一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞分類領(lǐng)域，尤其涉及一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞分類主要是以下幾種方法：
[0003] 1、離心法：離心法分類是利用不同尺寸和密度的細(xì)胞在離心場(chǎng)中沉降行為的不 同，從組織勻漿或血液中將不同細(xì)胞分類的技術(shù)。用離心技術(shù)分離細(xì)胞主要依賴的方法是 差分離心、速率一區(qū)帶密度梯度離心、等密度離心和利用特殊轉(zhuǎn)頭的細(xì)胞浮選離心。
[0004] 2、膜濾法：用半透膜作為選擇障礙層，利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側(cè) 存在的能量差作為推動(dòng)力，允許某些特定類型的細(xì)胞透過而保留其他類型細(xì)胞，從而達(dá)到 分離目的細(xì)胞分類技術(shù)。
[0005] 3、熒光激活細(xì)胞分類術(shù)：即以熒光素標(biāo)記抗體結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞，用激光束激發(fā)單行 流動(dòng)的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞所攜帶的熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析或分選。其原理是：被熒光染色的 細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種 信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大??；熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色 性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。
[0006] 但上述方法均存在不足之處：
[0007] 離心法：成本太高，耗時(shí)太久，需要制備介質(zhì)溶液，操作嚴(yán)格，不易控制。
[0008] 膜濾法：薄膜的制備過于復(fù)雜，不同薄膜對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求不同，薄膜的使用壽 命有限。
[0009] 熒光激活細(xì)胞分類術(shù)：成本太高，另外存在細(xì)胞內(nèi)低豐度分子難以檢測(cè)，缺少"通 用"細(xì)胞通透物質(zhì)，細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾效應(yīng)，熒光分子間發(fā)射光譜的重疊，以及缺少可識(shí) 別目標(biāo)分子的試劑。特別是對(duì)于細(xì)胞分揀來說，由于液滴的形成收集、分揀細(xì)胞重分析或培 養(yǎng)前的稀釋，以及為獲得足夠數(shù)量的可用細(xì)胞需要的時(shí)間延誤的原因，還存在細(xì)胞存活問 題。最后，特別是在處理低豐度對(duì)象時(shí)，數(shù)據(jù)分析難以處理。
[0010] 因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的 細(xì)胞分類方法，旨在解決現(xiàn)有細(xì)胞分類方法成本高、操作復(fù)雜、效率低、準(zhǔn)確率低等問題。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0013] -種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，包括步驟：
[0014] A、制作光誘導(dǎo)介電泳芯片，所述光誘導(dǎo)介電泳芯片有三層結(jié)構(gòu)組成：下層為涂有 氫化非晶硅涂層的ITO玻璃，上層是不含涂層的ITO玻璃，在上下兩層ITO玻璃之間封裝有 一個(gè)微流體通道，用于注射所需操作的溶液；
[0015] B、向上下兩層ITO玻璃的電極輸入可變頻率的交流信號(hào)，同時(shí)利用入射光照射所 述光誘導(dǎo)介電泳芯片，從而在被照射的區(qū)域產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)；
[0016] C、改變交流信號(hào)的頻率及大小，以控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向，同時(shí)采集細(xì)胞的圖像；
[0017] D、根據(jù)采集的圖像對(duì)待分類細(xì)胞的位移和時(shí)間進(jìn)行擬合，然后根據(jù)擬合結(jié)果使用 已訓(xùn)練的支持向量機(jī)來進(jìn)行分類，得到細(xì)胞類型。
[0018] 所述的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，所述步驟A中，制作光誘導(dǎo) 介電泳芯片的步驟具體包括：
[0019] AU清理ITO玻璃基質(zhì)；
[0020] A2、在ITO玻璃基質(zhì)上沉積氫化非晶硅涂層；
[0021] A3、在氫化非晶硅涂層上涂光刻膠；
[0022] A4、在光刻膠上進(jìn)行板印；
[0023] A5、接觸腐蝕至ITO玻璃基質(zhì)；
[0024] A6、去除光刻膠；
[0025] A7、在ITO玻璃基質(zhì)上未覆蓋氫化非晶硅涂層的區(qū)域涂導(dǎo)電粘合劑。
[0026] 所述的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，所述細(xì)胞在非均勻電場(chǎng)中 的所受到的平均介電泳力用如下公式描述：
[0028] 其中Fdep是作用到細(xì)胞上的平均介電泳力，R是細(xì)胞的半徑，ε $細(xì)胞所在溶液 的介電常數(shù)，Ems為所施加交流信號(hào)的均方根值，f eM為Clausius-Mossotti因子，在計(jì)算平 均介電泳力時(shí)取該因子的實(shí)部Re [fCM]。
[0029] 所述的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，feM因子定義如下：
[0031] ￡療和εη*分別是細(xì)胞和溶液的復(fù)介電常數(shù)。
[0032] 所述的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，所述復(fù)介電常數(shù)表示為：
[0034] 其中，ε是溶液的介電常數(shù)，σ是導(dǎo)電率，ω是所施加交流信號(hào)的頻率。
[0035] 所述的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，細(xì)胞旋轉(zhuǎn)速度為：
[0037] 其中E是電場(chǎng)強(qiáng)度，η是溶液的黏稠度，頂[fCM]是Clausius-Mossotti因子的虛 部，K為系數(shù)。
[0038] 所述的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，其中，細(xì)胞在平均介電泳力下的 位移公式如下：
[0039]
U。是細(xì)胞在平均介電泳力下的初速度，τ是時(shí)間常數(shù)。
[0040] 有益效果：本發(fā)明的細(xì)胞分類方法，其成本低，操作簡(jiǎn)單，整個(gè)分類過程基本上是 自動(dòng)化的，只需把培養(yǎng)好的細(xì)胞放入容器中，即可自動(dòng)分類，由于分類過程的自動(dòng)化，所以 可在很短的時(shí)間內(nèi)完成大量細(xì)胞的分類，效率較高。另外本發(fā)明的方法準(zhǔn)確率高，在現(xiàn)有條 件下能夠達(dá)到97. 5%的準(zhǔn)確率。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法較佳實(shí)施例的流程圖。
[0042] 圖2為本發(fā)明中的光誘導(dǎo)介電泳平臺(tái)的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明提供一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法，為使本發(fā)明的目的、技 術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具 體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0044] 請(qǐng)參閱圖1，圖1為本發(fā)明一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)的細(xì)胞分類方法較佳實(shí)施 例的流程圖，如圖所示，其包括步驟：
[0045] S100、制作光誘導(dǎo)介電泳芯片（0DEP芯片），所述光誘導(dǎo)介電泳芯片有三層結(jié)構(gòu)組 成：下層為涂有氫化非晶硅涂層的ITO玻璃，上層是不含涂層的ITO玻璃（即不含氫化非晶 硅涂層），在上下兩層ITO玻璃之間封裝有一個(gè)微流體通道，用于注射所需操作的溶液；
[0046] S200、向上下兩層ITO玻璃的電極輸入可變頻率的交流信號(hào)，同時(shí)利用入射光照 射所述光誘導(dǎo)介電泳芯片，從而在被照射的區(qū)域產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)；可先向微流體通道注入 細(xì)胞和介質(zhì)（介質(zhì)即所需操作的溶液，也即細(xì)胞所在溶液）。然后輸入交流信號(hào)。
[0047] S300、改變交流信號(hào)的頻率及大小，以控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向，同時(shí)采集細(xì)胞的圖像；
[0048] S400、根據(jù)采集的圖像對(duì)待分類細(xì)胞的位移和時(shí)間進(jìn)行擬合，然后根據(jù)擬合結(jié)果 使用已訓(xùn)練的支持向量機(jī)來進(jìn)行分類，得到細(xì)胞類型。
[0049] 進(jìn)一步，所述的步驟SlOO中，制作光誘導(dǎo)介電泳芯片的步驟具體包括：
[0050] S101、清理ITO玻璃基質(zhì)；
[0051] 清理ITO玻璃基質(zhì)的表面，保證接觸面的潔凈度。
[0052] S102、在ITO玻璃基質(zhì)上沉積氫化非晶硅涂層（a-Si :H);
[0053] 在ITO玻璃基質(zhì)表面沉積一層氫化非晶硅，厚度為1微米。
[0054] S103、在氫化非晶硅涂層上涂光刻膠；
[0055] S104、在光刻膠上進(jìn)行板印；
[0056] 板印是按照指定圖形制作遮蓋物，將遮蓋物放在光刻膠表面，用紫外線照射遮蓋 物，沒有被遮蓋的光刻膠在紫外線作用下溶解，最終得到與遮蓋物形狀相同的光刻膠層。
[0057] S105、接觸腐蝕至ITO玻璃基質(zhì)；具體是用草酸腐蝕制作的芯片表層，以去除沒有 覆蓋光刻膠的氫化非晶硅涂層。
[0058] S106、去除光刻膠；即將光刻膠從氫化非晶硅涂層表面去除。
[0059] S107、在ITO玻璃基質(zhì)上未覆蓋氫化非晶硅涂層的區(qū)域涂導(dǎo)電粘合劑。即在ITO 玻璃的表面沒有覆蓋氫化非晶硅涂層的位置添加一個(gè)導(dǎo)電觸點(diǎn)。
[0060] 而上層的ITO玻璃清理干凈之后，涂導(dǎo)電粘合劑即可。
[0061] 在上下兩層ITO玻璃之間封裝有一個(gè)微流體通道（100微米高），，具體是通過 PDMS或是雙面膠封裝出一個(gè)微流體通道。
[0062] 在步驟S200中，如圖2所示，首先搭建光誘導(dǎo)介電泳平臺(tái)。除了步驟SlOO制作的 ODEP芯片20,平臺(tái)還需要一臺(tái)光學(xué)顯微鏡10、一臺(tái)光學(xué)投影儀（高分辨率）、一個(gè)可編程信 號(hào)發(fā)生電路和主機(jī)系統(tǒng)。所述主機(jī)系統(tǒng)包括：圖像采集模塊、顯微視覺算法處理模塊、生物 芯片驅(qū)動(dòng)控制器、虛擬電極生成模塊以及顯示輸出模塊。所述圖像采集模塊用來采集光學(xué) 顯微鏡20的圖像，并交由顯微視覺算法處理模塊來進(jìn)行處理并通過顯示輸出模塊來顯示， 所述顯微視覺算法處理模塊還向生物芯片驅(qū)動(dòng)控制器及虛擬電極生成模塊發(fā)出信號(hào)用來 控制二者工作。所述生物芯片驅(qū)動(dòng)控制器連接所述可編程信號(hào)發(fā)生電路來改變交流信號(hào)頻 率和大小。所述可編程信號(hào)發(fā)生電路通過電極連接所述ODEP芯片20。所述光學(xué)投影儀設(shè) 置在ODEP芯片20下方，用來對(duì)其進(jìn)行入射光照射。所述虛擬電極生成模塊連接所述光學(xué) 投影儀。
[0063] 其中光學(xué)顯微鏡參數(shù)如下：
[0064] 尼康CFI60無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)；
[0065] 電動(dòng)對(duì)焦，可上下移動(dòng)（上13mm/下2mm);
[0066] 三目鏡筒，光分布：目鏡/相機(jī)100%/0, 20%/100%，0/100% ;
[0067] 目鏡放大倍率：IOx;
[0068] 聚光器：防水，工作距離：7. 2mm ;
[0069] 物鏡：20x，高度消色透鏡，納米結(jié)晶涂層；
[0070] 載物臺(tái)：電動(dòng)X軸和Y軸，分辨率：0. 1微米；
[0071] 紫外線截止濾光塊；
[0072] 熒光濾波套裝：FITC/GFP。
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