專利名稱：用于檢測獸類疾病的免疫診斷測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種進(jìn)行獸類疾病免疫診斷檢測的裝置和方法。本發(fā)明尤其涉及通過測定動物體液內(nèi)的特定抗體檢測動物體液內(nèi)是否存在作為抗原的病毒或細(xì)菌蛋白。病毒或細(xì)菌蛋白通過高特異性抗原-抗體作用結(jié)合于壓電晶體傳感器表面的抗體上得到檢測。
背景技術(shù)：
本文中用于闡明本發(fā)明的背景或提供有關(guān)實際應(yīng)用方面的其它細(xì)節(jié)的出版物和其它材料，附于參考文獻(xiàn)中并為簡便起見集中列于參考文獻(xiàn)的附錄中。
在獸醫(yī)診斷實驗室，最常需要的診斷測試是診斷疾病，通常包括測試是否存在病毒或細(xì)菌抗原，或它們的抗體。傳統(tǒng)的方法學(xué)在這個領(lǐng)域中的實際應(yīng)用包括例如分離病毒、中和病毒、平板凝集、抑制血細(xì)胞凝集、免疫擴散、經(jīng)典微生物學(xué)培養(yǎng)技術(shù)、高壓液相色譜、和薄層色譜等，都是耗時和高成本的，需要數(shù)日或數(shù)周證實結(jié)果。為了加快和簡化當(dāng)前免疫分析技術(shù)，應(yīng)用高特異性的抗原抗體反應(yīng)愈加重要。諸如放射免疫分析(RIA)，免疫熒光分析(IFA)，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，和Western免疫印跡(WB)等技術(shù)已顯示了可信的成功率并且現(xiàn)在已應(yīng)用于獸醫(yī)診斷實驗室。
上述實驗室中使用的大部分免疫分析法需要相對昂貴的設(shè)備和熟練的技術(shù)人員。大部分測試包括手工操作和多個程序。例如，用于傳統(tǒng)病毒或細(xì)菌抗原/抗體檢測的固相夾心免疫分析法包括下述步驟(a)在固相支持物上固定抗體/抗原肽，(b)步驟(a)中固定的抗體/抗原與可能含有抗原/抗體的樣品反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，(c)用含去垢劑的清洗液清洗步驟(b)中的免疫復(fù)合物去除未結(jié)合的抗原/抗體，(d)免疫復(fù)合物和酶或放射性標(biāo)記的二抗反應(yīng)形成夾心復(fù)合物，(e)清洗除去未結(jié)合的標(biāo)記二抗分離夾心復(fù)合物，(f)加入可用作酶或放射性標(biāo)記物底物的復(fù)合物與夾心復(fù)合物反應(yīng)并可通過比色檢測催化反應(yīng)。
在分析過程中使用的放射性同位素或酶標(biāo)二抗存在的問題是使操作繁瑣并提高了分析成本。初始樣品處理到最終結(jié)果輸送過程中的多個反應(yīng)步驟和長時間孵育需要8-10小時。對試劑保鮮儲存，昂貴的設(shè)備和穩(wěn)定的電源供給的需要使得分析技術(shù)難以在沒有良好裝備的實驗室或非本領(lǐng)域的情況下進(jìn)行。
為克服這些需求導(dǎo)致的限制性進(jìn)行的努力使多種快速免疫分析方法得到發(fā)展。例如，斑點酶免疫分析(DEI)，斑點免疫結(jié)合分析(DIA)，和各種顆粒沉積測試已發(fā)展成為診斷病毒/細(xì)菌血清抗體的常規(guī)實驗室方法。在這些分析中，將抗原點到條狀或片狀硝酸纖維素膜上，而將血清加到吸附紙條上。用酶聯(lián)抗球蛋白和產(chǎn)生的有顏色的不溶的底物產(chǎn)物檢測抗原/抗體復(fù)合物。這個測試可以在相對短的時間(1-5小時)進(jìn)行血清測試。盡管這些分析可以擴展到實驗室環(huán)境以外進(jìn)行應(yīng)用，但它們的用途可能仍在某種程度上受限于酶類體系故有的溫度敏感性，及特定抗免疫球蛋白試劑(Heberling和Kalter，1986)。
也進(jìn)行過簡化和修改傳統(tǒng)免疫分析的其它嘗試。美國專利5,695,928公開了一種能夠在一個測試樣品中進(jìn)行多個測試物快速檢測的免疫分析方法。該發(fā)明的特點是在初級抗原-測試物復(fù)合物形成的同時抽提和分離測試物。接著將初級抗原-測試物復(fù)合物捕獲于可以促進(jìn)快速有效檢測的多縫隙固相支持物上。
美國專利5,630,924公布了通過毛細(xì)管電泳或其它電分離技術(shù)進(jìn)行超快速結(jié)合分析的組合物，方法，和裝置。
美國專利5,565,365公布了一種分析液態(tài)樣品的系統(tǒng)，它通過檢測在大量直徑為特定大小的小珠上形成的配體/結(jié)合物的放射性進(jìn)行分析。這種小珠是一種多孔物質(zhì)位于與液體多孔篩相連的導(dǎo)管中，液體多孔篩的孔徑小于小珠的直徑。大量常磁顆粒懸浮于導(dǎo)管中，在足夠大強度的磁場作用下排列成液體多孔篩。
美國專利5,554,340公布了一種液體樣品分析系統(tǒng)，它使用了典型的熒光標(biāo)簽。該系統(tǒng)包括一種透鏡，它能夠聚集激發(fā)光和熒光，它還涉及一種液流管道，此管道橫穿光軸并且通過透鏡的聚焦區(qū)。管道中，鄰近聚焦區(qū)有一個或多個機械篩，這些篩可以以珠的直徑為函數(shù)捕獲小珠的通過。這種小珠至少一部分用配基/結(jié)合物，如特異性結(jié)合配基，預(yù)先包被，基本上優(yōu)選可通過激發(fā)光和熒光的透明材料。
美國專利5,212,065公布了一種快速免疫分析裝置，包括作為試劑支持物和消耗試劑儲存池的單孔膜。免疫分析裝置指導(dǎo)其中樣品和試劑的流動，消除試劑的側(cè)向擴散和逆流，無需額外的外部裝置。
美國專利5,236,824公布了一種原位激光磁力免疫分析(LMIA)方法，此方法排除了免疫分析方法中通常所需的B/F分離步驟。激光磁力免疫分析可以定量測定靶免疫物質(zhì)，例如這種靶物質(zhì)可以為抗原、抗體、淋巴細(xì)胞、病毒、腫瘤細(xì)胞和感染細(xì)胞，在分析物溶液中含有結(jié)合的和游離的物質(zhì)。當(dāng)分析物溶液中含有磁力標(biāo)記的結(jié)合型靶物質(zhì)，可以觀察到激光束磁力電導(dǎo)散射瞬時增加，而在僅含有相關(guān)試劑的對照檢測溶液中未見此增加。磁力電導(dǎo)LMIA裝置包括磁力梯度生成儀，它構(gòu)成原位LMIA的主體部分。
進(jìn)行抗原或抗體分析的另一種方法是使用抗原/抗體生物傳感器。生物傳感器具有廉價儀器的優(yōu)勢，可以在實驗室以外的地方使用并由非熟練人員加入樣品；理想狀況下可以快速獲得結(jié)果。免疫傳感器既可通過類似于免疫分析的直接競爭或置換反應(yīng)或者通過直接改變傳感器輸出檢測抗原/抗體濃度(Karube和Suzuki，1986)。對于前一種的系統(tǒng)類型，傳感器傳感范圍涉及光學(xué)機制、電流計機制、和放射化學(xué)機制。與傳統(tǒng)免疫分析類似的是，這些檢測方法通常需要使用標(biāo)記的受體并且在完全分析前需要幾步預(yù)備步驟。另一個傳感器系統(tǒng)是一種質(zhì)量檢測傳感器，它可以通過直接改變傳感器輸出監(jiān)測抗原-抗體反應(yīng)，這種傳感器系統(tǒng)能夠直接通過檢測質(zhì)量的變化監(jiān)測抗原抗體反應(yīng)。分析的原理和程序很簡單并且排除使用任何潛在的危險材料。這種系統(tǒng)類型的實例之一是壓電(Pz)晶體裝置。有了這種系統(tǒng)，既可以在氣相也可以在液相中進(jìn)行分析。
Pz晶體裝置由夾在兩層金屬電極之間的夾心型石英晶體晶片組成。電極使得該裝置與以共振頻率驅(qū)動石英晶體的外部振蕩電路連接。頻率大小決定于晶體質(zhì)量，以及與晶體電極區(qū)相連的任一層電極物質(zhì)。電極表面質(zhì)量的變化由此改變石英晶體微平衡(QCM)裝置的頻率。使用壓電振蕩器作為可能的生物醫(yī)學(xué)傳感器的根據(jù)是頻率變化和晶體表面質(zhì)量負(fù)載的關(guān)系，用下述方程式表示ΔF＝-2F02Δm/A(ρqμq)1/2其中ΔF是測量的頻率變化值，F(xiàn)0是Pz晶體的基頻，A是指包被的面積，Δm是指表面沉積造成的質(zhì)量改變，ρq是石英晶體的密度(2.648g cm-3)而μq是剪切系數(shù)(對AT切割的(AT-cut)石英晶體為2.947×1011g cm s-1s-2)。質(zhì)量敏感度表述為S＝2F02/(ρqμq)1/2對于10MHz壓電晶體，質(zhì)量敏感度S＝0.227Hzng-1cm2，推測4.4ng/cm2的吸附導(dǎo)致約1Hz的頻率變化。
以Pz晶體為基礎(chǔ)的免疫傳感器技術(shù)聯(lián)合使用Pz裝置、蛋白固定、和抗原-抗體反應(yīng)。構(gòu)建Pz免疫傳感器的關(guān)鍵是通過表面修飾而建立敏感的抗原或抗體受體層從而可選擇性吸附樣品中待分析的物質(zhì)。
用于制備生物傳感器的蛋白固定方法包括物理吸附于支持物上(金屬或聚合物)，捕獲于膜上，和共價結(jié)合于支持物上(Williams和Blanch，1994)。所有的方法都具有各自的優(yōu)點，例如，物理方法試驗簡便并被視為溫和的偶聯(lián)方法，能夠保護(hù)蛋白的活性。然而，在特定條件下，這種結(jié)合在某種程度上是可逆的并且表面蛋白結(jié)合作用沒有共價偶聯(lián)作用力強。共價固定法中，化學(xué)鍵發(fā)生于表面和附于其上的物質(zhì)間。盡管通常共價結(jié)合比其他固定方法復(fù)雜，但它提供的是一種最不可逆的表面結(jié)合作用，這對傳感器的敏感性有利。而且，共價結(jié)合蛋白在操作條件下相對穩(wěn)定。通常，蛋白固定的先決條件是保持活性、充分地結(jié)合、及包被蛋白與包被支持物的強烈粘附作用。不同的固定方法傳感器的敏感性不同并適合于不同類型的蛋白固定。
Shons等首先描述了使用抗原作為壓電晶體包被物(1972)，其基于使抗原吸附于一低能量塑料涂層，于1-3二[三氟甲基]苯中的nyerbar C(30％)溶液，提供了能夠與蛋白形成疏水鍵的薄層。用抗原包被后，晶體暴露于未知量的抗體溶液中。抗體和抗原包被晶體間的免疫反應(yīng)導(dǎo)致抗體的免疫結(jié)合。質(zhì)量負(fù)載造成的頻率改變與溶液中特定抗體的濃度成比例。
美國專利4,242,096公開了直接檢測液體樣品中抗原的免疫分析法，這種方法中抗原共價包被于晶體上，該晶體具有諸如聚(2-羥基-3-二甲氨基-1，4-丁烷)的聚合物單層。美國專利4,236,893和4,314,821及其它專利公布了首先使用聚合物引發(fā)表面再吸附抗原的方法。美國專利4,735,906公布了使用表面改良形成硅氧烷聚合物單層的晶體固定蛋白，進(jìn)而通過氨基鍵固定蛋白的方法。Bastiaans(美國專利4,735,906)公布了在液相中使用ST切割的壓電SAW裝置進(jìn)行免疫分析的方法。晶體表面經(jīng)硅烷衍生物，甘氨酰氧丙基三甲氧基硅烷(GOPS)改良。新加坡專利申請9801211-5(S.F.Y.Li)公開了自組裝固定技術(shù)，通過該技術(shù)，傳感器系統(tǒng)敏感性優(yōu)于其他固定方法。
重組技術(shù)在蛋白質(zhì)生物技術(shù)中占有重要地位，通過這項技術(shù)可以獲得大量基因工程產(chǎn)生的重組蛋白。生產(chǎn)重組蛋白的目的可分為四大類(Fanks，1993)1)獲取大量蛋白；2)研究點突變蛋白；3)生產(chǎn)蛋白用于生物技術(shù)；4)體內(nèi)代謝操作。尤其是，例如，酶免疫分析的發(fā)展需要大量結(jié)構(gòu)明確的蛋白作免疫原和酶標(biāo)示蹤劑。近年來，使用重組技術(shù)產(chǎn)生的特定病毒或細(xì)菌抗原作為血清學(xué)測試中的保護(hù)性免疫原已引起越來越多的興趣。本文所要說明的是，重組蛋白或重組抗原是從克隆了蛋白或抗原基因的機體或細(xì)胞或機體或細(xì)胞的子代中制備的，其中重組蛋白可以是融合蛋白。
本發(fā)明綜合了Pz傳導(dǎo)器及重組蛋白為基礎(chǔ)的免疫分析進(jìn)行動物體內(nèi)病毒或細(xì)菌疾病的診斷。這樣配置的Pz晶體傳感器能夠直接感受晶體的質(zhì)量變化而監(jiān)測抗原-抗體反應(yīng)。已證實這對克服傳統(tǒng)免疫分析方法的局限性是有幫助的。這項新技術(shù)的顯著優(yōu)點如下1)本系統(tǒng)成本低并能夠在沒有裝備的實驗室進(jìn)行操作；2)基本設(shè)計和操作相對簡單；3)易于實現(xiàn)實時顯示的結(jié)果及易于迅速進(jìn)行原位測試；及4)極少使用危險材料而使用未標(biāo)記的溫度敏感性低的并可以在20-25℃穩(wěn)定儲存和裝運的試劑，這不同于傳統(tǒng)的免疫分析法。
腸炎沙門氏菌(SE)是家禽工業(yè)的主要難題。近十年來SE是許多國家食物中毒的人體內(nèi)分離出的主要沙門氏菌血清型。這種現(xiàn)象與污染這些血清型的家禽和雞蛋的數(shù)量增多相關(guān)。從臨床和環(huán)境中收集的樣品中分離沙門氏菌的細(xì)菌學(xué)技術(shù)既辛苦，費時，又昂貴。因為沙門氏菌抽提本身的不連續(xù)性和可操作樣品的數(shù)量不可能鑒定整個腸炎沙門氏菌感染的群體。然而，感染諸如腸炎沙門氏菌的侵襲性血清型的小雞會產(chǎn)生針對該感染微生物的永久性免疫球蛋白G的反應(yīng)。這樣感染腸炎沙門氏菌雞群的大量血清學(xué)篩選提供了一種相對更廉價的更可行的方法，其結(jié)果至少與細(xì)菌的方法相同。Thorns等(1996)建立ELISA為基礎(chǔ)的腸炎沙門氏菌血清學(xué)測試。這個方法的根據(jù)是傳統(tǒng)固相免疫分析法，在其中首次描述了腸炎沙門氏菌菌株命名為SEF14的新型菌毛抗原并預(yù)先將其包被于固相支持物上。通過典型的ELISA程序定性檢測小雞血清和蛋黃中的SEF14特定抗體。美國專利4,689,295號公布了一種檢測食物樣品中是否含有腸沙門氏菌的方法。包括至少提供一種能夠選擇性雜交沙門氏菌DNA形成可檢測復(fù)合物的DNA探針，將DNA探針與食物樣品中的細(xì)菌在探針可以與存在于食物樣品中的沙門氏菌DNA雜交的條件下進(jìn)行反應(yīng)形成雜交DNA復(fù)合物，及檢測雜交DNA復(fù)合物指示食物樣品中沙門氏菌的存在。
豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)在全世界對養(yǎng)豬業(yè)而言都是一種重要的影響經(jīng)濟的疾病。PRRS病毒(PRRSV)，屬于動脈炎病毒屬正鏈RNA病毒，導(dǎo)致了這種疾病。當(dāng)前診斷這種疾病的根據(jù)是1)臨床跡象，其是急性爆發(fā)的特征，但在診斷輕微疾病時并不很有效；2)分離病毒，由于費時和不夠可信很少使用；3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測試PRRS抗原；及4)應(yīng)用包括免疫過氧化物酶單層分析(IPMA)、間接酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和間接免疫熒光分析(IIFA)的血清學(xué)分析簡要分析豬群。
美國緬因州IDEXX實驗室公司，擁有一系列用于檢測病毒或是細(xì)菌感染動物疾病的診斷測試抗體。IDEXX的腸炎沙門氏菌抗體測試試劑盒和PRRS抗體測試試劑盒的根據(jù)分別是競爭性和夾心酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術(shù)。這些特定抗體測試試劑盒中，提供有抗原包被的平皿和所有試劑(包括酶聯(lián)抗體，底物，樣品稀釋劑，清洗緩沖液，陽性/陰性對照，等)。測試程序包括樣品孵育、酶聯(lián)抗體孵育底物孵育、及多步清洗等步驟。最終信號通過分光光度計檢測。整個程序(從接觸檢測樣品到包被平皿)需要3-5小時，每個測試花費US$3-5，而且需要良好裝備的實驗室和熟練技術(shù)人員進(jìn)行分析。盡管證實這些分析具有高度準(zhǔn)確度，敏感性及特異性，上文提及的限制性使得在野外條件下進(jìn)行大量原位篩選測試較難。
發(fā)明目的因此本發(fā)明的目的是提供診斷獸類疾病的裝置和方法，其涉及檢測病毒或細(xì)菌抗原的特異性抗體。本發(fā)明的另一個目的是檢測病毒或細(xì)菌特定抗原。
本發(fā)明的再一目的是提供利用重組蛋白作受體物質(zhì)制備Pz晶體傳感器和檢測抗原特定抗體的方法。
本發(fā)明另一個目的是提供簡化和耗時短的檢測腸炎沙門氏菌和PRRSV感染疾病的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供針對獸類疾病的免疫診斷測試方法，涉及檢測存在的病毒或細(xì)菌抗原或其抗體。一方面本發(fā)明裝置包括利用Pz晶體作反應(yīng)載體的免疫傳感器。另一方面，重組病毒或細(xì)菌抗原固定于晶體表面作為敏感受體。Pz晶體裝置可以感應(yīng)晶體表面抗原-抗體反應(yīng)造成的質(zhì)量變化。
腸炎沙門氏菌(SE)或PRRSV檢測方法包括通過共價或物理法將SE或PRRSV蛋白固定于晶體表面制備Pz傳感器?？紤]使用最小量的蛋白可采用浸漬或滴落包被的技術(shù)。用特定試劑封閉包被表面然后將其在適當(dāng)時間內(nèi)(從幾秒到幾小時)暴露于懷疑含有SE或PRRSV抗體的待測樣品中(例如，小雞血清，蛋黃，豬血清)。檢測制備的晶體與樣品孵育前后的頻率。頻率改變或不存在頻率改變說明存在或不存在靶抗體。除蛋白偶聯(lián)程序外，還公開了包括清洗緩沖液、封閉試劑、和檢測樣品稀釋比例等其它技術(shù)細(xì)節(jié)。
附圖簡述

圖1是Pz晶體傳感器系統(tǒng)的示意圖。
圖2是流程圖，顯示了使用特異敏感材料組裝Pz傳感器的過程和樣品的運行過程。
圖3是用于浸漬包被過程的微量容器示意圖。
圖4說明了Pz傳感器檢測靶抗體的原理。
圖5顯示了使用腸炎沙門氏菌抗體的陽性和陰性對照進(jìn)行檢測引起的頻率變化情況。
圖6顯示了檢測35份未知雞血清樣品中腸炎沙門氏菌抗體的頻率變化情況。
圖7顯示了7份已鑒定的陰性蛋黃和12份已鑒定的陽性蛋黃樣品的SE-Pz傳感器檢測結(jié)果。
圖8顯示了制備的Pz傳感器蛋白結(jié)合數(shù)量和敏感性間的關(guān)系。
圖9簡述了41份豬血清的測量結(jié)果。A組是陰性樣品，B組是陽性結(jié)果，C組是未知樣品。
圖10顯示了制備的PRRSV Pz傳感器的多次使用性。
圖11A顯示了再生PRRSV Pz傳感器的敏感性。圖11B顯示了再生SE Pz傳感器的敏感性。這兩個圖中○是陽性對照1，●是陽性對照2。
圖12顯示了硫醇化合物處理過的SE Pz傳感器表面，使用后用重鎘酸(●)和熱Piranha(○)再生的能力。
圖13顯示了重鎘酸溶液對硫醇化合物(●)和γ-APTES(○)處理晶體的再生能力。
發(fā)明詳述參照附圖可以理解Pz晶體裝置作為傳感器系統(tǒng)的詳細(xì)過程。
圖1顯示了常規(guī)的Pz晶體裝置，它有一個金屬電極20，沉積于晶片22的兩側(cè)。這兩個電極與分別產(chǎn)生和檢測共振頻率的振蕩器電路24和頻率計數(shù)器26相連。如Shons等人(1972)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用AT切割的石英晶體的薄磁片，其兩側(cè)有兩個電極。由于石英的壓電特征和晶體取向，運用電極間的電壓使晶體產(chǎn)生剪切變形。這些電極誘導(dǎo)產(chǎn)生垂直于石英晶片表面的振蕩電場。在石英晶片間，振蕩電場機械振蕩產(chǎn)生持續(xù)的波。通過在振蕩電路里包括晶體，產(chǎn)生共振，其中電子的和機械的振蕩與石英的振蕩基頻相近。振蕩電路和頻率計數(shù)器在本領(lǐng)域中是眾所周知的，如美國惠普公司的HP5213A，詳見Breckenstein和Shay(1985)所述?；l依賴于晶片的厚度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、形狀和質(zhì)量，可以用通用計數(shù)器判定晶片的基頻。最常用的晶體是10-16mm圓片形式的5、9或10MHz石英，其厚度為0.15mm。經(jīng)常使用的金屬為金、銀、鋁或鎳。本發(fā)明中，所用的晶體是AT切割的10MHz石英片，晶片的直徑為14mm，厚度為0.2mm。金電極的直徑為5.1mm，厚度為100nm。此晶體的質(zhì)量敏感度約為0.902ng/Hz。
Pz晶體裝置作為免疫傳感器系統(tǒng)，包括構(gòu)建傳感器和檢測樣品。Pz晶體構(gòu)建成傳感器通常包括用特異性生物受體進(jìn)行表面修飾形成界面。此分析基于把特異性相互作用轉(zhuǎn)化成頻率信號。當(dāng)制備的傳感器與樣品接觸，包被的界面與被檢測的分析物相互作用，導(dǎo)致頻率信號改變，直接用于定量或定性分析靶分析物。
圖2顯示了構(gòu)建基于Pz晶體的生物傳感器和測試樣品的詳細(xì)過程。
首先，晶體尤其是金屬電極表面必須用適宜的酸、堿和有機溶劑清洗干凈。針對不同的表面修飾程序，采用合適的清洗方法。例如，為建立基于硫醇化合物的自組裝單層，首先考慮使用熱piranha溶液。熱piranha溶液可以去除任何氧化劑，這樣得到親水性的金表面。另一種清洗方法是用堿和酸交替浸泡晶體，然后它可用于聚合物修飾。堿和酸浸泡后，用蒸餾水和有機物清洗。在干燥條件和大氣壓力下，測量清潔晶體的基頻作為F0。
本發(fā)明使用了幾種常規(guī)的蛋白固定化方法，包括直接物理吸附于稀有金屬電極、共價結(jié)合于硅烷化的晶體、共價結(jié)合于硫醇化合物修飾的表面和物理吸附于疏水聚合物(聚苯乙烯)修飾的晶體。
稀有金表面上蛋白的物理吸附基于強不可逆疏水性硫醇-金相互作用(Horisberger和Vauthey，1984)。經(jīng)實驗驗證此方法簡便并且無需化學(xué)步驟修飾金表面。熱piranha溶液處理過的晶體(F0)直接與含有生物分子的溶液孵育，經(jīng)過適宜的時間，分子吸附到晶體表面。與生物分子孵育后的共振頻率為FB。F0-FB與生物分子結(jié)合的數(shù)量相關(guān)。
通常還使用共價固定。共價結(jié)合過程一般包括用適宜的第一種化合物修飾晶體，由此把目的官能團(tuán)引到晶體表面，在晶體表面和粘附的樣品間形成共價鍵。最常使用的活化官能團(tuán)包括伯胺、硫醇基、羥基以及羧酸。例如，聚氮丙啶(PEI)或γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(γ-APTES)修飾為晶體表面提供氨基基團(tuán)；任何硫醇化合物與末端-COOH基團(tuán)可為晶體提供-COOH修飾的表面。為了活化功能性化學(xué)修飾的表面，有時使用第二種化合物作為交聯(lián)或偶聯(lián)試劑。通常，交聯(lián)或偶聯(lián)試劑可以在活化的生物材料與修飾的表面之間提供額外的化學(xué)鍵，或者進(jìn)一步活化修飾的表面。
在傳統(tǒng)的免疫分析技術(shù)中，最廣泛使用的固相材料是96孔微滴板，其用疏水性聚合物制成，如聚苯乙烯(不能彎曲的“剛性”平板)或聚氯乙烯(PVC，可彎曲平板)。在非極性蛋白亞結(jié)構(gòu)和聚合物之間，抗原或抗體通過疏水性相互作用很容易粘附到塑料表面(Crowther，1995)。在Pz傳感器制造中，蛋白結(jié)合于疏水性聚合物修飾的晶體，就是基于這篇參考文獻(xiàn)的思路。這個固定化構(gòu)思與傳統(tǒng)的免疫分析很相似，并且很容易為具有免疫學(xué)背景的人理解和接受。與共價固定化相比，此方法相當(dāng)簡單，因為在晶體接觸待固定蛋白前，僅需要使用第一種化合物進(jìn)行一步聚合物修飾。
雖然固定生物分子有很多方法，但許多方法有一種或幾種不足之處?？偟膩碇v，方法的選擇依賴于生物分子的特性以及傳感器的期望性質(zhì)。
為了進(jìn)行化學(xué)修飾或蛋白固定，可以采用幾種包被技術(shù)包括浸漬法、滴落法和旋轉(zhuǎn)法。浸漬包被法是利用在合適溶劑中的合適濃度的待包被材料通過物理或化學(xué)作用吸附到晶體上。此法易于操作，只需把晶體浸漬在含有待包被的化學(xué)/生物化學(xué)物質(zhì)的溶液中一段時間，即可包被。此技術(shù)遇到的一個問題是需要大量的溶液，以使晶體全部浸沒其中。滴落包被法是把包被材料幾微升一滴，逐滴滴到晶體表面。浸漬法確保晶體表面與溶液間長時間相互作用，并使表面與溶液充分接觸。然而，滴落法因為溶劑的擴散和蒸發(fā)使相互作用的時間受限，會出現(xiàn)晶體表面和溶液液滴間接觸不均勻的問題。但這種方法適于用聚合物包被，因為聚合物包被的量易于根據(jù)溶液濃度和液滴體積計算。此方法中，聚合物溶解于適宜的溶劑，滴加到高速旋轉(zhuǎn)的晶體上，溶液展開，通過晶體表面形成一層均勻的薄膜，溶劑蒸發(fā)把聚合物膜留在晶體表面。
在整個制備Pz免疫傳感器的過程中，根據(jù)不同的包被材料和不同的反應(yīng)條件單獨或聯(lián)合使用以上提到的包被技術(shù)。
圖3是適于用最小量貴重蛋白浸漬法包被晶體的容器示意圖。它是用環(huán)氧樹脂粘合的顯微鏡載玻片制成，尺寸為54mm×12mm×1mm，適合于同時浸漬三個晶體。使用這種特制容器，每個晶體有200μL包被蛋白足夠。在最佳的蛋白濃度下，抽提的微克級蛋白足夠包被每個晶體。
在使用免疫分析和免疫傳感器時，運行樣品前一定要防止干擾蛋白非特異性吸附到包被的固相或制備的傳感器的傳導(dǎo)器上。檢測樣品時，非特異吸附可導(dǎo)致不希望的干擾蛋白的吸附。常用的阻止非特異吸附的方法包括用封閉試劑孵育包被的晶體，這樣未占用的活性殘基用非活化蛋白封閉。在常規(guī)的免疫分析實驗中，通常使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、明膠、去污劑和脫脂奶粉等(Crowther，1995)。本發(fā)明根據(jù)不同情況的需要采用適合的封閉試劑。封閉的方法采用浸泡包被晶體或滴加該封閉液于包被表面。在敏感蛋白固定后采用此程序，與受試樣品孵育時，可以阻止非特異性免疫反應(yīng)造成的物質(zhì)吸附。
清洗的目的是為了分離結(jié)合的與未結(jié)合(游離)試劑。在傳感器制備階段，使用包被過程的溶劑進(jìn)行清洗，然后再用蒸餾水洗滌。為了監(jiān)測整個包被過程，在干態(tài)下檢測F0、F1和F2的值。兩個連續(xù)步驟間的ΔF值與附著物質(zhì)的絕對數(shù)量相關(guān)，可以通過Saraubery方程計算。晶體間每個固定化過程的頻率改變的一致性使晶體間蛋白結(jié)合數(shù)量一致，進(jìn)而確保樣品檢測的可重復(fù)性。
生物分子固定化和封閉后，為了維持等滲性，使用的清洗液通常是具有緩沖能力的PBS(0.01-0.1M，pH7.4)，因為絕大多數(shù)抗原-抗體反應(yīng)在這種條件下是最優(yōu)的。除了保持傳感器上固定蛋白的活性，另一個關(guān)鍵問題是保持其穩(wěn)定性，因為它會影響傳感器的長期穩(wěn)定性和敏感性。本發(fā)明需要多次洗滌，這是為了保證固定蛋白的穩(wěn)定性(FB′，F(xiàn)B″……)。多次洗滌步驟間頻率改變與否暗示是否出現(xiàn)解吸附。
圖4描述了制備Pz傳感器的原理，該傳感器具有固定的敏感蛋白層以檢測動物體液中特異性抗體。28是Pz晶體；30是包被的敏感蛋白(抗原)；32是特異于包被抗原的靶抗體；34是非活性封閉蛋白；36表示其他抗體；38表示其他血清組分。根據(jù)本發(fā)明此檢測程序包括以下步驟1)獲得在干燥狀態(tài)下包被和封閉晶體的共振頻率FR；2)受試樣品溶液與晶體的反應(yīng)性表面孵育；3)洗去未結(jié)合物質(zhì)并干燥晶體；4)檢測晶體的共振頻率FS。與樣品孵育前后的頻率變化(FR-FS)的存在與否說明了是否存在針對抗原的抗體，并為診斷性檢測給出答案陰性/陽性或是/不是。
抗體與包被抗原間的反應(yīng)依賴于孵育步驟的分布、時間、溫度和pH值。孵育的溫度通常是37℃或室溫。孵育時間從幾分鐘到1小時。本發(fā)明的孵育步驟包括將包被晶體浸漬到樣品中或把樣品滴加到晶體表面并使溶劑揮發(fā)。所需的時間和溫度依賴于每個不同的免疫反應(yīng)系統(tǒng)。本發(fā)明的緩沖條件由PBS緩沖液控制，維持在pH7.2。
用過的晶體可以再生和重復(fù)使用幾次。如果制備的晶體與陰性樣品孵育，僅產(chǎn)生很小的信號改變，可以重復(fù)進(jìn)行其它檢測。另外，用過的晶體使用某些溶劑完全剝?nèi)グ晃?，重建新鮮的金表面，使之再生。憑借新的表面修飾，再生的晶體可以用于包被任何其它的物質(zhì)。在這種意義上講，晶體沒有使用次數(shù)的限制。
已證明，基于Pz晶體的免疫傳感器廉價、簡便，并且能快速檢測。一旦敏感層固定于Pz晶體的表面，所需的分析時間為幾分鐘到1小時。而且，此分析技術(shù)需求很低，方法簡便并且無需復(fù)雜的實驗設(shè)備。
本發(fā)明進(jìn)一步詳述于下面的實施例中，這些實施例用于闡明本發(fā)明，本發(fā)明并不限于此。所用的本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或特殊技術(shù)描述如下。
實施例1制備用于檢測小雞腸炎沙門氏菌疾病的Pz傳感器A)制備重組腸炎沙門氏菌(SE)抗原鑒定了編碼小雞腸炎沙門氏菌血清型的獨特序列。對序列的已知使檢測腸炎沙門氏菌成為可能。利用了鞭毛蛋白部分基因序列克隆(GenBank登錄號Z15068)中核苷酸754-1023，編碼90個氨基酸殘基(SEQ ID NO2)的270bp序列(SEQ ID NO1)。該99個氨基酸多肽與感染腸炎沙門氏菌的小雞血清特異性反應(yīng)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)用腸炎沙門氏菌菌株13076的基因組DNA擴增該序列。將PCR擴增產(chǎn)物插入細(xì)菌表達(dá)載體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因下游，這樣當(dāng)基因表達(dá)時產(chǎn)生重組融合蛋白(連接99個氨基酸多肽的GST)。轉(zhuǎn)化此載體到細(xì)菌宿主大腸桿菌JM105感受態(tài)細(xì)胞中。接種含適當(dāng)重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞單克隆于有70ug/mL氨芐青霉素(加入氨芐青霉素是為了篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞)的1mLLuria-Bertani中。4小時后，1∶10稀釋培養(yǎng)物并在37℃ 250rpm振蕩培養(yǎng)10小時。在適當(dāng)大小的搖瓶中再以1∶10稀釋培養(yǎng)物并在上述條件下繼續(xù)生長。當(dāng)培養(yǎng)物O.D.600達(dá)到0.6時，加入終濃度為2.5mM的IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)并繼續(xù)培養(yǎng)4小時。收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀并用裂解緩沖液重懸細(xì)胞沉淀(50mM Tris pH8，0.3mM NaCl，0.5mM EDTA，0.5％Tween 20)。超聲處理細(xì)菌細(xì)胞，10000xg離心20分鐘。繼而蛋白從沉淀進(jìn)入上清中并完全溶解于含1M，6M，和8M尿素的裂解緩沖液中。蛋白的每一步純化均用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和考馬斯亮藍(lán)染色分析。大部分重組蛋白存在于上清和1M尿素提取液中。接著使用從法瑪西亞生物技術(shù)獲得的試劑盒經(jīng)GST親和層析柱純化這些組分中的重組蛋白。再用SDS-PAGE分析顯示蛋白純度達(dá)98-99％。根據(jù)序列估算蛋白分子量為9000且SDS凝膠電泳確定為35000。使用蛋黃(從雞蛋中獲取)和陰性對照及天然和實驗感染的小雞血清陽性對照進(jìn)行Western印跡鑒定純化的重組蛋白。B)制備SE-Pz傳感器本發(fā)明中采用三種傳統(tǒng)蛋白固定程序在晶體表面包被一層重組腸炎沙門氏菌蛋白以制備Pz傳感器。已證實這些方法可以確保不損失蛋白活性又有同樣量的蛋白結(jié)合。C)通過自組裝單層技術(shù)進(jìn)行固定用熱Piranha溶液(30％H2O2∶H2SO4(1∶3))清洗帶有金電極的制備好的10MHz AT切割的晶體(購自ICM公司，Oklahom美國)。Piranha溶液涂于金表面保持5分鐘，然后用蒸餾水徹底清洗電極表面。接著用95％乙醇清洗后再用蒸餾水清洗。這個步驟重復(fù)兩次。最后用氮氣流吹干電極表面并記錄共振頻率(F0)。
本試驗中，為了共價結(jié)合所說的SE抗原，首先用4-氨基苯硫酚(ATPh)修飾金電極表面，該分子在一側(cè)提供硫醇基團(tuán)而在另一側(cè)提供氨基。同時硫醇基團(tuán)自發(fā)吸附在金表面確保了氨基朝向界面并發(fā)揮功能基團(tuán)的作用，從而可以通過交聯(lián)試劑與蛋白的其它氨基作用而固定蛋白。立即將新清洗的晶體浸漬于20mM ATPh(第一種化合物)于二甲基亞砜(DMSO)中過夜以達(dá)到所說的這種固定。用蒸餾水洗后在空氣中干燥，在2.5％戊二醛(GA)(第二種化合物)于PBS中浸漬修飾的晶體1小時進(jìn)一步活化已獲得的氨基。在用PBS緩沖液和蒸餾水清洗后，進(jìn)行蛋白孵育。
在包被晶體上滴一小滴蛋白是最常采用的制備敏感層的技術(shù)，尤其是在抗體包被中。在本試驗中，首先研究了這項技術(shù)。這包括在活化晶體每一面各加5uL濃縮SE蛋白溶液(500ug/mL)并在37℃孵育直到溶液完全蒸干。然而，不幸的是，此方法不能保證所有的包被晶體都能固定目的量的蛋白(根據(jù)某種頻率的變化)。原因可能在于此方法提供的孵育時間有限及純化重組蛋白使用的溶液有0.1％的SDS。為了克服這些問題，發(fā)展了另一項浸漬包被技術(shù)，即將修飾晶體浸漬于稀釋的SE PBS溶液中(25ug/mL)并在37℃孵育希望的時間(1-2小時)。本技術(shù)的基礎(chǔ)是設(shè)計并使用了一種大小是54mm×12mm×1mm，容量是648微升的自制微量容器。這項獨特的設(shè)計可以同時浸漬三塊晶體，而且典型地，每一塊晶體只需5ug重組蛋白。
這一方法更適于重組蛋白的包被，因為不僅可以確保充足的孵育時間并且縮小了所需蛋白的量。而且更長的孵育時間可以使用更低濃度的包被蛋白。在本實施例中，使用的SE最大濃度是25ug/mL，結(jié)合的量與表面的飽和度相關(guān)，即，頻率不再變化。而且，稀釋的蛋白可以使陰離子去垢劑SDS含量達(dá)到最低并減弱了它對蛋白固定的妨礙作用。除此之外，由于浸漬法確保了晶體和蛋白溶液之間充分而一致的接觸，對改變與不同包被晶體結(jié)合的蛋白量的不一致性是有利的。滴落和浸漬-包被技術(shù)SE結(jié)合量的比較示于表1.1。
表1.1對應(yīng)頻率變化的SE結(jié)合量*方法 滴落 浸漬ΔF(Hz) 165.3±33.2 256±23.3結(jié)合能力(nmol/面)0.0021 0.0032*至少8塊晶體的平均值D)用硅烷化法進(jìn)行固定另一種包被程序是基于硅烷化法。用1.2N NaOH清洗晶體20分鐘后用1.2N HCl清洗5分鐘。再用蒸餾水清洗晶體并在空氣中干燥。接著在晶體表面加幾微升濃鹽酸放置1-2分鐘。最后，用蒸餾水和乙醇清洗晶體。
首先在含5％氨基丙基三乙氧基硅烷(γ-ATPES)的丙酮中浸漬洗凈的晶體1小時。用丙酮和蒸餾水洗后(F1)，后續(xù)程序與APTh法相同，包括進(jìn)一步用GA活化(F2)及最后與25ug/mL重組SE蛋白浸漬孵育(FB)。接著的多步清洗可以確保包被的穩(wěn)定性(FB′，F(xiàn)B″)。E)通過聚苯乙烯法固定如上所述，用酸堿交替法清洗晶體。室溫下將清洗的晶體浸漬在溶有聚苯乙烯珠的甲苯中30分鐘，通過物理吸附形成聚合物膜。用乙醇和蒸餾水清洗晶體后(F1)在適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)將帶有聚合物膜的晶體浸漬于重組SE蛋白包被緩沖液中(FB)。
聚苯乙烯膜的厚度決定于聚合物溶液的濃度。本例中采用3mg/mL，此聚合物包被量相應(yīng)的頻率變化是1196±325Hz。盡管9mg/mL聚合物提供更厚的聚合物包被，相應(yīng)的頻率變化是4919±325Hz，但包被蛋白的量不再增加。這說明3mg/mL聚合物提供了飽和的聚合物包被并且包被物覆蓋了整個晶體。
根據(jù)疏水作用將蛋白吸附于塑料上。相互作用的幾率決定于蛋白濃度，包被pH，溫度，和孵育時間。在優(yōu)化包被過程中晶體于37℃在SE溶液(25ug/mL于50mM碳酸鹽包被緩沖液pH9.6中)中浸漬1小時。實驗表明SE濃度達(dá)25ug/mL時結(jié)合量達(dá)到飽和，相應(yīng)頻率變化是240±19.9(表1.2)。
表1.2不同濃度下結(jié)合SE蛋白造成的頻率變化濃度(ug/mL) 30.0 25.0 12.5 10.0 6.0ΔF(Hz) 232 240 171 140 55在整個包被程序中，為了檢測反應(yīng)過程記錄了F0-FB。提供的三種固定方法可以確保幾乎等量的SE結(jié)合(表1.3)而無活性損失。這些包被方法是穩(wěn)定的，因為在清洗過程中沒有頻率變化。在優(yōu)化包被條件下，5ug所述的蛋白足以制備一塊Pz晶體。
表1.3不同方法中SE的結(jié)合程序方法ATPh γ-APTES 聚苯乙烯步驟 ΔF(Hz)第一化合物 1063±12.8545±58.6 1196±125第二化合物 171±19.1 273±221 NILSE蛋白 256±18.3 232±22.3 240±23.2本發(fā)明中，因聚苯乙烯包被法相對簡單并縮短了固定時間而首先推薦。應(yīng)用所說的固定程序制備大量含SE包被層的Pz晶體進(jìn)行小雞血清樣品或蛋黃中SE特定抗體的測試。
為避免非特異吸附，將SE蛋白包被晶體與BSA 37℃孵育半小時，可以選擇滴落法將5uL 5％BSA滴加到晶體的每一面或?qū)⒕w浸漬于1％BSA溶液中。清洗并烘干處理好的晶體保存于4℃或冷藏。
聚苯乙烯法是經(jīng)選擇檢測SE的最佳方法，在本實施例的下述段落(F)和(G)中所用的Pz晶體使用聚苯乙烯包被法制備。SE蛋白通過物理吸附固定于聚苯乙烯修飾的晶體表面。聚苯乙烯修飾的電極表面結(jié)合干擾蛋白的活性降低從而非特異性結(jié)合大大減少。SE與聚苯乙烯膜結(jié)合的原因是長時間(過夜)孵育產(chǎn)生的靜電作用。與血清樣品短時間孵育(5-10分鐘)即可使特定抗體結(jié)合于包被抗原上。F)檢測小雞血清中的SE抗體從冷柜中取出制備的晶體并使其恢復(fù)室溫。測量共振頻率FR。用于檢測的樣品是小雞血清。稀釋的血清樣品降低了干擾蛋白的背景，但是也由于抗體濃度降低導(dǎo)致敏感度減弱。在本實施例中，發(fā)現(xiàn)血清樣品用PBS緩沖液稀釋五十倍(1∶50)是敏感度的需要和另一方面干擾性結(jié)合達(dá)到平衡的最佳選擇。在此優(yōu)選的稀釋度下，10uL稀釋血清樣品涂于晶體的每一個表面并在室溫下包被電極約20分鐘。清洗并干燥上述晶體，共振頻率值定為FS。FR-FS對應(yīng)于待測血清樣品中的質(zhì)量吸附。
共涉及47只小雞的血清。選用六個陰性和六個陽性血清對照鑒定制備的傳感器的性能。結(jié)果見圖5。陽性和陰性樣品造成的頻率改變有明顯的差異并提供了是或非的診斷結(jié)果。截斷值定為六個陰性對照的平均信號加三倍的標(biāo)準(zhǔn)差，由此截斷值為176.7Hz。
用SE-Pz傳感器(圖6)分析另外35個未知血清并與傳統(tǒng)免疫分析結(jié)果進(jìn)行比較。對SE-Pz傳感器而言，存在或不存在SE抗體是由與血清樣品孵育前后的晶體信號變化確定的。如果ΔF(FR-FS)低于截斷值，即本例中的176.6Hz，確定樣品是SE抗體陰性，而如果ΔF大于或等于截斷值，確定樣品是SE抗體陽性。陽性對照血清(血清0)產(chǎn)生強陽性信號。35個樣品中的六個強于或與陽性對照一樣強。另11個樣品顯示是陽性，有18個是陰性。除血清33外，這些結(jié)果與Western印跡分析和商品化可購買的IDEXX SE抗體測試試劑盒一致。表1.4是2×2偶然性表，通過此表列出了SE-Pz傳感器與兩種傳統(tǒng)免疫分析的比較結(jié)果。Pz傳感器和傳統(tǒng)免疫分析結(jié)果的一致性是96％，而相對敏感性和特異性分別是100％和95％。
表1.4SE-Pz傳感器和傳統(tǒng)免疫分析的總結(jié)與比較Western印跡/IDEXX ELISA證實陽性 陰性 總數(shù)SE-Pz感器陽性 16 1 17SE-Pz傳感器陰性 0 18 18總數(shù) 16 19SE-Pz傳感器陽性 a b a+bSE-Pz傳感器陰性 c d c+d總數(shù) a+cb+d敏感性＝a/(a+c)；特異性＝d/(b+d)；一致性＝(a+d)/(a+b+c+d)G)檢測蛋黃中的SE抗體本實施例中，檢測樣品的類型是蛋黃。檢測的稀釋度從1∶1到1∶10。發(fā)現(xiàn)用PBS緩沖液以1∶5稀釋是同時符合所需敏感性和降低干擾性結(jié)合的優(yōu)選稀釋度。將優(yōu)選稀釋度稀釋的蛋黃樣品10uL加至晶體的兩個側(cè)面上并覆蓋整個電極表面于37℃孵育約30分鐘。清洗并干燥上述晶體，確定共振頻率是FS。FR-FS對應(yīng)于檢測樣品中的質(zhì)量吸收。用SE-Pz傳感器檢測共19個已知的實驗感染的蛋黃或未感染的小雞。結(jié)果示于圖7。截斷值定義為陰性樣品平均值加三倍標(biāo)準(zhǔn)差。
實施例2制備Pz傳感器檢測豬的生殖和呼吸綜合癥病毒疾病A)制備重組豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)抗原已鑒定編碼豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)的獨特序列。PRRSV在其基因組中具有八個開放閱讀框架(ORFs)1a，1b，2，3，4，5，6，和7。使用PRRSV毒株P(guān)CR擴增病毒ORFs5和7并克隆于細(xì)菌宿主大腸桿菌JM105感受態(tài)細(xì)胞中。ORF5 DNA序列示于SEQ IDNO3而ORF5蛋白序列為SEQ ID NO4。接下來的重組表達(dá)過程和純化過程幾乎與實施例1所述的SE抗原相同。通過從制備的SDS-PAGE膠切割目的條帶純化8M尿素組分。純化的重組表達(dá)蛋白純度是98-99％并以天然或?qū)嶒灨腥镜呢i血清為陽性和陰性對照經(jīng)Western印跡鑒定。從序列推算的分子量大小是9000而SDS膠電泳確定是41000kD。B)用PRRSV ORF5抗原層制備Pz傳感器(PRRS-ORF 5-Pz傳感器)本實施例中，重組PRRSV-ORF-5蛋白用作敏感抗原。用PRRSV-ORF-5蛋白層制備Pz傳感器，采用實施例1中描述的固定方法。盡管每一個方法相應(yīng)于特定頻率改變確保了足量的蛋白結(jié)合，進(jìn)一步的實驗顯示共價結(jié)合不適于區(qū)分陽性和陰性血清樣品。產(chǎn)生了兩個問題，陰性對照產(chǎn)生的相對強的背景和與陽性對照孵育時微弱的頻率改變。前一個問題可能說明包被表面仍然存在干擾蛋白，即血清中的組分吸附上去，造成的非特異性吸附殘余物。后一個問題可能由于PRRSV蛋白失活及檢測的抗體與包被的PRRSV蛋白免疫反應(yīng)受阻。為了克服這兩個問題及獲得有明顯差別的陽性和陰性信號，做了如下嘗試。首先，在血清樣品與包被晶體接觸前用適當(dāng)?shù)姆忾]劑，諸如PBS，奶粉，明膠和酪蛋白緩沖液，與PRRSV包被晶體孵育。第二，為了增強陽性對照血清頻率改變的信號，優(yōu)化血清孵育條件，包括時間、溫度、和血清稀釋度。所有嘗試均無益于改善傳感器的狀況。
幸運的是，通過PRRSV蛋白直接非共價結(jié)合于晶體表面制備具有PRRSV層的Pz傳感器是非常適當(dāng)?shù)摹?br> 由于蛋白分子和金表面之間的疏水作用和硫醇-金相互作用，蛋白在金電極上有強烈的不可逆的吸附作用。將徹底清洗的晶體(F0)浸漬于PRRSV溶液中室溫過夜以將PRRSV蛋白固定于晶體表面。為了避免溶液蒸發(fā)，將浸漬晶體的自制微量容器放于濕度很高的箱子中。用蒸餾水洗后空氣中干燥包被晶體(FB)。將晶體與酪蛋白緩沖液(含0.5％酪蛋白，0.2％Tween 20的PBS緩沖液)室溫共同孵育1小時。接著清洗并干燥晶體(FR)。F0-FB對應(yīng)于蛋白結(jié)合的量，而FB-FR對應(yīng)于封閉蛋白的吸附。
包被于金表面的蛋白比率和含量決定于1)包被分子的擴散系數(shù)；2)包被表面積與包被溶液體積的比例；3)吸附底物的濃度；4)溫度；和5)吸附時間的長短。所有這些因素均是相互聯(lián)系的而最重要的是確定每一個包被體系的優(yōu)選抗原濃度。為了確保制備的傳感器的高敏感性，在一方面包被蛋白需要飽和晶體表面可吸附的任何位點，另一方面由于實際的結(jié)合密度會影響結(jié)果，必須仔細(xì)確定不同濃度結(jié)合蛋白的效果?？乖母呙芏冉Y(jié)合可能會因為空間抑制(抗原分子被過分?jǐn)D壓)而無法結(jié)合抗體。
本實施例中PRRSV蛋白的使用濃度是5-50ug/mL。此范圍內(nèi)蛋白結(jié)合量相應(yīng)的頻率變化是140-800Hz。包被晶體封閉后(FR)，用PRRSV確實陽性的豬血清與其孵育(FS)，并監(jiān)測不同PRRSV蛋白結(jié)合能力的傳感器的敏感性(圖8)。觀察到PRRSV結(jié)合量196.4-312.5ng/兩面，相應(yīng)頻率變化220-350Hz，是最敏感的，陽性對照的ΔF(FR-FS)是250-320Hz。
使用25ug/mL的PRRSV溶液為優(yōu)選濃度以獲得220-350Hz的PRRSV結(jié)合。這種情況下，大量晶體得到包被。結(jié)合于十塊晶體上的蛋白的量示于表2.1。每一塊制備的晶體PRRSV蛋白的高度一致的結(jié)合量是傳感器與傳感器間高度可重復(fù)性的基礎(chǔ)。此物理吸附法用于本實施例下文C-F部分的試驗。
表2.1ORF 5 PRRSV蛋白結(jié)合量編號PRRSV結(jié)合導(dǎo)致的 結(jié)合能力 結(jié)合能力ΔF(Hz) (ng/面) (nmol/面)1 250 112.80.00282 330 148.80.00363 285 128.50.00314 325 146.60.00365 260 117.30.00296 310 139.80.00347 360 162.40.00408 265 119.50.00299 280 126.30.003110 300 135.30.0033平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 296.5±35.0 133.7±15.8 0.0033+0.00038C)樣品測試程序包被并封閉了的晶體保存于4℃。從冷層柜中取出包被封閉的晶體使其恢復(fù)室溫。測試共振頻率FR。用于檢測的樣品是豬血清樣品。在本實施例中，用PBS緩沖液五倍稀釋(1∶5)血清樣品是達(dá)到所需敏感度和降低干擾性結(jié)合的最佳稀釋度。在晶體每一面加10uL優(yōu)選稀釋度稀釋的樣品并在室溫覆蓋整個電極10分鐘(發(fā)現(xiàn)與樣品孵育10分鐘是優(yōu)選的)。清洗和干燥上述晶體后，確定共振頻率值FS。FR-FS對應(yīng)于檢測血清樣品中質(zhì)量的吸附。
本實施例中共涉及41份豬血清。圖9是顯示測試結(jié)果的柱形圖。其中的12份血清(A組)和14份豬血清(B組)分別是陰性和陽性對照，用于確定傳感器的性能。12份確實為PRRSV-陰性參考血清(A組)有正常的FR-FS值分布，范圍是1到60，平均值是30.0±20.9Hz(表2.2)。截斷值定為12個陰性對照平均頻率變化加三倍標(biāo)準(zhǔn)差。另15份未知的豬血清用于與傳統(tǒng)Western印跡和商業(yè)提供的ELISA結(jié)果比較傳感器的敏感性和特異性。通過與血清樣品孵育前后晶體頻率的變化(FR-FS)確定是否存在PRRSV的抗體。如果ΔF小于截斷值，樣品鑒定為PRRSV抗體陰性，而如果ΔF大于或等于截斷值，樣品鑒定為PRRSV抗體陽性。15份樣品中的8份是陽性，其余的是陰性。這些結(jié)果與IDEXX PRRS抗體測試試劑盒或Western印跡分析吻合得很好。
表2.2確實陰性豬血清樣品的ORF 5 PRRS Pz傳感器頻率變化值分布編號 ΔF(Hz)1 602 53 524 325 106 407 78 29 3610 5011 912 55平均值±SD 30.0±20.1截斷值(平均值+3 SD) 90.2D)IDEXX ELISA交叉比較交叉比較ORF 5 PRRSV Pz傳感器測試的的幾份豬血清測試結(jié)果與購買的IDEXX PRRS ELISA測試試劑盒的測試結(jié)果(表2.3)。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行IDEXX PRRS ELISA操作，通過計算每個樣品的S/P比率確定是否存在PRRSV抗體。如果S/P比率低于0.4，鑒定樣品是PRRSV抗體陰性，而如果S/P比率大于或等于0.4，樣品鑒定為PRRSV抗體陽性。
表2.3PRRS-ORF 5-Pz傳感器與IDEXX ELISA的交叉比較PRRSV Pz傳感IDEXX PRRS ELISAΔF(Hz) 標(biāo)準(zhǔn)化信號*S/P比率 標(biāo)準(zhǔn)化信號*截斷值 90.2 0.401(-)0 0 0.10 0.252(-)10 0.11 0.17 0.41豬3(-)35 0.39 0.24 0.60血清 4弱(+) 1551.72 0.73 1.83樣品 5弱(+) 1401.55 0.63 1.586(+)3103.44 2.0 5.007(+)2502.78 2.1 5.25每一個樣品的標(biāo)準(zhǔn)化信號由樣品頻率變化ΔF樣品或(S/P)樣品與截斷值頻率的比率確定。表2.3中每一個測定標(biāo)準(zhǔn)化值大于1的血清可以鑒定為陽性樣品。血清樣品1-3用Pz傳感器鑒定標(biāo)準(zhǔn)化信號0-0.39是陰性，而IDEXX ELISA標(biāo)準(zhǔn)化信號是0.25-0.60。血清樣品6和7用Pz傳感器鑒定標(biāo)準(zhǔn)化信號2.8-3.4是強陽性，而IDEXX ELISA給出的標(biāo)準(zhǔn)化信號是5.00-5.25。血清樣品Nos.4和5鑒定是弱陽性。PRRSV Pz傳感器和購買的IDEXXELISA標(biāo)準(zhǔn)化信號僅略高于1。E)ORF 5 PRRSV Pz傳感器的可重復(fù)性用不同的制備的傳感器分別檢測幾份血清樣品，監(jiān)測不同傳感器頻率變化的可重復(fù)性(表2.4)。標(biāo)準(zhǔn)差是5.0-15.0％，與IDEXX結(jié)果具可比性，可以接受。
表2.4用不同的Pz傳感器平行檢測血清樣品樣品ΔF(Hz) 1(-)2(-) 3(弱+) 4(+) 5(+) 6(+)次數(shù)1 90 10 140 310 225 2952 55 20 115 250 195 3103 60 5 -- 320 250 --4 -- -- -- 240 ----平均±SD 67.8±9.9 15.3±2.3 127.5±17.7 275.5±23.3 223.2±27.5 302.5±17.5RSD(％) 14.6 15.0 13.8 8.5 12.3 5.3F)傳感器的重復(fù)使用重復(fù)使用本文是指在先用制備的晶體檢測陰性血清的情況下，又用于進(jìn)行其他分析。用四塊制備的晶體(1-4)以不同的順序檢測兩個陰性血清，和兩個陽性血清。結(jié)果示于圖10。晶體1先與陰性對照1孵育，得到的信號ΔF為36Hz，晶體1再與陰性對照2孵育產(chǎn)生50Hz的頻率改變。進(jìn)一步，將此使用兩次的晶體與陽性對照孵育產(chǎn)生的信號為225Hz。晶體2用作對照，直接檢測同一個陽性對照，產(chǎn)生250Hz的信號。用另兩塊晶體進(jìn)行類似的試驗。陽性對照2用用過一次的和新的晶體進(jìn)行檢測。兩次測試產(chǎn)生的頻率非常接近，而SD在建議的SD范圍內(nèi)，是15％。這說明制備的晶體可以至少使用3次而敏感性無明顯減弱。
實施例3用過晶體的再生進(jìn)行過陽性測試的制備的晶體可以通過調(diào)整pH進(jìn)行再生。在pH11.0的硼酸/KCl-NaOH緩沖液(50mL硼砂+22.7mL0.1M NaOH)中浸漬使用過的晶體30分鐘可以從免疫復(fù)合物中去除抗體。用蒸餾水和PBS清洗后晶體可以用于其它分析。圖11A-B顯示再生PRRSV-Pz傳感器(圖11A)和SE-Pz傳感器(圖11B)的敏感性。進(jìn)行約3-4次分析才可能出現(xiàn)不可逆的活性損失。
發(fā)現(xiàn)重鉻酸(10g重鉻酸鈉溶解于30mL熱H2O中，冷卻，加入70mL濃H2SO4)清洗液是除去制備的傳感器表面所有包被物的最佳途徑。幾乎適合于任何條件的包被表面。例如，硫醇化合物修飾表面在金和硫原子間有強鍵。進(jìn)行處理時滴加10uL重鉻酸溶液于該表面上保持15分鐘以上，接著用蒸餾水清洗可以使頻率恢復(fù)原始基線F0，而且可以在新形成的金表面進(jìn)行任何新的表面修飾。圖12顯示了用重鉻酸溶液和熱Piranha進(jìn)行硫醇化合物表面處理得到的再生能力的比較結(jié)果。證實重組PRRSV蛋白直接固定于金表面是很穩(wěn)定的。PRRSV吸附的金表面再生需用重鉻酸孵育15分鐘。
金表面與γ-APTES通過三個金氧鍵相互作用。γ-APTES處理的晶體再生需要長時間的清洗。圖13顯示重鉻酸清洗溶液再生經(jīng)APTh和γ-APTES處理的晶體的能力。
盡管本申請中參照本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明公開了本發(fā)明，應(yīng)理解的是本說明書意在舉例示出本發(fā)明而非限制本發(fā)明，這是引物本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員易于在本發(fā)明的實質(zhì)和所附范圍內(nèi)作出某些修改。
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權(quán)利要求
1.一種檢測生物體中感染因子的存在的免疫診斷測試方法，包括a)在壓電(Pz)晶體上固定i)來自該感染因子的抗原或ii)特異于來自該感染因子的抗原的抗體；b)測定步驟(a)之后所述晶體的共振頻率；c)將所述晶體與來自所述待測生物體的生物標(biāo)本接觸；d)測定步驟(c)之后所述晶體的共振頻率；e)將步驟(b)測定的共振頻率與步驟(d)測定的共振頻率比較，如果兩個頻率的差值相等或高于截斷值，則說明該生物樣品呈陽性，即存在所述感染因子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗原是一種重組抗原。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的感染因子是一種細(xì)菌或病毒。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)之后，所述晶體用封閉試劑封閉。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的Pz晶體包括0.1-1000MHz AT切割的結(jié)晶石英晶體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的Pz晶體還包括銀或金電極。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述的Pz晶體還包括一個振蕩電路，它能夠以自身固有的共振頻率電刺激該Pz晶體振蕩。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的共振頻率使用通用計數(shù)器測量。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗原是跨膜包膜蛋白。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的跨膜包膜蛋白是利用重組技術(shù)制備的融合蛋白，它包含谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的固定化是選自以下一組的方法1)物理吸附于金屬或聚苯乙烯修飾的晶體表面；2)共價結(jié)合于聚合物、硅烷或硫醇化合物處理過的晶體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的固定化通過將Pz晶體浸漬于抗原溶液中而進(jìn)行。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物標(biāo)本在接觸前被稀釋。
14.權(quán)利要求4的方法，還包括步驟(a)、封閉步驟、步驟(c)后的清洗，其中所述的清洗是用含有去污劑的生理緩沖液進(jìn)行。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述生理緩沖液是磷酸鹽緩沖液。
16.權(quán)利要求4的方法，其中所述的封閉試劑是非活性蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述封閉試劑是牛血清白蛋白或酪蛋白緩沖液。
18.權(quán)利要求4的方法，其中所述封閉試劑采用浸漬技術(shù)或滴落技術(shù)而施加。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述的與生物標(biāo)本接觸是在液相或蒸氣相中進(jìn)行。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述的截斷值定義為陰性對照的平均值加三倍的標(biāo)準(zhǔn)差。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述的Pz晶體先前用于所述感染因子是陰性的測試中。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗原包括SEQ ID NO2的肽。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗原包括PRRSV的ORF5。
24.再生帶有i)結(jié)合的抗原或ii)結(jié)合的抗體的用過的Pz晶體的方法，包括用含有硼酸/KCl-NaOH的緩沖液清洗，去除與所述抗原或抗體結(jié)合的任何蛋白，同時不除去所述抗原或抗體，從而使帶有結(jié)合抗原或抗體的所述Pz晶體可以重復(fù)使用。
25.再生用過的Pz晶體的方法，包括用重鉻酸清洗，由此去除任何結(jié)合的蛋白和任何結(jié)合的抗原，以產(chǎn)生清潔的晶體，從而可與新抗原結(jié)合。
26.用抗原或抗體包被Pz晶體的方法，包括在抗原或抗體溶液中浸漬此晶體。
27.一種診斷試劑盒，包括用重組抗原或抗體包被的Pz晶體。
28.權(quán)利要求27的診斷試劑盒，其中所述的重組抗原包括SEQ IDNO2的蛋白質(zhì)。
29.權(quán)利要求27的診斷試劑盒，其中所述的重組抗原包括PRRSV的ORF5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定性檢測動物體液中病毒或細(xì)菌抗體的方法,和一種進(jìn)行該方法的裝置。一方面本發(fā)明裝置包括壓電晶體,它由振蕩電路操縱,用通用計數(shù)器檢測共振頻率。另一方面,重組病毒或細(xì)菌蛋白固定于上述壓電(Pz)晶體表面并用作抗原。在一個實施方案中,制成的Pz傳感器可以監(jiān)測頻率變化的信號檢測是否存在病毒或細(xì)菌特異性抗體。在另一個實施方案中,本發(fā)明方法被證實是低成本的,簡便的和快速的。
文檔編號G01N33/569GK1371477SQ9981679
公開日2002年9月25日 申請日期1999年10月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月5日
發(fā)明者薩姆·房有·李, 蘇小笛, 吉米·況, 沙倫·劉, 劉偉 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院, 材料研究與工程學(xué)院