本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生技術領域，具體涉及一種鐵蛋白定量檢測試劑盒、其制備及使用方法。
背景技術：
目前基于膠體金法或第一代熒光法的檢測試劑，在定量檢測精密度和準確性以及操作便利性方面還存在嚴重的缺陷。第一代熒光檢測法的鐵蛋白試劑大部分都是利用普通的熒光物質進行標記。普通的熒光物質Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測結果的準確性；普通熒光物質的熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。而且在生物流體和血清中的許多復合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，對檢測結果產生嚴重的干擾。1942年Wissman發(fā)現(xiàn)，某些β-二酮與銪配合后可吸收紫外光，發(fā)出強烈的銪離子的特征熒光。1979年，芬蘭SoiniHemmia提出時間分辨熒光免疫分析理論；2003年，上海新波生物技術有限公司應用該技術推出了首個體外診斷產品。目前，也有少數(shù)公司利用時間分辨免疫分析理論，做出了鐵蛋白定量檢測試劑，但是，這些鐵蛋白定量檢測試劑均需要加樣、孵育、洗滌等步驟，操作復雜，檢測時間長，而且需要專業(yè)人士操作，還不能做到即時檢測。
綜上，為了解決傳統(tǒng)鐵蛋白檢測存在的易受本底熒光干擾、靈敏度低、特異性差、操作復雜、檢測時間長并且不能做到即時檢測等不足，一種新的鐵蛋白定量檢測技術亟待開發(fā)。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種操作簡便、能夠實現(xiàn)即時檢測、并且靈敏度高、特異性好的鐵蛋白定量檢測試劑盒。本發(fā)明還相應提供了所述鐵蛋白定量檢測試劑盒的制備方法，所述制備方法能夠進一步提升所制得的鐵蛋白定量檢測試劑盒用于檢測鐵蛋白的靈敏度和特異性。同時，本發(fā)明還相應的提供了所述鐵蛋白定量檢測試劑盒的使用方法，該使用方法能夠消除試劑盒的本底熒光干擾，進一步提升檢測結果的靈敏度和特異性。
本發(fā)明的設計思路：非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長，可達1～2ms，能夠滿足測量要求，因此而產生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關閉激發(fā)光后再測定熒光強度的分析方法。鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移，最大可達290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜間不會相互重疊，加上其發(fā)射的光譜信號峰很窄，熒光壽命長，銪的熒光壽命可達730μs，檢測中只要在每個激發(fā)光脈沖過后采用延緩測量時間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開取樣門儀器記錄長壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高檢測的精密度。
本發(fā)明所采用的技術方案為：
本發(fā)明首先提供一種鐵蛋白定量檢測試劑盒，包括襯板，所述襯板的上表面依次搭接設置有樣品墊、結合墊、NC膜以及吸收墊，所述NC膜上設置有檢測線和質控線，所述NC膜的檢測線處包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，所述NC膜的質控線包被羊抗雞IgY多抗抗體；所述結合墊處設置有第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球和雞IgY標記的熒光微球。
相應的，本發(fā)明還提供了前述本發(fā)明的鐵蛋白定量檢測試劑盒的制備方法，該制備方法中“將各個預制好的部件按照結構要求組裝在一起”的具體方式是本領域技術人員根據(jù)行業(yè)通用知識可以輕松實現(xiàn)的，并且該部分并不是本發(fā)明的創(chuàng)新點所在，因此不再詳細贅述。本發(fā)明的制備方法中，結合墊以及NC膜的包被是至關重要的。
結合墊中的所述第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球通過以下步驟制備：S1、取熒光微球并用硼酸緩沖液稀釋，獲得熒光微球稀釋液；S2、向所得熒光微球稀釋液內加入EDC溶液進行活化，獲得熒光微球活化液；S3、將所得熒光微球活化液離心，去除上清液，取下層沉淀；S4、向下層沉淀內加入硼酸緩沖液進行復溶，然后加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液，搖床反應，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球溶液。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，進一步的特征優(yōu)化，結合墊中的所述第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球通過以下具體步驟制備實現(xiàn)：s1、取熒光微球并用50mmol/L的硼酸緩沖液稀釋10倍，得到熒光微球稀釋液；s2、每1000μL熒光微球稀釋液內加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃條件下以80rpm/min旋轉搖床，搖勻活化15min，獲得熒光微球活化液；s3、將所得熒光微球活化液在4～10℃條件下，以14000rpm/min離心10min，去除上清液，取下層沉淀；s4、向下層沉淀內加入硼酸緩沖液進行復溶，然后加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液得到標記反應體系，并使第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體在標記反應體系中的濃度為25μg/ml；將標記反應體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標記反應1h，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球溶液。
結合墊中的所述雞IgY標記的熒光微球通過以下步驟制備：P1、取熒光微球并用硼酸緩沖液稀釋，獲得熒光微球稀釋液；P2、向所得熒光微球稀釋液內加入EDC溶液進行活化，獲得熒光微球活化液；P3、將所得熒光微球活化液離心，去除上清液，取下層沉淀；P4、向下層沉淀內加入硼酸緩沖液進行復溶，然后加入雞IgY的稀釋液，搖床反應，即得到雞IgY標記的熒光微球溶液。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，進一步的特征優(yōu)化，結合墊中的所述雞IgY標記的熒光微球通過以下具體步驟制備實現(xiàn)：p1、取熒光微球并用50mmol/L的硼酸緩沖液稀釋10倍，得到熒光微球稀釋液；p2、每1000μL熒光微球稀釋液內加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃條件下以80rpm/min旋轉搖床，搖勻活化15min，獲得熒光微球活化液；p3、將所得熒光微球活化液在4～10℃條件下，以14000rpm/min離心10min，去除上清液，取下層沉淀；p4、向下層沉淀內加入硼酸緩沖液進行復溶，然后加入雞IgY的稀釋液得到標記反應體系，并使雞IgY在標記反應體系中的濃度為25μg/ml；將標記反應體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標記反應1h，即得到雞IgY標記的熒光微球溶液。
第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球和雞IgY標記的熒光微球分別制備獲取后，即可將兩者混合用于結合墊的制備，具體過程步驟為：將所得第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球溶液和雞IgY標記的熒光微球溶液混合得混合液，將混合液在乳膠墊上噴膜得到微球乳膠結合墊，將微球乳膠結合墊在37℃條件下烘干24h后即得所述結合墊。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述NC膜的制備方法為：向10mmol/L的PBS緩沖液中加入5wt％的蔗糖得到包被稀釋液，使用所述包被稀釋液分別稀釋第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體和羊抗雞IgY多抗抗體得到第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體稀釋液和羊抗雞IgY多抗抗體稀釋液，然后使用第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體稀釋液和羊抗雞IgY多抗抗體稀釋液分別在硝酸纖維素膜上的T線和C線處劃線，依次分別形成包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的檢測線和包被羊抗雞IgY多抗抗體的質控線，然后將硝酸纖維素膜在37℃條件下干燥4～6h即得所述NC膜。
出于消除本底熒光，降低本底干擾的角度考慮，本發(fā)明還提供了前述本發(fā)明的鐵蛋白定量檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：將待測樣品置于樣品墊，待測樣品由樣品墊向吸收墊層析，待測樣品經過結合墊進入NC膜的檢測線和質控線進行反應，反應結束后用紫外光源對NC膜的檢測線和質控線進行掃描，并通過檢測線和質控線熒光強度的強弱及其比值即T/C值，分析折算出樣品中待測物的濃度。
結合本發(fā)明提供的鐵蛋白定量檢測試劑盒及其制備方法，其原理是采用熒光微球雙抗體夾心免疫層析法定量檢測血清或血漿中的SF濃度。具體的：本產品檢測線包被有第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，質控線包被有羊抗雞IgY多抗抗體；待測樣品中的SF與結合墊中的納米熒光微球標記的第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體結合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體結合，形成熒光微球-第一鼠抗SF單抗-SF-第二鼠抗SF單抗夾心復合物并被固定在檢測線上。而雞IgY標記的熒光微球繼續(xù)向前層析，與固定在質控線的羊抗雞IgY多抗結合并固定。反應結束后，用紫外光源(365nm)對檢測區(qū)(即檢測線和質控線區(qū)域)掃描，檢測線和質控線上熒光納米微球發(fā)出高強度的熒光(615nm)，且衰變時間也較長。延緩測量時間，待樣品基質中自然發(fā)生的短壽命熒光(1-10ns)全部衰變后，再測量銪元素的特異性熒光，完全排除非特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質控線熒光強度的強弱及其比值即T/C值，分析出樣品中待測物的濃度，排除熒光強度隨時間延長而衰減對定量造成的影響。
本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明的鐵蛋白定量檢測試劑盒適用于體外定量檢測人血清、血漿以及全血中的鐵蛋白(SF)含量?？捎糜谌辫F性貧血的輔助診斷。鐵蛋白作為身體組織中主要貯存鐵質的一種蛋白，是維持鐵質平衡中不可缺少的一種重要蛋白。SF濃度代表體內儲存鐵的水平，因此，檢測SF濃度，可判定體內鐵儲存狀況。
本發(fā)明的提供的鐵蛋白定量檢測試劑盒，基于時間分辨熒光免疫層析法的理論基礎及前述設計思路，將長衰減壽命的標記物與時間分辨熒光技術相結合，使瞬時熒光干擾減到最小化。并且通過一步加樣，10分鐘即可讀取檢測結果，實現(xiàn)了更為方便快捷。
結合本發(fā)明的鐵蛋白定量檢測試劑盒及其使用方法，用于鐵蛋白檢測，可達到2.5ng/ml的靈敏度，不僅高于傳統(tǒng)的膠體金檢測法，而且高于目前市面上行業(yè)內的其他熒光免疫定量產品。進一步的，本發(fā)明的線性范圍寬，準確度、精密度優(yōu)于膠體金免疫層析，CV值比膠體金免疫層析小，因而檢測值更準確可靠。在檢測耗時方便，一次加樣、10min即可讀取檢測結果，實現(xiàn)了POCT即時檢測。通過干法工藝、一步即實現(xiàn)了鐵蛋白的檢測，方便快捷。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的鐵蛋白定量檢測試劑盒的結構示意圖。
圖中：1為樣品墊；2為結合墊；3為NC膜；4為吸收墊；5為襯板；“T”線為檢測線，“C”線為質控線。
具體實施方式
下面結合附圖以及具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
本發(fā)明中的熒光微球為稀土銪熒光微球，采購自南京基蛋生物科技有限公司。本發(fā)明中的其他試劑及儀器同樣皆為常見普通市售產品，此處不再一一贅述其各自來源。本發(fā)明中的第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體和第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體分別指代兩種不同結合位點的鐵蛋白單抗抗體。
實施例1：
如圖1所示，本實施例提供了一種鐵蛋白定量檢測試劑盒，包括襯板5，所述襯板5的上表面依次搭接設置有樣品墊1、結合墊2、NC膜3以及吸收墊4，所述NC膜3上設置有檢測線和質控線，所述NC膜3的檢測線處包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，所述NC膜3的質控線包被羊抗雞IgY多抗抗體；所述結合墊2處設置有第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球和雞IgY標記的熒光微球。
實施例2：
結合附圖1，本實施例提供前述實施例1所述鐵蛋白定量檢測試劑盒的具體制備方法，步驟如下：
1、取熒光微球并用50mmol/L的硼酸緩沖液稀釋10倍，得到熒光微球稀釋液。向熒光微球稀釋液內加入10mg/ml的EDC溶液每1000μL熒光微球稀釋液添加20～50μL的EDC溶液，然后置于搖床，并在4℃條件下以80rpm/min旋轉搖床，搖勻活化15min，獲得熒光微球活化液。將所得熒光微球活化液在4～10℃條件下，以14000rpm/min離心10min，去除上清液，取下層沉淀。向下層沉淀內加入硼酸緩沖液進行復溶。
2a、向步驟1所得下層沉淀的硼酸緩沖液復溶液中加入第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液得到標記反應體系，通過控制第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的稀釋液的添加量使第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體在標記反應體系中的濃度為25μg/ml。將標記反應體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標記反應1h，即得到第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球溶液。
2b、向步驟1所得下層沉淀的硼酸緩沖液復溶液中加入雞IgY的稀釋液得到標記反應體系，通過控制雞IgY的稀釋液的添加量使雞IgY在標記反應體系中的濃度為25μg/ml。將標記反應體系置于搖床，4℃條件下以80rpm/min搖勻1h，再繼續(xù)搖床標記反應1h，即得到雞IgY標記的熒光微球溶液。
3、將2a所得第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體標記的熒光微球溶液和2b所得雞IgY標記的熒光微球溶液按照1:1的比例混合均勻得到混合液。使用混合液在乳膠墊上進行噴膜得到微球乳膠結合墊，噴膜時混合液的用量為8μl/cm，然后將微球乳膠結合墊豎立放在試管架上，放入電熱恒溫鼓風干燥箱在37℃條件下烘干24h即得所述結合墊2，為了保證干燥，干燥后的結合墊2應在濕度≤20％的環(huán)境下取出，取出后裁剪成30cm×0.8cm的長條備用。
4、取硝酸纖維素膜并將其裁剪成30cm/段，將片段硝酸纖維素膜貼在襯板5的中間位置，襯板5為PVC板。向10mmol/L的PBS緩沖液中加入蔗糖得到包被稀釋液，蔗糖的加入量為所述PBS緩沖液的5wt％。使用所述包被稀釋液分別稀釋第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體和羊抗雞IgY多抗抗體得到第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體稀釋液和羊抗雞IgY多抗抗體稀釋液。然后使用第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體稀釋液和羊抗雞IgY多抗抗體稀釋液分別在硝酸纖維素膜上的T線和C線處劃線，依次分別形成包被第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體的檢測線和包被羊抗雞IgY多抗抗體的質控線。然后將包被好的硝酸纖維素膜放入電熱恒溫鼓風干燥箱，在37℃條件下干燥4～6h即得所述NC膜3。
5、將步驟3所得結合墊2設置在所述襯板5上，并搭接設置在所述NC膜3的左側。將樣品墊1設置在所述襯板5上，并搭接設置在結合墊2的左側。將吸收墊4設置在所述襯板5上，并搭接設置在所述NC膜3的右側。即得所述鐵蛋白定量檢測試劑盒。
實施例3：
本實施例提供實施例1所得鐵蛋白定量檢測試劑盒的使用方法，具體為：將待測樣品置于樣品墊1，待測樣品由樣品墊1向吸收墊4層析，待測樣品經過結合墊2進入NC膜3的檢測線和質控線進行反應，反應結束后用紫外光源對NC膜3的檢測線和質控線進行掃描，并通過檢測線和質控線熒光強度的強弱及其比值即T/C值，分析折算出樣品中待測物的濃度。
本實施例3具體使用時：檢測線包被有第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體，質控線包被有羊抗雞IgY多抗抗體；待測樣品中的SF與結合墊中的納米熒光微球標記的第一鼠抗鐵蛋白單克隆抗體結合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的第二鼠抗鐵蛋白單克隆抗體結合，形成熒光微球-第一鼠抗SF單抗-SF-第二鼠抗SF單抗夾心復合物并被固定在檢測線上。而雞IgY標記的熒光微球繼續(xù)向前層析，與固定在質控線的羊抗雞IgY多抗結合并固定。反應結束后，用紫外光源(365nm)對檢測區(qū)(即檢測線和質控線區(qū)域)掃描，檢測線和質控線上熒光納米微球發(fā)出高強度的熒光(615nm)，且衰變時間也較長。延緩測量時間，待樣品基質中自然發(fā)生的短壽命熒光(1-10ns)全部衰變后，再測量銪元素的特異性熒光，完全排除非特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質控線熒光強度的強弱及其比值即T/C值，分析出樣品中待測物的濃度，排除熒光強度隨時間延長而衰減對定量造成的影響。
結合本發(fā)明實施例1～3，在進一步的跟蹤測試中，所述實施例在鐵蛋白檢測方面具有操作簡便、能夠實現(xiàn)即時檢測、并且具有靈敏度高、特異性好的特點。采用干式檢測法能夠實現(xiàn)一步加樣，10分鐘即可讀取檢測結果，排除了本底熒光干擾，靈敏度可達到2.5ng/ml。
本發(fā)明不局限于上述最佳實施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下都可得出其他各種形式的產品，但不論在其形狀或結構上作任何變化，凡是具有與本申請相同或相近似的技術方案，均落在本發(fā)明的保護范圍之內。