本發(fā)明涉及檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，更特別地，生物標(biāo)志物在鑒定檢疫性實(shí)蠅有效冷處理中的應(yīng)用及鑒定方法。

背景技術(shù)：

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程的深入，國際貿(mào)易日趨頻繁和多樣化，導(dǎo)致外來有害生物入侵頻率加大，對生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成巨大的潛在威脅。中國是水果進(jìn)出口大國，如何有效防范有害生物的跨境傳播，確保我國農(nóng)業(yè)、林業(yè)及生態(tài)安全，提高我國出口水果產(chǎn)品質(zhì)量，已經(jīng)成為我國出入境檢疫部門關(guān)注的重點(diǎn)之一。

水果能夠傳帶多種危險(xiǎn)性外來有害生物，特別是地中海實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅等水果產(chǎn)業(yè)的毀滅性檢疫有害生物，寄主范圍極廣，幾乎包含所有經(jīng)濟(jì)類水果，繁殖力和適應(yīng)性強(qiáng)，其卵、幼蟲、蛹都可隨寄主類果實(shí)、包裝物及運(yùn)輸工具進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。一旦傳入就有暴發(fā)成災(zāi)的可能，其結(jié)果不僅釀成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且對新侵入地區(qū)的果蔬種植業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。為了防止外來生物入侵并滿足口岸快速通關(guān)的需要，一般的做法只能在入境口岸實(shí)施溴甲烷熏蒸處理。但溴甲烷作為臭氧層消耗物質(zhì)，雖然檢疫用途的溴甲烷消費(fèi)屬于《蒙特利爾議定書》的豁免范圍，但是近年來，國際社會(huì)要求包括檢疫中使用的溴甲烷都應(yīng)加速淘汰的呼聲越來越高，歐盟已于2010年全面禁止了所有用途的溴甲烷使用。目前較為廣泛的檢疫處理方法為冷處理。

然而，有些攜帶有害生物的水果不經(jīng)冷處理，就試圖進(jìn)入我國市場。還有些進(jìn)行過冷處理后，幼蟲不會(huì)立刻死亡，甚至有些幼蟲會(huì)通過滯育度過脅迫階段。目前對于昆蟲是否進(jìn)行檢疫處理鑒定的技術(shù)還處于空白階段，主要還局限在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)觀察的方法，須經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后才能判讀是否進(jìn)行過冷處理，或者判斷處理是否有效，但這么做耗時(shí)較長(一般需一周以上)，影響入境貨物的通關(guān)速度。所以，快速判別幼蟲是否進(jìn)行冷處理，較好地防范了外來有害生物的入侵，對保障我國生物安全有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。因此，需要一種快速可靠的方法來鑒定待檢疫的貨物是否進(jìn)行過有效的冷處理。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于代謝組學(xué)技術(shù)，依靠現(xiàn)代化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)模型系統(tǒng)，處理分析不同處理的昆蟲體內(nèi)的代謝物質(zhì)，提取出有用的特征，從而達(dá)到靈敏、準(zhǔn)確、高效識別昆蟲幼蟲處理有效性的目的，為檢驗(yàn)檢疫決策做出有力的技術(shù)支持。

基于此，本發(fā)明提供了生物標(biāo)志物在鑒定檢疫性實(shí)蠅有效冷處理中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述生物標(biāo)志物為α-羥基戊二酸或焦棓酸。

本發(fā)明還提供了一種鑒定檢疫性實(shí)蠅有效冷處理的方法，其包括以下步驟：

S1：從待檢疫的檢疫性實(shí)蠅樣品提取總代謝物，檢測所述總代謝物中生物標(biāo)志物的含量；

S2：將所述待檢疫的檢疫性實(shí)蠅樣品的總代謝物中的生物標(biāo)志物的含量與對照數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，如果比較結(jié)果為差異顯著，并且所述生物標(biāo)志物含量滿足閾值時(shí)，則判定所述待檢疫的檢疫性實(shí)蠅進(jìn)行了有效冷處理。

進(jìn)一步地，所述生物標(biāo)志物的含量通過GC/MS檢測得到。

進(jìn)一步地，S1包括以下步驟：

S1.1：提取總代謝物，得到總代謝物提取液；

S1.2：向所述總代謝物提取液中添加內(nèi)標(biāo)；

S1.3：吹干，加入甲基化試劑進(jìn)行甲基化；

S1.4：加入烷基化試劑進(jìn)行烷基化；

S1.5：進(jìn)行GC/MS檢測

S1.6：通過數(shù)據(jù)分析得到所述生物標(biāo)志的含量。

優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)為半乳糖醇。

進(jìn)一步地，所述對照數(shù)據(jù)為未經(jīng)冷處理的檢疫性實(shí)蠅的總代謝物中的生物標(biāo)志物含量。

進(jìn)一步地，S3中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)比較為t檢驗(yàn)，當(dāng)t檢驗(yàn)結(jié)果為P值小于0.05(即，差異顯著)，并且待待檢疫的檢疫性實(shí)蠅的總代謝物中的生物標(biāo)志物含量與未經(jīng)冷處理的檢疫性實(shí)蠅的總代謝物中的生物標(biāo)志物含量的比值的Log₂對數(shù)大于1或小于-1(即，含量達(dá)到閾值)時(shí)，判定所述待檢疫的檢疫性實(shí)蠅進(jìn)行了有效冷處理。

優(yōu)選地，在進(jìn)行t檢驗(yàn)后，還進(jìn)行受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC曲線)繪制，當(dāng)ROC曲線的曲線下面積大于0.9時(shí)，表示所述判定的準(zhǔn)確性高。

優(yōu)選地，所述生物標(biāo)志物為α-羥基戊二酸或焦棓酸。

本發(fā)明通過代謝組學(xué)分析技術(shù)篩選出用于檢疫處理(特別是檢疫冷處理有效性的判別中)的生物標(biāo)志物，通過本發(fā)明對檢疫性實(shí)蠅幼蟲進(jìn)行快速、高通量篩查，靈敏度和準(zhǔn)確度高，縮短了檢疫處理觀察期判別的時(shí)間，大大降低了檢疫處理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的成本，為保障我國水果進(jìn)出口貿(mào)易順利進(jìn)行，提升我國生物安全，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

附圖說明

圖1為對照組和冷處理組的總離子流(TIC)色譜圖；

圖2為對照組與冷處理組PLS-DA得分圖；

圖3為冷處理組與對照組OPLS-DA得分圖。

具體實(shí)施方式

1.檢疫性實(shí)蠅幼蟲冷處理

將實(shí)蠅幼蟲裸蟲放入含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于0℃的控溫箱中，保持6h。對照組幼蟲為裸蟲，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，通過溫度記錄儀監(jiān)測對照組和處理組的環(huán)境溫度。然后用液氮將經(jīng)冷處理的實(shí)蠅幼蟲和對照組幼蟲用液氮速凍，并儲存于-80℃。

2.樣本的代謝組前處理

取-80℃儲存的實(shí)蠅幼蟲(3齡，10頭，總重約160mg)，加入200μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，置入組織破碎儀(TissueLyser II)破碎(30Hz，2min)；取出，加入800μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，渦漩震蕩30s，4℃放置20min，冷凍離心(4℃，16000g，15min)，取800μL上清液轉(zhuǎn)入一新的EP管中；向殘?jiān)尤?mL色譜級甲醇，渦漩震蕩30s，4℃放置20min，冷凍離心(4℃，16000g，15min)，取上清液1mL，與第1次的上清液混合；

取100μL提取液加入玻璃衍生小瓶，加入20μl內(nèi)標(biāo)水溶液(dulicitol,100ng/μL)，混合，氮?dú)獯蹈?，加?0μL的20mg/mL鹽酸甲氧胺吡啶溶液，37℃震蕩反應(yīng)90min；加入40μL的BSTFA(含1％TMCS)的衍生試劑，70℃反應(yīng)60min；取出衍生后的樣本，室溫放置30min，進(jìn)行GC/MS代謝組學(xué)分析。

3.檢疫性實(shí)蠅幼蟲代謝組GC/MS分析

采用Agilent 7890A GC/5975C MS系統(tǒng)，毛細(xì)管色譜柱為Agilent J&W Scientific公司的HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)。

儀器參數(shù)設(shè)定為：進(jìn)樣口溫度280℃，EI離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，高純氦氣(純度大于99.999％)作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0μL。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，維持2min，10℃/min的速度升至140℃，然后以4℃/min的速度升至240℃，最后以15℃/min的速度升至300℃，并維持8min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測范圍為50-600(m/z)。采用隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，避免因儀器信號波動(dòng)而造成的影響，得到的質(zhì)譜圖如圖1所示。

4.數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括基線過濾、峰識別、積分、保留時(shí)間校正、峰對齊和質(zhì)譜碎片歸屬分析，最后在EXCEL2007軟件中進(jìn)行后期編輯，包括來自于柱流失和樣本制備造成的雜質(zhì)峰的剔除和定量離子選擇等，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(rt_mz，即保留時(shí)間_質(zhì)荷比)、觀察量(樣本)和積分面積。然后將所有數(shù)據(jù)歸一化到內(nèi)標(biāo)峰(即峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積)。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件(版本11.0)分別進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)。

5.偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)

采用PLS-DA這種監(jiān)督的多維統(tǒng)計(jì)分析方法對對照和冷處理兩組樣本進(jìn)行模型分析。共獲得2個(gè)主成分，累積R²Y＝0.991，Q²＝0.906，得分圖如圖2所示(橫坐標(biāo)為第1主成分得分，用t[1]表示，R²Y＝0.935；縱坐標(biāo)為第2主成分得分，用t[2]表示，R²Y＝0.0561))。模型解釋率(R²Y)和模型預(yù)測率均接近于1(最高值為1)，說明PLS-DA模型可以非常好地解釋兩組樣本之間的差異，而且當(dāng)前模型的預(yù)測率也非常高，是對未知樣本進(jìn)行預(yù)測的理想數(shù)學(xué)模型。圖2表明對照組和冷處理組之間在得分圖上具有顯著的代謝譜分離，兩組樣本分別處于第1主成分(即t[1])的正負(fù)兩側(cè)，因此兩組樣本之間具有顯著的代謝差異。

6.正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)

采用正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)過濾與模型分類不相關(guān)信號即正交信號，建立可靠的OPLS-DA模型。模型質(zhì)量參數(shù)為：1個(gè)主成分(R²Y＝0.935)和1個(gè)正交成分(R²Y＝0.0561)，累積R²Y＝0.991，Q²＝0.867，說明模型質(zhì)量非常好。OPLS-DA得分圖如圖3所示。過濾掉與分類不相關(guān)的噪音信號后，兩組樣本在PC1(即t[1]P)上具有很好的代謝譜分離，即兩組樣本分別處于主成分(PC1，即t[1]P)的正負(fù)兩側(cè)。對照組內(nèi)的變異性顯著大于冷處理組，表現(xiàn)為對照組內(nèi)具有各樣本之間具有更大的離散性。

7.差異性代謝物及其結(jié)構(gòu)鑒定

由于過濾掉了不相關(guān)的正交信號，因而獲得的差異性代謝物更加可靠。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(閾值>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)(t-test)的p值(閾值0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(比較質(zhì)譜和色譜保留時(shí)間RT或保留指數(shù)RI)，以及采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)比對確定。

因此，該發(fā)明方法可以將冷處理組與對照組之間的差異性分開，靈敏度和特異性高，代謝物達(dá)到41個(gè)，其中23個(gè)代謝物下降，18個(gè)代謝物上升(表2)，確認(rèn)了冷處理組和對照組的代謝差異，可用于檢疫性實(shí)蠅幼蟲冷處理有效性檢測。在以后的檢測中，只需要針對表2中的這41個(gè)代謝物進(jìn)行以上代謝組學(xué)檢測以及PLS-DA和OPLS-DA分析即可。

表2.冷處理組與對照組之間的差異性代謝物

*冷處理組與對照組均值之比的對數(shù)值(以2為底)，正號表示冷處理組相對于對照組上升，負(fù)號表示下降。

在以上方案的基礎(chǔ)上，發(fā)明人從這41種差異性代謝物之中進(jìn)一步篩選出能夠代表有效冷處理的生物標(biāo)志物，以在保證檢測準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步地簡化檢測程序。

8.代謝組學(xué)GC-MS分析后物質(zhì)峰值鑒別冷處理的ROC曲線分析及生物標(biāo)志物質(zhì)鑒定

根據(jù)代謝組學(xué)檢測結(jié)果，冷處理的診斷采用t-test檢測，篩選對照與冷處理組間有顯著差異(P＜0.05)，以Log₂為底，折疊倍數(shù)(Fold change)大于1的代謝物。同時(shí)，以(1-特異性)為橫坐標(biāo)，敏感度為縱坐標(biāo)繪制ROC曲線。ROC曲線分析將某試驗(yàn)的靈敏度及特異性聯(lián)系起來，是一種全面的、科學(xué)的評價(jià)檢測項(xiàng)目的方法。曲線下面積(AUC)越大，診斷的價(jià)值越大，AUC接近0.5時(shí)，無診斷意義；AUC＜0.7，表示診斷準(zhǔn)確率較低；AUC在0.7-0.9，表示診斷準(zhǔn)確性中等；AUC＞0.9時(shí)，表示診斷有較高的準(zhǔn)確性。

如表3所示，冷處理組中，代謝物質(zhì)α-羥基戊二酸(alpha-hydroxyglutaric acid)和焦棓酸(pyrogallol)經(jīng)過ROC分析后AUC分別為1.00和0.97，且t-test檢驗(yàn)P值＜0.5，Log₂的折疊倍數(shù)分別為-1.15和1.13。該兩種物質(zhì)冷處理的生物標(biāo)志物。因此，判別是否進(jìn)行冷處理，且冷處理是否有效，需要對比待檢測組與對照組α-羥基戊二酸和焦棓酸是否有顯著差異，且該兩種物質(zhì)的峰面積或物質(zhì)濃度的Log₂的折疊倍數(shù)是否＞1。

表3 ROC曲線分析鑒別的冷處理生物標(biāo)志物質(zhì)

因此，以后可僅檢測羥基戊二酸和焦棓酸的含量，并通過t檢驗(yàn)、ROC曲線峰面積，以及Log₂折疊倍數(shù)來判斷。當(dāng)t檢驗(yàn)結(jié)果P＜0.05，為差異顯著，ROC曲線的AUC>0.7，Log₂折疊倍數(shù)大于1或小于-1時(shí)，判定樣品經(jīng)歷了有效冷處理。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。