨基酸改變蛋白質(zhì)的特性。通常翻譯后修飾包括磯酸化、己醜化、甲基化、醜化、糖基 化、GPI銷、泛素化等等。對(duì)此類修飾和用于檢測的方法的綜述可W發(fā)現(xiàn)于曼恩（Mann)等 人《自然生物技術(shù)》（化化re Biotechnology)3月2003,21卷，255-261頁中。
[011引還在此提供了 Akt3作為一種生物標(biāo)志物W檢測Axl的表達(dá)和/或激活的用途，其 中Akt3的表達(dá)和/或激活的增加指示Axl的表達(dá)和/或激活的增加。
[0116] 術(shù)語"表達(dá)"是指基因的DNA模板的轉(zhuǎn)錄W產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA W及該mRNA的翻譯 W產(chǎn)生相應(yīng)基因產(chǎn)物（即，膚、多膚或蛋白質(zhì)），W及處于可能已經(jīng)經(jīng)過翻譯后修飾的W - 種或多種形式的蛋白質(zhì)的"表達(dá)"。
[0117] 包括基因表達(dá)的表達(dá)水平的檢測可W通過本領(lǐng)域中已知的方法中的任何一種來 進(jìn)行，特別是通過微陣列分析、蛋白質(zhì)印跡或通過PCR技術(shù)例如QPCR。改變的表達(dá)還可W通 過使用例如如在此所述的化ISA、PET或SELDI-TOF MS的方法并且使用進(jìn)一步的分析技術(shù) 例如2D凝膠電泳對(duì)樣品的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析來檢測。諸如此類的技術(shù)可W在檢測處于 替代的翻譯后修飾形式的形式中的蛋白質(zhì)的改變的表達(dá)中是特別有用的。
[0118] 適合的樣品包括但不限于組織樣品，例如活檢樣品、血液、尿液、頰碎片等、血清、 血漿或組織培養(yǎng)物上清液樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，基因表達(dá)優(yōu)選是在腫瘤細(xì)胞中檢測，具體 而言是衍生自W下的細(xì)胞；腫瘤例如乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、結(jié)直腸癌、腎癌、膜腺癌、子 宮癌、肝癌、膀脫癌、子宮內(nèi)膜癌W及前列腺癌，W及白血病，或衍生自血細(xì)胞例如淋己細(xì)胞 并且優(yōu)選外周淋己細(xì)胞例如PBMC。
[0119] 在患者血清并且特別是在血漿樣品中的蛋白質(zhì)的檢測中，樣品被移除并且經(jīng)受蛋 白質(zhì)分析技術(shù)例如流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、PET和SELDI-TOF MS，如在此所述。
[0120] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該方法包括將RNA從所述樣品中提取并且通過QPCT檢測基 因表達(dá)。
[0121] 在一個(gè)實(shí)施例中，基因表達(dá)是通過如例如經(jīng)蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物來檢測。
[0122] 本發(fā)明的另外一方面提供了一種用于檢測樣品中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT) 的發(fā)生的方法，所述方法包括對(duì)分離自一種細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人類的一個(gè)樣品中的 Akt3的表達(dá)水平或激活相比于一個(gè)對(duì)照樣品進(jìn)行確定，其中相對(duì)于該對(duì)照樣品Akt3的表 達(dá)水平或激活的增加指示上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的發(fā)生。
[0123] 本發(fā)明的另外一方面涉及一種鑒別能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 (EMT)的藥劑的方法，所述方法包括向一種細(xì)胞、細(xì)胞群或動(dòng)物模型給予所述藥劑，并且監(jiān) 測Akt3的激活和/或表達(dá)。
[0124] 在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括：
[0125] (i)向一種細(xì)胞、細(xì)胞群或一種動(dòng)物模型而不是人類給予該藥劑；并且
[0126] (ii)對(duì)衍生自處理的和未處理的細(xì)胞或動(dòng)物模型的樣品中的Akt3表達(dá)和/或 A1U3激活進(jìn)行測量；并且
[0127] (iii)相比于未處理的樣品，對(duì)處理的樣品中的AktS的表達(dá)和/或激活的增加進(jìn) 行檢測，作為抑制或逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的能力的指示。
[012引在一些實(shí)施例中，該動(dòng)物模型不是人類。
[0129] 在一些實(shí)施例中，Akt3的表達(dá)水平是通過相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品而言確定編碼 Akt3的基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行評(píng)估，其中該拷貝數(shù)的增加指示增加的Akt3表達(dá)水平。
[0130] 在一些實(shí)施例中，AktS的表達(dá)水平是通過確定Akt3蛋白質(zhì)或mRNA的水平來評(píng)估 的。
[013。 在一些實(shí)施例中，Akt3活性是通過確定Akt3的磯酸化來評(píng)估的，其中Akt3的磯 酸化指示Akt3活性。Akt3磯酸化可W被確定為在絲氨酸472處，如在此所述?？商娲鼗?另外地，磯酸化可W被確定為在蘇氨酸305處和/或酪氨酸174處。
[0132] 在一些實(shí)施例中，Akt3活性是通過確定Akt3蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位來評(píng)估的，其中 定位于細(xì)胞核中指示活性Akt3。
[013引在一些實(shí)施例中，Akt3活性是通過確定下游祀標(biāo)（例如，與EMT關(guān)聯(lián)的基因）的 表達(dá)水平來評(píng)估的。在另外的實(shí)施例中，Akt3激酶活性可W通過確定底物蛋白質(zhì)（例如， SNAIL)或膚的磯酸化來評(píng)估，例如如在圖奧米（Tuond)等人，2009中所述。
[0134] AktS
[01巧]Akt3(還稱為P邸Y) W兩種亞型存在于人類中，亞型1和亞型2。亞型UQ9Y23， 型式1)的序列如下，是"標(biāo)準(zhǔn)"序列：
[0136] SEQ ID NO: 1
[0137] MSDVTIVKEGWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKP孤VDLPYPLNNFSVAKCQLMKTERPKP NTFIIRCLQWTTVIERTFHVDTP 邸 REEWTEAIQAVADRLQR 犯邸 RMNCSPTSQIDNIGEEEMDASTTHHK 服 TMN D 抑 YLKLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIAKDEVAHTLTESRVLKNTRHP 化 TSLKYSFQT 邸化 CF VMEYVNGGELF 即 畑 LKLENLMLD 邸細(xì) IKITDFGLCKEGITDA ATMKTFCGTPEYLA 陽化邸 NDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCG 化 PFYN 孤肥 KL 陽 U LMEDIKFPRTLSSDAK 化 L S化 U 邸PNKRLGGGP 孤 AKEIMR 服巧 56￥娜〇0￥￥0邸1^￥--。陽〇￥1561011?￥抑邸。14〇1'口口巧61(￥0￡ DGMDCMD肥RRPHFPgFSYSASGRE
[013引亞型2具有序列：
[013引 沈Q ID NO:2
[0140] MSDVTIV邸GWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKP孤VDLPYPLNNFSVAKCQLMKTERPK PNTFIIRCLQWTTVIERT 即 VDTP 邸 REEWTEAIQAVADRLQRQ 邸邸 MNCSPTSQIDNIGEEEMDASTTHHK 服 T MND 抑化 KLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIA 邸 EVAHTLTESRVLKNTCHPFLT^KYSFQmD RLCFVMEYVNGGELFFHLSRERVFS 抓 RTRFYGAEIVSALD 化 HSGKIVY 畑 LKLENLMLD 邸細(xì)IKITDF 化 CK EGITDAATMKTFCGTPEYLAPE 化抓 NDYGRA VDWWGLGVVMYEMMCG 化 PFYNQ 畑 EKLFELI LMEDIKFPCTL SSDAKS化 SGlXI 邸PNKRLGGGPDDAKEIM 畑SFFSGVNW 孤 VYDKKLVPPFKPQVTSETDTRY 抑邸 FTAQTI TITP陽KCQQSDCGMLGNWKK
[0141] 對(duì)基因/蛋白質(zhì)標(biāo)志物的改變的表達(dá)的測量
[0142] 可W使用多種不同技術(shù)確定基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
[0143] (a)在RNA水平上
[0144] 可W在RNA水平上檢測基因表達(dá)?？蒞使用RNA提取技術(shù)從細(xì)胞中提取RNA，該些 提取技術(shù)包括例如使用酸苯酷/脈異硫氯酸醋提取（RNAzol B ;Biogenesis)、RNeasy RNA 制備試劑盒（凱杰（Qiagen))或PAXgene(PreAnal^ix，瑞±)。采用核糖核酸雜交的典 型測定方式包括核連綴分析（nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNA酶保護(hù)測定（麥爾登 (Melton)等人，《核酸研究》（Nuc. Acids Res.) 12:7035)、RNA印跡W及原位雜交?；虮?達(dá)還可W通過如下所述的微陣列分析來檢測。
[0145] 對(duì)于RNA印跡，首先經(jīng)由電泳在瓊脂糖凝膠中在變性條件下通過大小將RNA樣品 分離。然后將RNA轉(zhuǎn)移至膜，與標(biāo)記探針交聯(lián)并雜交。可W使用非同位素或高特異性活性 的放射標(biāo)記的探針，包括隨機(jī)引物產(chǎn)生的、切口翻譯的或PCR生成的DNA探針、體外轉(zhuǎn)錄的 RNA探針、W及寡核巧酸。另外，僅具有部分同源性的序列（例如來自不同物種的CDNA或可 能包含外顯子的基因組DNA片段）可W用作探針。
[0146] 核酸酶保護(hù)測定（Nuclease Protection Assay,包括核糖核酸酶保護(hù)測定和Sl核 酸酶測定）提供了用于檢測和定量特異性mRNA的極其靈敏的方法。NPA的基礎(chǔ)是反義探 針（放射標(biāo)記的或非同位素的）與RNA樣品的溶液雜交。在雜交之后，單鏈的未雜交探針 和RNA被核酸酶降解。剩余的受保護(hù)片段在丙帰醜胺凝膠上分離。NPA允許對(duì)若干RNA種 類的同時(shí)檢測。
[0147] 原位雜交（ISH)是對(duì)細(xì)胞或組織中的特異性mRNA的定位而言有力且通用的工具。 探針的雜交發(fā)生于細(xì)胞或組織內(nèi)。由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)在整個(gè)程序中得W保持，ISH提供了關(guān)于 組織樣品中mRNA的位置信息。
[014引該程序通過將樣品固定在中性緩沖性福爾馬林中并且將組織包埋入石蠟中來起 始。然后將該些樣品切成薄切片，并且固定至顯微鏡玻片上。可替代地，可W將組織進(jìn)行切 片冷凍并且之后固定在多聚甲酵中。在一系列洗涂W脫蠟并且再水合該些切片之后，進(jìn)行 蛋白激酶K的降解，W增加探針可及性，并且然后使標(biāo)記探針與樣品切片雜交。用干燥于玻 片上的液膜使放射標(biāo)記的探針可視化，而非同位素標(biāo)記的探針便利地利用比色或英光試劑 來檢測。檢測的后一方法是英光原位雜交（FISH)的基礎(chǔ)。
[0149] 可W采用的用于檢測的方法包括放射活性標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、英光標(biāo)記 和其他合適的標(biāo)記。
[0150] 典型地，RT-PCR用于擴(kuò)增RNA祀標(biāo)。在此過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶用于將RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ) DNA (CDNA)，然后可W將其進(jìn)行擴(kuò)增W協(xié)助檢測。相對(duì)定量RT-PCR涉及在擴(kuò)增感興趣基因 的同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)部對(duì)照物。該內(nèi)部對(duì)照物用于對(duì)樣品進(jìn)行歸一化。一旦歸一化，可W在該些 樣品中做出特異性mRNA的相對(duì)豐度的直接比較。通常使用的內(nèi)部對(duì)照物包括例如GAPDH、 HPRT、肌動(dòng)蛋白和親環(huán)蛋白。
[0151] 許多DNA擴(kuò)增方法是已知的，大多數(shù)方法依賴于酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或自我持續(xù)序列復(fù)制）或來自已經(jīng)將其克隆入內(nèi)的全部或部分載體 的復(fù)制。
[0152] 許多祀標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增（TA巧方法已經(jīng)描述于文獻(xiàn)中，例如，在蘭德格倫 (Landegren)，U.等人，《科學(xué)》（Science) 242:229-237 (1988)和路易斯（Lewis)，R.，《基因 工程新聞》（Genetic !Engineering News) 10:1,54-55(1990)中對(duì)該些方法的總體綜述。
[0153] PCR是一種核酸擴(kuò)增方法，除其他外描述于US 4, 683, 195和4, 683, 202中。 PCR可W用于在診斷背景下擴(kuò)增任何已知的核酸（莫（Mok)等人，1994,《婦科腫瘤學(xué)》 佑ynaecologic Oncology) 52:247-252)。自我持續(xù)序列復(fù)制（3SR)是一種TAS的變體，它 涉及核酸模板經(jīng)由連續(xù)多輪的逆轉(zhuǎn)錄（RT)、聚合酶和核酸酶活性的恒溫?cái)U(kuò)增，該擴(kuò)增是由 酶混合物和適當(dāng)?shù)墓押饲伤嵋锝閷?dǎo)的（瓜泰利（Guatelli)等人，1990,《美國國家科學(xué)院 院刊》（Proc.化tl. Acad. Sci. USA) 87:1874)。連接擴(kuò)增反應(yīng)或連接擴(kuò)增體系使用DNA連接 酶W及四種寡核巧酸，其中每個(gè)祀標(biāo)鏈兩種。該技術(shù)由吳（Wu),D.Y.和華萊± (Wallace)， R.B. ,1989,《基因組學(xué)》佑enomics)4:560描述。在Q目復(fù)制酶技術(shù)中，用于瞻菌體Q目的 復(fù)制單鏈RNA的RNA復(fù)制酶被用于擴(kuò)增祀標(biāo)DNA，如由利薩爾迪（Lizardi)等人，1988,《生 物 / 技術(shù)》炬i〇/Technology)6:1197 描述。
[0154] 定量PCR(Q-PCR)是允許確定樣品內(nèi)的轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量的技術(shù)。在此描述了用于 進(jìn)行QPCR的合適方法。
[0155] 可W在本發(fā)明中使用替代擴(kuò)增技術(shù)。例如，滾環(huán)復(fù)制（利薩爾迪（Lizardi)等人， 1998,《自然基因組學(xué)》（化t Genet) 19:225)是一種可商購的擴(kuò)增技術(shù)（RCAT?)，它由DNA 聚合酶驅(qū)動(dòng)并且可W采用線性或幾何動(dòng)力學(xué)在恒溫條件下復(fù)制環(huán)狀寡核巧酸探針。另外的 技術(shù)，鏈置換擴(kuò)增（SDA;瓦爾克（Wa化er)等人，1992,《美國國家科學(xué)院院刊》（Proc.化tl. Acad. Sci. USA)80:392)用針對(duì)特異性祀標(biāo)而言唯一的特異性限定的序列開始。
[0156] 適合的用于檢測在此鑒別的Akt3或Akt2的表達(dá)的合適探針可W便利地W測試試 劑盒的形式包裝于合適的容器中。在此類試劑盒中，探針可W結(jié)合至固體支持物上，其中試 劑盒所設(shè)計(jì)針對(duì)的測定形式需要該種結(jié)合。該試劑盒還可W包含合適的用于處理有待探針 檢測的樣品的、使探針與樣品中的核酸雜交的試劑，對(duì)照試劑，說明書，等等。合適的試劑盒 可W包括例如用于QPCR反應(yīng)的引物或用于進(jìn)行FI甜的標(biāo)記探針。
[0157] 化）在多膚水平上
[0158] 改變的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)還可W通過測量由Akt3或Akt2基因編碼的多膚來檢 巧IJ。該可W通過使用結(jié)合至由Akt3或Akt2基因編碼的多膚上的分子來實(shí)現(xiàn)。用W檢測蛋 白質(zhì)存在的直接或間接結(jié)合至多膚的合適分子/試劑包括天然存在的分子，例如膚和蛋白 質(zhì)，如抗體，或者它們可W是合成分子。
[0159] 用于Akt3或Akt2基因或蛋白質(zhì)的抗體可W衍生自商業(yè)來源或通過對(duì)于本領(lǐng)域的 技術(shù)人員熟悉的技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，并且在改變的表達(dá)通過蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的翻譯 后修飾形式的改變的表達(dá)來顯示其自身的情況下，可W使用對(duì)于該些不同形式具有特異性 的抗體。
[0160] 用于產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如果多克隆抗體是希望的，則將 選擇的哺乳動(dòng)物（例如，小鼠、兔、山羊、馬等）用來自多膚的具有一個(gè)或多個(gè)表位的免疫原 性多膚進(jìn)行免疫。將來自經(jīng)免疫動(dòng)物的血清進(jìn)行收集并且根據(jù)已知程序處理。如果包含針 對(duì)來自多膚的表位的多克隆抗體的血清包含針對(duì)其他抗原的抗體，則可W通過免疫親和層 析來純化該些多克隆抗體。用于產(chǎn)生并處理多克隆抗血清的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。為 了產(chǎn)生更大的免疫原性反應(yīng)，多膚或其片段可W半抗原化為另一種多膚，W用于用作動(dòng)物 或人類中的免疫原。
[0161] 針對(duì)多膚中的表位的單克隆抗體還可W易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生。用于由雜交 瘤制造單克隆抗體的通用方法是熟知的。產(chǎn)生抗體的永生化細(xì)胞系可W通過細(xì)胞融合來 產(chǎn)生，并且還可W通過其他技術(shù)來產(chǎn)生，例如用癌性DNA直接轉(zhuǎn)化B淋己細(xì)胞、或用艾普斯 登一己爾巧PStein-Barr)病毒轉(zhuǎn)染。針對(duì)本發(fā)明的多膚中的表位產(chǎn)生的一系列單克隆抗 體可W針對(duì)不同特性進(jìn)行篩選；即針對(duì)同種型和表位親和力。
[0162] 替代技術(shù)涉及篩選瞻菌體展示文庫，該文庫中例如瞻菌體在它們的包衣的表面上 表達(dá)具有多種互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的SCFv片段。該技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0163] 出于本發(fā)明的意圖，除非相反地指明，術(shù)語"抗體"包括全抗體或全抗體的保持其 針對(duì)祀標(biāo)抗原的結(jié)合活性的片段。此類片段包括Fv、F(油'）和F(油'）2片段，W及單鏈抗 體（scFv)。另外，抗體或其片段可W是人源化抗體，例如如在EP 239400A中所述。例如，單 克隆和多克隆抗體、重組抗體、抗體的蛋白質(zhì)水解和重組片段（F油、Fv、scFv、雙體）、單一 結(jié)構(gòu)域抗體（VHH、sdAb、納米體、IgNAR、VNAR)、W及與抗體不相關(guān)的已經(jīng)被工程化為具有抗 體樣特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如W下：
[0164]
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別患有Akt3相關(guān)病癥的受試者的方法，該方法包括評(píng)估該受試者中或一個(gè) 衍生自該受試者的樣品中的Akt3的表達(dá)或活性的水平。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法鑒別具有發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的特定風(fēng)險(xiǎn) 的一位受試者，該方法包括評(píng)估該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3的表 達(dá)或活性的水平，增加的Akt3表達(dá)或活性的水平指示該受試者發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥 的增加的風(fēng)險(xiǎn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法鑒別一位受試者中癌癥干細(xì)胞的存在，該方法 包括確定該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3表達(dá)或活性的水平，增加的 Akt3的表達(dá)或活性指示癌癥干細(xì)胞（CSC)的存在。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法鑒別經(jīng)受上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的一 位受試者，該方法包括確定該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3表達(dá)或活 性的水平，Akt3的表達(dá)或活性的增加指示EMT的發(fā)生。
5. -種對(duì)一位受試者中的癌癥相關(guān)結(jié)果進(jìn)行預(yù)后的方法，該方法包括評(píng)估該受試者中 或一個(gè)衍生自該受試者的樣品中的Akt3活性或表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品，Akt3活性或表達(dá)的增加指 示出對(duì)用一種能夠抑制或逆轉(zhuǎn)EMT的藥劑進(jìn)行的治療的敏感性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該藥劑是一種Akt3抑制劑或一種Axl抑制劑。
8. -種鑒別Axl活性的方法，該方法包括確定該受試者中或一個(gè)衍生自該受試者的樣 品中的Akt3的表達(dá)或活性的水平，增加的Akt3的表達(dá)或活性與Axl活性相關(guān)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者是哺乳動(dòng)物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該受試者是人類。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者或衍生自該受試者的樣 品中的表達(dá)或活性的水平是相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品確定的。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估該受試者中或一個(gè)衍 生自該受試者的樣品中的Akt2的表達(dá)或活性的水平，其中降低的Akt2表達(dá)或活性的水平 指示： (i) 該受試者患有一種Akt3相關(guān)病癥； (ii) 發(fā)展轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的增加的風(fēng)險(xiǎn)； (iii) 一種癌癥干細(xì)胞的存在；和/或 (iv) EMT的發(fā)生。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中確定Akt3而非Aktl和/或Akt2 的表達(dá)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中Akt3的表達(dá)水平是通過相對(duì)于一 個(gè)對(duì)照樣品而言確定編碼Akt3的基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行評(píng)估，其中該拷貝數(shù)的增加指示增 加的Akt3表達(dá)水平。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中Akt3的表達(dá)水平是通過確定Akt3 蛋白質(zhì)或mRNA的水平來評(píng)估的。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中Akt3活性是通過確定Akt3的磷 酸化來評(píng)估的，其中Akt3的磷酸化指示活性Akt3。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中Akt3磷酸化確定為在絲氨酸472處。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中Akt3活性是通過確定Akt3蛋白 質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位來評(píng)估的，其中在細(xì)胞核中的定位指示活性Akt3。
19. 一種選擇患者優(yōu)選人類患者以便治療一種Akt3相關(guān)病癥的方法，該方法包括鑒別 具有升高的Akt3活性或表達(dá)的患者，并且選擇由此鑒別的患者用于治療。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的選擇患者的方法，其中該Akt3相關(guān)病癥是癌癥。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20中任一項(xiàng)所述的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng) 所述的方法鑒別該患者。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中該治療包括給予一種能夠抑制或 逆轉(zhuǎn)EMT的藥劑。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該藥劑包括一種Akt3抑制劑或一種Axl抑制 劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中該癌癥或Akt3相關(guān)病癥是一種選 自乳癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肺癌或神經(jīng)膠質(zhì)瘤的癌癥。
25. -種用于在Akt3相關(guān)病癥的治療中使用的Akt3抑制劑。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的Akt3抑制劑，其中該病癥是癌癥。
27. -種用于在EMT的抑制中使用的Akt3抑制劑。
28. -種能夠抑制Akt3活性的化合物，用于在一位患有癌癥的受試者中預(yù)防、抑制、或 治療耐藥性，該方法包括使該受試者接觸一種能夠抑制Akt3活性的化合物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求25至28中任一項(xiàng)所述的Akt3抑制劑，與另一種治療劑相組合。
30. -種治療一位患有Akt3相關(guān)病癥的受試者的方法，該方法包括使該受試者接觸一 種Akt3抑制劑或藥物化合物，該Akt3抑制劑或藥物化合物被選擇作為或衍生自一種通過 根據(jù)權(quán)利要求42至46中任一項(xiàng)所述的方法獲得的候選化合物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的治療一位患有Akt3相關(guān)病癥的受試者的方法，該方法包括 定期地評(píng)估該受試者中的Akt3活性。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中該Akt3相關(guān)病癥是癌癥。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30、31或32所述的方法，其中該受試者的治療是根據(jù)Akt3活性的檢 測水平調(diào)整的。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者正用一種Axl抑制劑治 療。
35. -種抑制一位受試者中的EMT的方法，該方法包括使該受試者接觸一種能夠抑制 Akt3活性的化合物。
36. -種抑制一位受試者中的癌癥干細(xì)胞的方法，該方法包括使該受試者接觸一種能 夠抑制Akt3活性的化合物。
37. 根據(jù)權(quán)利要求30至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者還接觸另一種癌癥治療 劑。
38. -種預(yù)防或抑制一位患有癌癥的受試者中的耐藥性的方法，該方法包括使該受試 者接觸一種能夠抑制Akt3活性的化合物。
39. 根據(jù)權(quán)利要求30至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者是哺乳動(dòng)物。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中該受試者是人類。
41. 根據(jù)權(quán)利要求25至29中任一項(xiàng)所述的Akt3抑制劑，或根據(jù)權(quán)利要求37至40 中任一項(xiàng)所述的治療方法，其中該另一種治療劑是一種選自以下項(xiàng)的癌癥治療：烷化劑， 包括烷基磺酸鹽例如白消安，氮芥例如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、二氯 甲基二乙胺、美法侖、以及烏拉莫司汀，乙烯亞胺衍生物例如噻替派，亞硝基脲例如卡莫司 汀、洛莫司汀、以及鏈佐星，三氮烯例如達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、以及替莫唑胺，鉬化合物例如 順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、賽特鉬、以及吡鉬奧納鉬、四鉬、螺鉬、異丙鉬、氯代（二亞乙基二氨 基）_鉬（II)氯化物、二氯（亞乙基二氨基）-鉬（II)、二氨基（2-乙基丙二酸根）合鉬 (II)、（1，2_二氨基環(huán)己燒）丙二酸根合鉬（II)、（4-羧基酞）-(1,2-二氨基環(huán)己燒）合 鉬（II)、（1，2_二氨基環(huán)己烷）-(異檸檬酸根）合鉬（II)、以及（1，2_二氨基環(huán)己烷）-順 式-(丙酮酸根）合鉬（II);抗代謝物，包括葉酸拮抗物例如甲氨喋呤、普美曲塞、雷替曲 塞、以及三甲曲沙，啼陡類似物例如阿扎胞苷、卡培他濱、阿糖胞苷、依達(dá)曲沙、氟尿苷、氟尿 嘧啶、吉西他濱、以及曲沙他濱，以及嘌呤類似物例如克拉屈濱、氯脫氧腺苷、克羅拉濱、氟 達(dá)拉濱、巰基嘌呤、噴司他丁、以及硫鳥嘌呤；天然產(chǎn)物，包括抗腫瘤抗生素例如博來霉素、 更生霉素、光輝霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、泊非羅霉素、以及蒽環(huán)類，如道諾霉素、多柔比 星、表柔比星、伊達(dá)比星、以及戊柔比星，有絲分裂抑制劑例如長春花生物堿長春花堿、文韋 西爾、長春新堿、長春地辛、以及長春瑞濱，酶例如L-天冬酰胺酶和PEG-L-天冬酰胺酶，微 管聚合物穩(wěn)定劑例如紫杉烷紫杉醇和多西他賽，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑例如喜樹堿伊立替康 和拓?fù)涮婵担约巴負(fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑例如鬼臼毒素、安吖啶、依托泊苷、替尼泊苷、洛索 蒽醌以及放線菌素；激素和激素拮抗劑，包括雄激素例如氟甲睪酮和睪內(nèi)酯，抗雄激素例如 比卡魯胺、環(huán)丙孕酮、氟他米特、以及尼魯米特，皮質(zhì)類固醇例如地塞米松和強(qiáng)的松，芳香酶 抑制劑例如氨魯米特、阿那曲唑、依西美坦、福美司坦、以及來曲唑；雌激素例如己烯雌酚， 抗雌激素例如氟維司群、雷洛昔芬、它莫西芬、以及托瑞米芬，促黃體激素釋放激素（LHRH) 激動(dòng)劑和拮抗劑例如阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、組氨瑞林、德索瑞林、醋酸 那法瑞林以及曲普瑞林，孕酮例如醋酸甲羥孕酮以及醋酸甲地孕酮，以及甲狀腺激素例如 左旋甲狀腺素以及碘塞羅寧；PKB通路抑制劑，包括哌立福辛、鹽酸恩扎斯托瑞、以及曲西 立濱，P13K抑制劑例如塞瑪福爾和SF1126,以及MTOR抑制劑例如雷帕霉素和類似物；⑶K 抑制劑，包括瑟立西克立、埃爾沃茨迪、以及7-羥基十字孢堿；COX-2抑制劑，包括塞來昔 布；HDAC抑制劑，包括曲古抑菌素 A、辛二酰苯胺氧肟酸、以及衣多星；DNA甲基化酶抑制 齊U，包括替莫唑胺，以及其他雜項(xiàng)藥劑，包括六甲蜜胺、三氧化二砷、薩力多胺、來那度胺、硝 酸鎵、左旋咪唑、米托坦、羥基脲、奧曲肽、丙卡巴肼、蘇拉明、光動(dòng)力化合物如甲氧沙林和卟 吩姆鈉，以及蛋白酶體抑制劑例如硼替佐米；分子靶向治療劑，包括：功能性治療劑，包括 基因治療劑，反義治療劑，酪氨酸激酶抑制劑例如鹽酸埃羅替尼、吉非替尼、甲磺酸伊馬替 尼、以及瑟馬沙尼，Raf抑制劑例如索拉非尼，以及基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑例如類視黃醇和類視黃 醇X受體合成物，例如阿達(dá)帕林、貝沙羅汀、反式視黃酸、9-順式-視黃酸、以及N-(4-羥 苯基）維甲酰胺；以及表型定向治療劑，包括單克隆抗體例如阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔 單抗、替坦異貝莫單抗、利妥昔單抗、以及曲妥單抗，免疫毒素例如吉妥珠單抗奧唑米星，放 射免疫偶聯(lián)物例如I-托西妥莫抗體，以及癌癥疫苗；生物治療劑，包括：干擾素例如干擾 素 -[a ]2a和干擾素 -[a ] 2b，以及白介素例如阿地白介素、地尼白介素、以及奧普瑞白介 素抗癌療法，涉及使用包括以下項(xiàng)的保護(hù)劑或輔佐劑：細(xì)胞保護(hù)劑例如氨磷汀以及右雷佐 生，膦酸鹽例如帕米膦酸鹽以及唑來膦酸鹽，以及刺激因子例如依泊亭、達(dá)泊亭、非格司亭、 PEG-非格司亭、以及沙格司亭；以及Axl抑制劑，例如1-(6,7-二氫-5H-苯并[6, 7]環(huán) 庚[l，2-c]噠嗪-3-基）-N3-((7-(S)_ 吡咯烷-1-基）-6,7,8,9_ 四氫-5H-苯并[7]輪 烯-2-基）-1H-1，2, 4-三唑-3, 5-二胺；或另外的組合化療方案，例如以下組合：卡鉬/紫 杉醇、卡培他濱/多西他賽、氟尿嘧啶/左旋咪唑、氟尿嘧啶/亞葉酸、甲氨喋呤/亞葉酸、 以及曲妥單抗/紫杉醇，單獨(dú)地或另外與卡鉬組合，等等。
42. -種選擇有用于預(yù)防、抑制或治療Akt3相關(guān)病癥的藥物化合物的方法，該方法包 括提供一組候選藥物化合物用于測試，在一個(gè)測試系統(tǒng)中測試候選藥物化合物對(duì)Akt3活 性的作用，并且基于對(duì)Akt3活性的抑制選擇一種候選藥物化合物。
43. -種選擇有用于治療轉(zhuǎn)移性或耐藥性癌癥的候選藥物化合物的方法，該方法包括 提供一組候選藥物化合物用于測試，在一個(gè)測試系統(tǒng)中測試候選藥物化合物對(duì)Akt3活性 的作用，并且基于其對(duì)Akt3活性的抑制選擇一種候選藥物化合物。
44. 一種選擇有用于預(yù)防或抑制EMT的候選藥物化合物的方法，該方法包括提供一組 候選藥物化合物用于測試，在一個(gè)測試系統(tǒng)中測試候選藥物化合物對(duì)Akt3活性的作用，并 且基于對(duì)Akt3活性的抑制選擇一種候選藥物化合物。
45. -種選擇有用于預(yù)防、抑制或治療Akt3相關(guān)病癥的候選藥物化合物的方法，該方 法包括選擇性地降低一種測試細(xì)胞中的Akt3的表達(dá)，使該測試細(xì)胞接觸該候選藥物化合 物，并且確定該候選藥物化合物對(duì)Akt3活性抑制的作用。
46. -種選擇有用于預(yù)防、抑制或治療Akt3相關(guān)病癥的候選藥物化合物的方法，該方 法包括選擇性地將一種體外測試系統(tǒng)中Akt3的表達(dá)降低至一個(gè)低水平，使該測試系統(tǒng)接 觸一種候選藥物化合物，并且選擇抑制Akt3活性的候選藥物化合物。
47. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中選擇基本上或完全抑制Akt3活性的候選藥物化 合物。
48. 根據(jù)權(quán)利要求45、46或47所述的選擇候選藥物化合物的方法，其中Akt3活性的抑 制是通過EMT的減少而指示。
49. 根據(jù)權(quán)利要求44至48中任一項(xiàng)所述的方法，其中在該測試系統(tǒng)中Akt3在細(xì)胞中 的表達(dá)降低 90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、或 20%。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中Akt3的表達(dá)降低以至于不導(dǎo)致EMT的抑制。
51. 根據(jù)權(quán)利要求44至50中任一項(xiàng)所述的方法，其中Akt3的表達(dá)是通過將一種干擾 Akt3表達(dá)的核苷酸引入該測試系統(tǒng)中的細(xì)胞中而得以選擇性地降低。
52. -種對(duì)EMT的抑制劑敏感的細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有恰好不足以預(yù)防EMT的Akt3表 達(dá)水平。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的細(xì)胞系，該細(xì)胞系是一種人類細(xì)胞系。
54. -種鑒別抑制Akt3活性的化合物的方法，該方法包括使來自根據(jù)權(quán)利要求52或 53的細(xì)胞系的細(xì)胞接觸一種測試化合物，并且確定在該細(xì)胞中Akt3活性的抑制。
55. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中Akt3活性的抑制是通過EMT的抑制來鑒別的。 56. Akt3作為一種生物標(biāo)志物用以檢測一位受試者中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT) 的發(fā)生的用途。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的用途，其中Akt3的表達(dá)和/或激活的增加指示上皮細(xì)胞向 間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的發(fā)生。 58. Akt3作為一種生物標(biāo)志物用以檢測Axl的表達(dá)和/或激活的用途，其中Akt3的表 達(dá)和/或激活的增加指示Axl的表達(dá)和/或激活的增加。
59. -種用于檢測一個(gè)樣品中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的發(fā)生的方法，所述方 法包括 對(duì)分離自一種細(xì)胞、細(xì)胞群、動(dòng)物模型或人類的一個(gè)樣品中的Akt3的表達(dá)水平或激活 相比于一個(gè)對(duì)照樣品進(jìn)行確定，其中相對(duì)于該對(duì)照樣品Akt3的表達(dá)水平或激活的增加指 示上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的發(fā)生。
60. -種鑒別能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的藥劑的方法，所述方 法包括向一種細(xì)胞、細(xì)胞群或動(dòng)物模型給予所述藥劑，并且監(jiān)測Akt3的激活和/或表達(dá)。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，該方法包括： (i) 向一種細(xì)胞、細(xì)胞群或一種動(dòng)物模型而不是人類給予該藥劑；并且 (ii) 對(duì)衍生自處理的和未處理的細(xì)胞或動(dòng)物模型的樣品中的Akt3表達(dá)和/或Akt3激 活進(jìn)行測量；并且 (iii) 相比于未處理的樣品，對(duì)處理的樣品中的Akt3的表達(dá)和/或激活的增加進(jìn)行檢 測，作為抑制或逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT)的能力的指示。
62. 根據(jù)權(quán)利要求60或權(quán)利要求61所述的方法，其中該動(dòng)物模型不是人類。
63. 根據(jù)權(quán)利要求57至62中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中Akt3的表達(dá)水平是通過 相對(duì)于一個(gè)對(duì)照樣品確定編碼Akt3的基因的拷貝數(shù)來評(píng)估的，其中該拷貝數(shù)的增加指示 增加的Akt3表達(dá)水平。
64. 根據(jù)權(quán)利要求56至63中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中Akt3的表達(dá)水平是通過 確定Akt3蛋白質(zhì)或mRNA的水平來評(píng)估的。
65. 根據(jù)權(quán)利要求56至64中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中Akt3活性是通過確定 Akt3的磷酸化來評(píng)估的，其中Akt3的磷酸化指示Akt3活性。
66. 根據(jù)權(quán)利要求65所述的用途或方法，其中Akt3磷酸化確定為在絲氨酸472處。
67. 根據(jù)權(quán)利要求56至66中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中Akt3活性是通過確定 Akt3蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位來評(píng)估的，其中在細(xì)胞核中的定位指示活性Akt3。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104335046SQ201380023276
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月2日
【發(fā)明者】J.洛倫斯, C.蒂隆 申請(qǐng)人:卑爾根生物股份公司