一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法及顯微鏡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于顯微掃描【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法，包括：將同一光源輸出的掃描激光分為第一方向掃描激光和第二方向掃描激光；兩路掃描激光垂直投射在樣品上，激發(fā)樣品熒光，投射方向相反；探測(cè)收集樣品上激發(fā)的熒光并曝光成像；移動(dòng)樣品，重復(fù)上述過程直到掃描獲取完整的樣品圖像；其中，兩路掃描激光同步掃描，產(chǎn)生光片激發(fā)樣品，投射方向?yàn)閤軸方向；掃描方向?yàn)閥軸方向；樣品的熒光采集方向?yàn)閦軸方向；兩路掃描激光的掃描初始位置為掃描陣面的中線處；兩路掃描激光的掃描方向相反。本發(fā)明通過采用雙光束掃描激光對(duì)透明樣品進(jìn)行光片照明成像，以期獲得更高的成像速率；通過圖像頻域權(quán)重疊加提升成像質(zhì)量。
【專利說明】一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法及顯微鏡

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及顯微成像【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法 及顯微鏡。

【背景技術(shù)】
[0002] 光片照明顯微鏡是利用微米級(jí)的激發(fā)光薄片激發(fā)樣品的熒光，用全場(chǎng)探測(cè)的方式 實(shí)現(xiàn)樣品的快速熒光信號(hào)探測(cè)。光片照明顯微成像采用了線狀照明取代傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描成像 方式，因此它具有更高的成像速率，更高的信噪比以及更低的光漂白光毒性效應(yīng)，適用于數(shù) 小時(shí)甚至數(shù)天的活體生物成像。
[0003] 傳統(tǒng)共聚焦光片照明顯微成像技術(shù)受限于成像器件的曝光模式，這種掃描方式無 法做到滿幀速率的讀出，且不能利用回程掃描的光束，因此極大限制了成像速率，進(jìn)而限制 了整體系統(tǒng)的成像速率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提升成像速率光片照明顯微成像技術(shù)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法，包 括以下步驟：
[0006] 將同一光源輸出的掃描激光分為第一方向掃描激光和第二方向掃描激光；
[0007] 所述第一方向掃描激光和所述第二方向掃描激光垂直投射在樣品上，激發(fā)樣品突 光；且所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的投射方向相反；
[0008] 探測(cè)收集樣品上激發(fā)的熒光并曝光成像；
[0009] 移動(dòng)樣品，重復(fù)上述過程直到掃描獲取完整的樣品圖像；
[0010] 其中，所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光同步掃描，且掃描速度一 致；
[0011] 所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的投射方向?yàn)閄軸方向；所述第 一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的掃描方向?yàn)閥軸方向；樣品的突光米集方向?yàn)?z軸方向；
[0012] 所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的掃描初始位置為掃描陣面的 中線處；所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的掃描方向相反。
[0013] 進(jìn)一步地，所述第一方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸正向掃描，在掃描 陣列的y軸正向邊緣折返，沿y軸負(fù)向掃描，直至完成掃描陣面內(nèi)的圖像掃描；所述第二方 向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸負(fù)向掃描，在掃描陣列的y軸負(fù)向邊緣折返，沿y 軸正向掃描，直至完成掃描陣面內(nèi)的圖像掃描。
[0014] 進(jìn)一步地，分別對(duì)第一方向掃描激光和第二方向掃描激光激發(fā)的樣品突光進(jìn)行曝 光輸出的樣品圖像進(jìn)行傅立葉變換，獲取頻域分布；將兩個(gè)圖像進(jìn)行基于頻域分布的權(quán)重 疊加，輸出樣品圖像。
[0015] 進(jìn)一步地，所述第一方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸正向掃描，直至完 成掃描陣面中線一側(cè)的圖像掃描；所述第二方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸負(fù) 向掃描，直至完成掃描陣面中線另一側(cè)內(nèi)的圖像掃描。
[0016] 進(jìn)一步地，投射在樣品上的所述掃描激光呈線狀。
[0017] 一種雙光束光片照明顯微鏡，其特征在于，包括：
[0018] 照明單元，用于產(chǎn)生基于同光源的兩路掃描激光并投射到樣品相對(duì)的兩側(cè)面上；
[0019] 探測(cè)成像單元，用于探測(cè)收集掃描激光激發(fā)的樣品熒光并曝光成像；
[0020] 控制單元，產(chǎn)生控制時(shí)序，控制照明單元進(jìn)行掃描動(dòng)作；同時(shí)控制探測(cè)成像單元進(jìn) 行熒光探測(cè)和圖像曝光，并將兩路掃描激光激發(fā)樣品熒光產(chǎn)生的兩幅圖像進(jìn)行圖像疊加， 獲取完整圖像；
[0021] 其中，所述控制單元設(shè)置樣品移動(dòng)結(jié)構(gòu)，用于承載和移動(dòng)樣品。
[0022] 進(jìn)一步地，所述照明單元包括：光源；
[0023] 分光結(jié)構(gòu)，將光源輸出的光信號(hào)分為兩路等光強(qiáng)的兩束掃描激光；
[0024] 光路轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)換光路，將兩路掃描光信號(hào)垂直投射在樣品相對(duì)的兩側(cè)面上；
[0025] 其中，所述光路轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)設(shè)置倒像裝置，使一路所述掃描激光產(chǎn)生倒像。
[0026] 進(jìn)一步地，所述探測(cè)成像單元包括：圖像傳感器；所述圖像傳感器為兩塊，分別探 測(cè)收集兩路掃描激光激發(fā)的樣品熒光，并進(jìn)行曝光成像，輸出圖像數(shù)據(jù)。
[0027] 進(jìn)一步地，所述控制單元包括：控制器；所述控制器接收?qǐng)D像數(shù)據(jù)，進(jìn)行圖像重 構(gòu)；并生成控制時(shí)序，控制光源進(jìn)行掃描動(dòng)作；同時(shí)，驅(qū)動(dòng)樣品移動(dòng)結(jié)構(gòu)動(dòng)作，移動(dòng)承載樣 品；其中，圖像重構(gòu)是先將兩路掃描激光激發(fā)樣品熒光產(chǎn)生的兩幅圖像進(jìn)行傅立葉變換，獲 取頻域分布；再將兩個(gè)圖像進(jìn)行基于頻域分布的權(quán)重疊加，輸出樣品圖像。
[0028] 進(jìn)一步地，所述光源還包括：聲光可調(diào)濾波器AT0F ;所述AT0F連接在所述光源與 分光結(jié)構(gòu)之間，控制光源通斷。
[0029] 本發(fā)明提供的雙光束光片照明顯微掃描成像方法通過雙光束光片掃描樣品相對(duì) 的兩側(cè)獲取樣品圖像信號(hào)；再將兩路圖像信號(hào)疊加獲得樣品的完整圖像信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)滿 幀速率的數(shù)據(jù)采集，實(shí)現(xiàn)成像速度的倍增，大大提升成像；另一方面通過兩側(cè)交替照明，疊 加圖像信號(hào)的方式可以降低圖像信號(hào)中背景的權(quán)重，從而降低背景的干擾大大提升圖像成 像的質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的雙光束光片照明顯微掃描成像技術(shù)的光路圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的雙光束光片掃描示意圖；
[0032] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的雙光束光片掃描曝光不意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明提供了一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法，包括以下步驟：
[0034] 將同一光源輸出的掃描激光分為第一方向掃描激光和第二方向掃描激光；
[0035] 第一方向掃描激光和第二方向掃描激光垂直投射在樣品上，激發(fā)樣品熒光；且第 一方向掃描激光與第二方向掃描激光的投射方向相反；
[0036] 探測(cè)收集樣品上激發(fā)的熒光并曝光成像；
[0037] 移動(dòng)樣品，重復(fù)上述過程直到掃描獲取完整的樣品圖像；
[0038] 其中，第一方向掃描激光與第二方向掃描激光同步掃描，且掃描速度一致；
[0039] 第一方向掃描激光與第二方向掃描激光的投射方向?yàn)閄軸方向；第一方向掃描激 光與第二方向掃描激光的掃描方向?yàn)閥軸方向；樣品的突光米集方向?yàn)閦軸方向；
[0040] 第一方向掃描激光與第二方向掃描激光的掃描初始位置為掃描陣面的中線處；第 一方向掃描激光與第二方向掃描激光的掃描方向相反。
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例提供的光片照明顯微掃描成像技術(shù)為一種通過兩束反向光束掃描 產(chǎn)生光片，執(zhí)行掃描的方法，針對(duì)透明樣品；將光源投射到樣品上，激發(fā)熒光，通過圖像傳感 設(shè)備收集熒光進(jìn)行圖像曝光和圖像重構(gòu)。
[0042] 本實(shí)施例中，通過一個(gè)穩(wěn)定光源分成兩束呈光片的掃描信號(hào)：第一方向掃描激光 和第二方向掃描激光，保證兩路掃描激光屬性相同，包括：頻率、光強(qiáng)等。
[0043] 鑒于樣品是透明的，通常樣品經(jīng)過前期加工，能夠保有一定的厚度，通過光片掃描 信號(hào)能夠完整的獲得圖像信息；本實(shí)施例提供的方法，通過移動(dòng)樣品，調(diào)節(jié)樣品的位置，獲 得多個(gè)局部的圖形圖像信息，之后重構(gòu)形成三維立體圖形信息。
[0044] 本實(shí)施例中，通過兩側(cè)掃描，獲得兩個(gè)獨(dú)立的圖形數(shù)據(jù)信號(hào)，分別獨(dú)立曝光重構(gòu)圖 像；鑒于兩側(cè)測(cè)量的背景不同，而樣品本身結(jié)構(gòu)一致，因此，兩個(gè)圖像信號(hào)疊加之后，會(huì)增強(qiáng) 樣品本身的圖像信息權(quán)重，弱化背景區(qū)域的圖像信息，從而提升圖像質(zhì)量，更為清晰地反映 樣品本身的信息。
[0045] 同時(shí)鑒于方法本身的原理要求，兩路掃描信號(hào)同步掃描，從而基于同一時(shí)間坐標(biāo) 系，完整掃描過程，方便圖像疊加的信息對(duì)應(yīng)，避免重疊覆蓋或者干擾遺漏。掃描激光投射 到樣品的方向?yàn)閄軸方向，第一方向掃描激光和第二方向掃描激光垂直投射在樣品上，激 發(fā)樣品突光；且第一方向掃描激光與第二方向掃描激光的投射方向相反；第一方向掃描激 光與第二方向掃描激光同步掃描，且掃描速度一致；掃描激光的掃描方向?yàn)閥軸方向；激發(fā) 的樣品的突光米集方向?yàn)閆軸方向；兩束掃描光束從圖像中線處分別向y軸正負(fù)方向執(zhí)行 掃描動(dòng)作，從而針對(duì)兩路激發(fā)熒光，從而提升掃描速度。通過圖像傳感器進(jìn)行同步曝光時(shí)， 進(jìn)行滾動(dòng)式行曝光，從而產(chǎn)生虛擬狹縫，阻擋焦平面以外的雜散光，保證圖像質(zhì)量。
[0046] 第一方向掃描激光與第二方向掃描激光的掃描初始位置為掃描陣面的中線處；第 一方向掃描激光與第二方向掃描激光的掃描方向相反；兩路掃描信號(hào)投射在樣品上的初始 位置為掃描陣面的中線處，通過掃描信號(hào)對(duì)樣品進(jìn)行線狀激發(fā)，因此收集到的熒光也將獲 得線狀曝光；兩路掃描信號(hào)的掃描方向相反；即以掃描陣列中線為起點(diǎn)，兩路掃描信號(hào)分 別掃描樣品的一半?yún)^(qū)域，獲得樣品的一半圖形圖像信息；然后將兩者以坐標(biāo)以及時(shí)間軸為 對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)疊加構(gòu)成完整的圖像信息。第一方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸正向 掃描，直至完成掃描陣面中線一側(cè)的圖像掃描；第二方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿 y軸負(fù)向掃描，直至完成掃描陣面中線另一側(cè)內(nèi)的圖像掃描；從而大大提升掃描效率。
[0047] 或者第一方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸正向掃描，在掃描陣列的y軸 正向邊緣折返，沿y軸負(fù)向掃描，直至完成掃描陣面內(nèi)的圖像掃描；所述第二方向掃描激光 自掃描陣面中線開始，沿y軸負(fù)向掃描，在掃描陣列的y軸負(fù)向邊緣折返，沿y軸正向掃描， 直至完成掃描陣面內(nèi)的圖像掃描。分別對(duì)第一方向掃描激光和第二方向掃描激光激發(fā)的樣 品熒光進(jìn)行曝光輸出的樣品圖像進(jìn)行傅立葉變換，獲取頻域分布；將兩個(gè)圖像進(jìn)行基于頻 域分布的權(quán)重疊加，輸出樣品圖像。即，當(dāng)一側(cè)的掃描激光完成中線一側(cè)的樣品掃描完成 后，折返到中線的另一側(cè)，繼續(xù)掃描剩下的部分，從而獲取完整的圖像信息；最后將兩路圖 像獲得兩側(cè)的像信息疊加，大大削弱圖像中的背景權(quán)重，提升圖像質(zhì)量。參見圖1，本實(shí)施例 提供的掃描方法的光路圖，光源1輸出穩(wěn)定光束，經(jīng)過光路結(jié)構(gòu)傳遞，通過分光結(jié)構(gòu)分成兩 束，在經(jīng)過光路轉(zhuǎn)換投射到樣品6的兩側(cè)，激發(fā)樣品6的熒光；最終熒光收集到圖像傳感器 10內(nèi)進(jìn)行曝光和數(shù)據(jù)輸出，得圖像數(shù)據(jù)信息。
[0048] 參見圖2,掃描信號(hào)通過物鏡13和物鏡5投射在樣品6上，以中線為界，分別掃描 一半樣品；或者，通過折返掃描完整圖像；即，形成分時(shí)交替照明掃描提升掃描效率。
[0049] 參見圖3,掃描曝光方式為線形曝光，最終與掃描同步的曝光圖像是線形輸出的。
[0050] 基于上述掃描顯微方法，本實(shí)施例還提出一種雙光束光片照明顯微鏡，包括：
[0051] 照明單元，用于產(chǎn)生基于同光源的兩路掃描激光并投射到樣品相對(duì)的兩側(cè)面上；
[0052] 探測(cè)成像單元，用于探測(cè)收集掃描激光激發(fā)的樣品熒光并曝光成像；
[0053] 控制單元，產(chǎn)生控制時(shí)序，控制照明單元進(jìn)行掃描動(dòng)作；同時(shí)控制探測(cè)成像單元進(jìn) 行熒光探測(cè)和圖像曝光，并進(jìn)行圖像疊加；
[0054] 其中，所述控制單元設(shè)置樣品移動(dòng)結(jié)構(gòu)，用于承載和移動(dòng)樣品。
[0055] 參見圖1，本實(shí)施例還提供一種具體的顯微結(jié)構(gòu)，照明單元包括：光源1，輸出穩(wěn)定 掃描光束；在光源1輸出端添加聲光可調(diào)濾波器AT0F14 ;當(dāng)振鏡回程，即兩光束回到掃描陣 面中線位置的這段時(shí)間中以及樣品移動(dòng)過程中，通過AT0F阻止光照到樣品上，減小光毒性 及光漂白；同時(shí)，聲光可調(diào)濾波器AT0F14能夠?yàn)V除雜光，保證掃描光束質(zhì)量，從而保證成像 質(zhì)量。
[0056] 光路轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)換光路，將兩路掃描光信號(hào)投射在樣品相對(duì)的兩側(cè)面上；
[0057] 其中，光路轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)設(shè)置倒像裝置，使一路所述掃描激光產(chǎn)生倒像。即，通過倒像 裝置使掃描信號(hào)產(chǎn)生倒像，保證掃面信號(hào)的掃描方向相反，從而掃描樣品中線兩側(cè)的部分。 倒像裝置12可以選用中繼棱鏡或者道威棱鏡，改變光路掃描方向。
[0058] 掃描信號(hào)的光強(qiáng)須保持相同，優(yōu)選的，通過設(shè)置衰減片15,降低光強(qiáng)較強(qiáng)的一路掃 描信號(hào)。
[0059] 掃描信號(hào)的動(dòng)作須保持同步，以期獲得良好的圖像同步性；優(yōu)選的，設(shè)置光學(xué)元件 同時(shí)控制兩路信號(hào)的掃描動(dòng)作，替代分別控制掃描動(dòng)作的方式；可以采用振鏡3,設(shè)置在聲 光可調(diào)濾波器14與分光結(jié)構(gòu)11之間；通過振鏡3振動(dòng)，調(diào)整掃描信號(hào)的矢量方位，從而完 成掃描信號(hào)的掃描方向的調(diào)整。
[0060] 分光結(jié)構(gòu)，可以采用常規(guī)的分光鏡11。
[0061] 為了應(yīng)對(duì)不同尺寸樣品或者使用對(duì)象的需求，優(yōu)選的，在掃描光束進(jìn)入振鏡3前， 先經(jīng)過擴(kuò)束鏡2,擴(kuò)大光束直徑和散發(fā)角度。
[0062] 掃描信號(hào)投射到樣品前，兩路掃描信號(hào)可以分別經(jīng)過物鏡5和物鏡13聚焦投射到 樣品的聚焦平面上，保證充分的光強(qiáng)。
[0063] 圖像傳感器為兩塊，分別探測(cè)收集兩路掃描激光激發(fā)的樣品熒光，并進(jìn)行曝光成 像，輸出圖像數(shù)據(jù)。探測(cè)成像單元包括：圖像傳感器10 ;圖像傳感器10探測(cè)收集掃描光信 號(hào)激發(fā)的樣品熒光，并進(jìn)行曝光成像，輸出圖像數(shù)據(jù)。為了便于圖像傳感器10收集熒光信 號(hào)，可以通過光學(xué)元件收集，可以通過物鏡7、管鏡8以及濾光鏡9傳輸給圖像傳感器10 ;獲 得集中，純凈的熒光信號(hào)。
[0064] 控制單元包括：控制器；控制器接收?qǐng)D像數(shù)據(jù)，進(jìn)行圖像重構(gòu)；并生成控制時(shí)序， 控制光源進(jìn)行掃描動(dòng)作；同時(shí)，驅(qū)動(dòng)樣品移動(dòng)結(jié)構(gòu)動(dòng)作，移動(dòng)承載樣品。
[0065] 圖像傳感器為兩塊，分別對(duì)應(yīng)收集兩路掃描激光激發(fā)的樣品熒光。兩塊芯片可以 獨(dú)立在X方向上分別向相反方向同時(shí)進(jìn)行滾動(dòng)式行曝光從而產(chǎn)生虛擬狹縫，以阻擋焦平面 以外的雜散光，圖像傳感器與掃描光片相互配合，可以兩倍的速度對(duì)一幅圖進(jìn)行成像。
[0066] 本實(shí)施例可進(jìn)行快速的三維成像。A0TF通光，振鏡開始掃描，左右兩個(gè)光束從圖像 中間開始向相反方向掃描，分別進(jìn)行一半樣品的線狀激發(fā)，被激發(fā)的行與圖像傳感器曝光 的行同步，進(jìn)行成像，圖像傳感器完成曝光后的行進(jìn)行數(shù)據(jù)讀出，隨后A0TF阻止光源通過， 樣品移動(dòng)一個(gè)步進(jìn)，光片交替成像，反復(fù)重復(fù)以上即可得到三維體積成像。A0TF、振鏡、平移 臺(tái)、圖像傳感器緊密相互配合，振鏡僅進(jìn)行半個(gè)周期的掃描即可得到一幀圖像，比現(xiàn)有的光 片照明顯微系統(tǒng)成像速度提高一倍。
[0067] 本實(shí)施例中，物鏡根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要可以選擇水鏡或干鏡，濾光片將會(huì)阻擋激發(fā)光， 僅使樣本發(fā)出的熒光通過。照明單元就是形成照亮小部分樣品的光片的單元。光束首先被 擴(kuò)束，然后經(jīng)過振鏡，最后充滿照明物鏡后瞳，聚焦在照明物鏡焦平面。照明物鏡焦平面與 探測(cè)物鏡焦平面垂直。通過控制單元給振鏡斜三角波信號(hào)，振鏡振動(dòng)，在照明物鏡后形成光 片，激發(fā)一層樣品。受激發(fā)的樣品發(fā)出熒光由探測(cè)光路收集并在圖像傳感器上成像。其中， 樣本被固定在0.5% -1%的瓊脂糖膠中，該糖膠適合樣本生存，并且糖膠的折射率與水的 折射率相近，便于照明與成像?？刂茊卧梢钥刂埔苿?dòng)單元，振鏡完成一個(gè)振動(dòng)周期后，平 移臺(tái)移動(dòng)一個(gè)步進(jìn)，成一幀圖像。從而實(shí)現(xiàn)了熒光樣品的三維層析成像。光片照明顯微成 像采用了線狀照明取代傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描成像方式，具有更高的成像速率，更高的信噪比以及 更低的光漂白光毒性效應(yīng)。
[0068] 本發(fā)明提供的雙光束光片照明顯微掃描成像方法通過雙光束光片掃描樣品相對(duì) 的兩側(cè)獲取樣品圖像信號(hào)；再將兩路圖像信號(hào)疊加獲得樣品的完整圖像信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)滿 幀速率的數(shù)據(jù)采集，實(shí)現(xiàn)成像速度的倍增，大大提升成像；另一方面通過兩側(cè)交替照明，疊 加圖像信號(hào)的方式可以降低圖像信號(hào)中背景的權(quán)重，從而降低背景的干擾大大提升圖像成 像的質(zhì)量。
[0069] 最后所應(yīng)說明的是，以上【具體實(shí)施方式】?jī)H用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制， 盡管參照實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明 的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1. 一種雙光束光片照明顯微掃描成像方法，其特征在于，包括以下步驟： 將同一光源輸出的掃描激光分為第一方向掃描激光和第二方向掃描激光； 所述第一方向掃描激光和所述第二方向掃描激光垂直投射在樣品上，激發(fā)樣品熒光； 且所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的投射方向相反； 探測(cè)收集樣品上激發(fā)的熒光并曝光成像； 移動(dòng)樣品，重復(fù)上述過程直到掃描獲取完整的樣品圖像； 其中，所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光同步掃描，且掃描速度一致； 所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的投射方向?yàn)閄軸方向；所述第一方 向掃描激光與所述第二方向掃描激光的掃描方向?yàn)閥軸方向；樣品的熒光采集方向?yàn)閦軸 方向； 所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的掃描初始位置為掃描陣面的中線 處；所述第一方向掃描激光與所述第二方向掃描激光的掃描方向相反。
2. 如權(quán)利要求1所述的雙光束光片照明顯微掃描成像方法，其特征在于：所述第一方 向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸正向掃描，在掃描陣列的y軸正向邊緣折返，沿y 軸負(fù)向掃描，直至完成掃描陣面內(nèi)的圖像掃描；所述第二方向掃描激光自掃描陣面中線開 始，沿y軸負(fù)向掃描，在掃描陣列的y軸負(fù)向邊緣折返，沿y軸正向掃描，直至完成掃描陣面 內(nèi)的圖像掃描。
3. 如權(quán)利要求2所述的雙光束光片照明顯微掃描成像方法，其特征在于：分別對(duì)第一 方向掃描激光和第二方向掃描激光激發(fā)的樣品熒光進(jìn)行曝光輸出的樣品圖像進(jìn)行傅立葉 變換，獲取頻域分布；將兩個(gè)圖像進(jìn)行基于頻域分布的權(quán)重疊加，輸出樣品圖像。
4. 如權(quán)利要求1所述的雙光束光片照明顯微掃描成像方法，其特征在于：所述第一方 向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸正向掃描，直至完成掃描陣面中線一側(cè)的圖像掃 描；所述第二方向掃描激光自掃描陣面中線開始，沿y軸負(fù)向掃描，直至完成掃描陣面中線 另一側(cè)內(nèi)的圖像掃描。
5. 如權(quán)利要求1所述的雙光束光片照明顯微掃描成像方法，其特征在于：投射在樣品 上的所述掃描激光呈線狀。
6. -種雙光束光片照明顯微鏡，其特征在于，包括： 照明單元，用于產(chǎn)生基于同光源的兩路掃描激光并投射到樣品相對(duì)的兩側(cè)面上； 探測(cè)成像單元，用于探測(cè)收集掃描激光激發(fā)的樣品熒光并曝光成像； 控制單元，產(chǎn)生控制時(shí)序，控制照明單元進(jìn)行掃描動(dòng)作；同時(shí)控制探測(cè)成像單元進(jìn)行熒 光探測(cè)和圖像曝光，并將兩路掃描激光激發(fā)樣品熒光產(chǎn)生的兩幅圖像進(jìn)行圖像疊加，獲取 完整圖像； 其中，所述控制單元設(shè)置樣品移動(dòng)結(jié)構(gòu)，用于承載和移動(dòng)樣品。
7. 如權(quán)利要求6所述的雙光束光片照明顯微鏡，其特征在于，照明單元包括：光源； 分光結(jié)構(gòu)，將光源輸出的光信號(hào)分為兩路等光強(qiáng)的兩束掃描激光； 光路轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)換光路，將兩路掃描光信號(hào)垂直投射在樣品相對(duì)的兩側(cè)面上； 其中，所述光路轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)設(shè)置倒像裝置，使一路所述掃描激光產(chǎn)生倒像。
8. 如權(quán)利要求6所述的雙光束光片照明顯微鏡，其特征在于，所述探測(cè)成像單元包括： 圖像傳感器；所述圖像傳感器為兩塊，分別探測(cè)收集兩路掃描激光激發(fā)的樣品熒光，并進(jìn)行 曝光成像，輸出圖像數(shù)據(jù)。
9. 如權(quán)利要求8所述的雙光束光片照明顯微鏡，其特征在于，所述控制單元包括：控制 器；所述控制器接收?qǐng)D像數(shù)據(jù)，進(jìn)行圖像重構(gòu)；并生成控制時(shí)序，控制光源進(jìn)行掃描動(dòng)作； 同時(shí)，驅(qū)動(dòng)樣品移動(dòng)結(jié)構(gòu)動(dòng)作，移動(dòng)承載樣品； 其中，圖像重構(gòu)是先將兩路掃描激光激發(fā)樣品熒光產(chǎn)生的兩幅圖像進(jìn)行傅立葉變換， 獲取頻域分布；再將兩個(gè)圖像進(jìn)行基于頻域分布的權(quán)重疊加，輸出樣品圖像。
10. 如權(quán)利要求7所述的雙光束光片照明顯微鏡，其特征在于，所述光源還包括：聲光 可調(diào)濾波器ATOF ;所述ATOF連接在所述光源與分光結(jié)構(gòu)之間，控制光源通斷。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104155274SQ201410388051
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】付玲, 楊哲, 梅麗, 龔輝, 駱清銘 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)