專利名稱：一種快速聚合優(yōu)良基因的水稻育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子細胞育種領(lǐng)域，具體是涉及一種快速聚合優(yōu)良基因的水稻育種方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界最重要的糧食作物之一，也是我國50％以上人口的主食，因而提高水稻的生產(chǎn)水平對于保證我國的糧食安全和國民經(jīng)濟的穩(wěn)步發(fā)展具有十分重要的意義。近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，使得我國人多地少的矛盾日益突出。據(jù)估計，到2010和2030年，我國水稻單產(chǎn)水平必須在1995年的基礎(chǔ)上，分別提高16％和33％才能滿足人民生活需求。但經(jīng)過矮化育種和雜種優(yōu)勢利用兩次大的突破后，目前世界水稻產(chǎn)量已達較高水平，通過常規(guī)育種方法提高水稻產(chǎn)量難度加大。同時，隨著人民生活水平的提高和環(huán)保意識加強，對水稻的品質(zhì)和安全性提出更高要求，因而培育高產(chǎn)多抗優(yōu)質(zhì)的水稻新品種(組合)就成為當(dāng)前水稻育種的迫切需要。
由于每個水稻材料所攜帶的優(yōu)良基因比較有限且或多或少地存在一些不足，因而將不同材料的兩個(或兩個以上)優(yōu)良基因組合到一個材料中，使其具有雙親的優(yōu)良基因，這就是水稻聚合育種并已成為水稻育種的重要內(nèi)容。目前人們主要通過常規(guī)雜交、分子標記輔助選擇和轉(zhuǎn)基因三條途徑來實現(xiàn)優(yōu)良基因的聚合，但由于通過常規(guī)雜交進行基因聚合存在育種周期長，工作量大的難題，而分子聚合育種和轉(zhuǎn)基因方法雖然可以減小育種工作量，但也存在費用高等問題難以被一般育種工作者所掌握。
光合作用是作物高產(chǎn)的生理基礎(chǔ)，據(jù)估計，作物干物質(zhì)的90％來源于光合作用，因而改善和提高作物的光合能力，就有可能促進作物產(chǎn)量水平的提高。自然界存在C3植物(水稻和小麥)和C4植物(如玉米和高粱)，二者具有不同的光合作用的途徑C3循環(huán)和C4循環(huán)。由于C4植物具有CO2泵作用，在高溫、高光及干旱條件下較C3植物有高的光合效率。將C4植物的高光效特性轉(zhuǎn)移到C3植物中以提高C3植物光合效率一直是育種家和生理學(xué)家關(guān)注的熱點。但因C4植物和C3植物雜交屬遠源雜交，這一研究多年來一直未有大的突破。1999年，美國學(xué)者古森本將C4植物玉米的光合作用關(guān)鍵酶PEPC基因轉(zhuǎn)入水稻中，并獲得高效表達，轉(zhuǎn)基因水稻的PEPC酶活性可達對照的20-40倍。通過國際合作，我國學(xué)者焦德茂引入了轉(zhuǎn)PEPC基因水稻，進一步的研究表明，轉(zhuǎn)PEPC基因水稻的光合效率和抗逆性和產(chǎn)量均較對照有較大幅度提高。同時通過常規(guī)育種和花藥培養(yǎng)相結(jié)合，獲得了一些高光合效率新株系，這些研究表明，將玉米的PEPC基因?qū)氲剿局锌梢蕴岣咂涔夂闲什⑴嘤龈弋a(chǎn)水稻新品種。
白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)是世界水稻生產(chǎn)中最嚴重的細菌性病害，在我國各稻區(qū)都有發(fā)生，尤以華中、華東和華南稻區(qū)發(fā)病嚴重，對水稻生產(chǎn)帶來極大威脅。為了防治該病，每年都要施用大量農(nóng)藥，不僅污染了環(huán)境增加了農(nóng)民的成本，而且影響了稻米的品質(zhì)，過多的施用農(nóng)藥還可能使稻米中農(nóng)藥殘留量超標，影響人們的身體健康。在植物組織培養(yǎng)中常會發(fā)生一些變異，即體細胞無性系變異，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳改良中，在水稻中目前已獲得了抗稻瘟病、抗紋枯病、抗胡麻葉斑病等細胞突變體。利用無性系變異技術(shù)，我們從高感水稻白葉枯病的雜交稻恢復(fù)系明恢63中獲得了抗病細胞突變體HX-3，經(jīng)多年研究從HX-3中鑒定出一個水稻抗白葉枯病基因Xa-25，該基因?qū)ξ覈景兹~枯病的主要代表菌株具有較好抗性，可廣泛應(yīng)用于培育抗白葉枯病水稻新品種。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有水稻聚合育種方法的不足，本發(fā)明提供了一種快速簡便、花費少的快速高效的聚合水稻優(yōu)良基因的育種新方法，該方法將常規(guī)雜交、花藥培養(yǎng)、生理測定有機結(jié)合，從而較好克服了常規(guī)方法育種周期長，分子標記輔助和轉(zhuǎn)基因育種的費用高等難題。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種快速聚合優(yōu)良基因的水稻育種方法，其特征在于將兩個分別具有不同優(yōu)良基因的水稻材料雜交，獲得F1雜種；對F1雜種進行花藥培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的花培株系；對穩(wěn)定花培株系進行性狀篩選，獲得聚合了優(yōu)良基因的水稻材料。
作為本發(fā)明的一個具體例子，是應(yīng)用本育種方法快速聚合玉米PEPC基因和水稻抗白葉枯病基因Xa-25，具體是將兩個分別具有玉米PEPC基因和抗白葉枯病基因Xa-25的水稻材料雜交，獲得F1雜種；對F1雜種進行花藥培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的花培株系；對穩(wěn)定花培株系進行性狀篩選獲得聚合了玉米PEPC基因和水稻抗白葉枯病基因Xa-25的水稻材料。
所說的性狀篩選是采用抗性鑒定、酶活性檢測、生理測定等方法，選擇出同時具備兩種優(yōu)良性狀的株系。在聚合玉米PEPC基因和水稻抗白葉枯病基因Xa-25的育種過程中，性狀篩選具體是指通過抗白葉枯病鑒定和PEPC活性測定，選出抗白葉枯病且PEPC活性大于或等于100μmol/mg-1h-1的花培株系；而且，在對高光合效率性狀篩選時，還可以PEPC活性測定的基礎(chǔ)上分別或同時輔以光合速率測定、PCR測定。
本發(fā)明中所說的優(yōu)良基因，育種者可以根據(jù)育種要求來確定，不限于上述提到的玉米PEPC基因、水稻抗白葉枯病基因Xa-25；只要確定了具體的優(yōu)良基因，那么本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就能依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法和操作對該優(yōu)良基因進行性狀篩選。
本發(fā)明的有益效果是，克服了現(xiàn)有水稻聚合育種的不足，將常規(guī)雜交、花藥培養(yǎng)、性狀篩選有機結(jié)合(如圖2、圖3)，形成了一種快速聚合優(yōu)良基因的育種新方法，運用本育種方法，能夠在兩年內(nèi)獲得穩(wěn)定的聚合株系，周期短、成本低，這比其它方法更適合我國水稻育種的實踐需要。


圖1是HPTER、HX-3和花藥培養(yǎng)株系PCR擴增電泳圖；其中M為標準分子量，1為HPTER，2為HX-3，3-12為HPTER和HX-3花藥培養(yǎng)株系，4、5、6、12分別為XP-4、XP-11、XP-17和XP-27。
圖2是快速聚合優(yōu)良基因的水稻育種流程示意圖；圖3是快速聚合玉米PEPC基因和抗白葉枯病基因Xa-25的水稻育種流程示意圖。
具體實施例方式
1.水稻穩(wěn)定花藥培養(yǎng)株系的獲得2003年3月在海南陵水以高光效但高感白葉枯病的水稻HPTER(下簡稱HPTER)為母本(具有玉米PEPC基因)，以抗病但不具有高光效特性的水稻(下簡稱HX-3)(具有抗白葉枯病基因Xa-25)為父本，獲得F1雜種。2003年5月種植該F1雜種，并于8月份取HPTER和HX-3的F1雜種植株處于單核靠邊期的花藥進行培養(yǎng)(花藥培養(yǎng)的配方為M8+2mg/L 2，4-D+1mg/L KT+3mg/L NAA+5％蔗糖+7g/L瓊脂)，共計接種HPTER/HX-3 F1雜種花藥3754枚，獲得愈傷組織348塊。將這些愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上(配方為MS+2mg/L 6-BA+1mg/LKT+3％蔗糖+7g/L瓊脂)，分化出綠苗67叢。2003年11月將所有綠苗移栽于海南陵水南繁基地種植。2004年按單株收獲種子，共計獲得42株水稻種子。2004年5月將這些種子按單株種植即成為一個株系，每個株系種植10株，在田間觀察其穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，所有這些株系都是穩(wěn)定的，沒有出現(xiàn)分離。2.花藥培養(yǎng)株系的抗病性鑒定2004年8月對HX-3、HPTER和42個株系進行白葉枯病抗性鑒定。以剪葉法接種我國水稻白葉枯病菌浙173。接種前將浙173凍干菌粉從-70℃取出，并于NA固體培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接活化2次，每次培養(yǎng)48-72h，接種時配制成109cfu/ml菌液。于水稻生長的孕穗期對HX-3、HPTER及42個穩(wěn)定株系進行抗性鑒定。在接菌后第21d進行抗性調(diào)查。以病斑長度作為抗性鑒定的評價指標，病斑長度大于6cm即為感病。HX-3表現(xiàn)為抗病(病斑長度為2.2cm)，HPTER表現(xiàn)為高度感病(病斑長度為10.0cm)，42個穩(wěn)定花藥培養(yǎng)株系中，18個株系表現(xiàn)抗病，24個株系表現(xiàn)感病。3.花培株系的PEPC活性和光合速率測定于2004年8月同時測定了HX-3、HPTER和42個株系的PEPC活性和光合速率。
PEPC活性測定方法為取水稻新鮮葉片0.5 g，用蒸餾水沖洗干凈，濾紙擦干后用小剪刀剪成小塊，置于預(yù)冷研缽中，加入含50 mMTris-HCl(pH 7.5)、1mM MgCl2、5mM DTT(二硫蘇糖醇)和2％(w/v)PVP的提取液3 ml，冰上研磨，雙層紗布過濾，濾液轉(zhuǎn)入5 ml離心管，首先取40μl濾液加入到960μl無水乙醇中，分別在649nm和665nm下測定消光值，以計算葉綠素含量。其余濾液于4℃下，13000 rpm離心10 mim。取上清液50μl，加入蒸餾水495μl、0.2M Hepes-KOH(pH 8.0)250μl、0.2 M NaHCO350μl、0.1 M MgCl250μl、4mM NADH 50μl和300 units/ml MDH 5μl，混合均勻后加入40mM PEP 50μl，在340nm測定反應(yīng)液消光值變化。
利用基因公司的LI-6400光合儀活體測定水稻的光合速率。所有待測水稻材料于8月下旬晴日上午11:00-12:00測定植株劍葉的光合速率。
HX-3的PEPC活性為63.6μmol/mg-1h-1，光合速率為27.1μmol CO2m-2s-1。而HPTER的PEPC活性為1337.1μmol/mg-1h-1，是常規(guī)水稻HX-3的20多倍，光合速率為37.5μmol CO2m-2s-1，比HX-3提高近30％，這說明轉(zhuǎn)入玉米PEPC基因確實能夠提高水稻的光合速率。42個穩(wěn)定株系中有13個株系具有高PEPC活性(＞100μmol/mg-1h-1)，結(jié)合白葉枯病抗性鑒定結(jié)果，獲得了7個抗病且具有高PEPC活性株系(見表1)，這些株系的PEPC活性為160-1197μmol/mg-1h-1，較常規(guī)水稻增加2-15倍，且光合速率增加20％以上。
表1水稻材料白葉枯病抗性調(diào)查和生理測定

4.聚合株系的分子鑒定經(jīng)登陸Genebank，得到玉米PEPC基因的登陸號為X15239，其序列全長為6.6kb左右，利用其全基因序列，設(shè)計PCR引物(sense5-CACAGCAGCTTCTCCTCCA-3；antisense 5-GCCAGTTCGGCATTTCCAT-3)，對國外獲得的轉(zhuǎn)玉米PEPC基因水稻(HPTER)、HX-3和我們獲得42個穩(wěn)定株系進行PCR檢測，HPTER和聚合株系均可擴增出清晰主帶(約500bp)，但HX-3和低PEPC活性株系不能擴出清晰帶型，因而從分子水平上進一步驗證了生理測定的結(jié)果，高PEPC活性的株系確實存在玉米PEPC基因(見圖1)。
權(quán)利要求
1.一種快速聚合優(yōu)良基因的水稻育種方法，其特征在于a.將兩個分別具有不同優(yōu)良基因的水稻材料雜交，獲得F1雜種；b.對F1雜種進行花藥培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的花培株系；c.對穩(wěn)定花培株系進行性狀篩選，獲得聚合了優(yōu)良基因的水稻材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的水稻育種方法，其特征在于a.將兩個分別具有玉米PEPC基因和抗白葉枯病基因Xa-25的水稻材料雜交，獲得F1雜種；b.對F1雜種進行花藥培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的花培株系；c.對穩(wěn)定花培株系進行性狀篩選，獲得聚合了玉米PEPC基因和水稻抗白葉枯病基因Xa-25的水稻材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說的水稻育種方法，其特征在于所說的性狀篩選是指通過抗白葉枯病鑒定和PEPC活性測定，選出抗白葉枯病且PEPC活性大于或等于100μmol/mg-1h-1的花培株系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所說的水稻育種方法，其特征在于所說的性狀篩選是指通過抗白葉枯病鑒定、PEPC活性測定、光合速率生理測定，選出抗白葉枯病且PEPC活性大于或等于100μmol/mg-1h-1的花培株系。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所說的水稻育種方法，其特征在于所說的具有玉米PEPC基因的水稻材料是水稻品種HPTER，所說的具有抗白葉枯病基因Xa-25的水稻材料是水稻品種HX-3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速聚合優(yōu)良基因的水稻育種方法。該方法是將兩個分別具有不同優(yōu)良基因的水稻材料雜交，獲得F1雜種；對F1雜種進行花藥培養(yǎng)，得到穩(wěn)定的花培株系；對穩(wěn)定花培株系進行性狀篩選，獲得聚合了優(yōu)良基因的水稻材料。本發(fā)明將常規(guī)雜交、花藥培養(yǎng)、性狀篩選有機結(jié)合，形成了一種快速聚合優(yōu)良基因的育種新方法，運用本育種方法，能夠在兩年內(nèi)獲得穩(wěn)定的聚合株系，周期短、成本低，這比其它方法更適合我國水稻育種的實踐需要。
文檔編號A01G16/00GK1709035SQ200510040408
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者高東迎, 焦德茂, 郭士偉 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院