專利名稱：離體授粉鑒定梨自花結(jié)實性品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一套離體授粉花柱培養(yǎng)法來鑒定梨自花結(jié)實性品種或株系的方法， 屬于植物育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
梨是我國乃至世界主要水果之一，我國現(xiàn)有栽培面積125. 84萬公頃，是我國的第 三大水果。梨是典型的配子體型自交不親和性果樹，也就是說梨絕大多數(shù)品種自花授粉不 結(jié)實性，在生產(chǎn)中必須合理配置授粉樹或進行人工輔助授粉，才有可能獲得應(yīng)有的產(chǎn)量，也 常常因授粉樹配置不當、花期不良氣象條件影響昆蟲傳粉或人工授粉不及時等原因造成減 產(chǎn)，尤其是近年來地球氣候變化激烈，春季倒春寒以及花期低溫陰雨天氣影響昆蟲的傳粉 活動，使得許多梨樹授粉受精不良，坐果率低下，嚴重影響產(chǎn)量。如果所栽培的梨品種自花 授粉能結(jié)實的話，就能避免或減少因傳粉媒介昆蟲的不活動而造成授粉受精不良、坐果率 低下、產(chǎn)量受損的問題，尤其是對于保護地栽培的果樹來說更為重要。因此，創(chuàng)新梨自花結(jié) 實性種質(zhì)，選育出梨自花結(jié)實性(自交親和性)品種是個亟待解決的問題，也是今后梨、 蘋果等自花授粉不結(jié)實性果樹新品種選育的目標之一。鑒于此，各國的梨育種學家已經(jīng) 把培育自花結(jié)實性品種作為育種目標，但是進展比較緩慢?，F(xiàn)有的自花結(jié)實性品種少，比 如，日本從‘二十世紀’中選出了芽變品種‘奧嗄二十世紀’，并在梨自花結(jié)實性育種中廣為 應(yīng)用，日本將‘奧嗄二十世紀’(S基因型為s2s4sm)，作為母本培育出自花結(jié)實性新品種‘秋 榮’(S4smS5)。本課題組近幾年通過雜交授粉也得到了一定群體的“奧嗄二十世紀”后代，并 從中篩選出了近百株的自花結(jié)實性株系。但從育種的角度來說，僅靠單一的品種做親本在 培育綜合經(jīng)濟性狀優(yōu)良的株系上存在著很大的局限性，獲得大量自花結(jié)實性品種群體是深 入研究自花結(jié)實性機理和培育出綜合經(jīng)濟性狀優(yōu)良的新品種的前提條件。因此，從眾多的 梨品種中快速篩選鑒定出自花結(jié)實性品種是當下科研工作者亟待解決的瓶頸問題。傳統(tǒng)的 鑒別果樹自花結(jié)實性的方法是通過調(diào)查田間自花授粉坐果率的高低來確定的。這一方法周 期長，耗時耗力，常因花期不良氣象條件而影響坐果，并且一年只能進行一次試驗，無法短 期內(nèi)對坐果率進行重復驗證。通常需要連續(xù)2 3年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計才能確定品種是否自花結(jié) 實，這為育種工作帶來了很大的不便。正是由于自花結(jié)實性品種在栽培育種和理論研究上 的重要意義，培育出的品種具有良好的應(yīng)用前景，所以尋找一種高效鑒定自花結(jié)實性株系 (品種等)的方法顯得尤為重要。在本發(fā)明中，通過觀測50多個梨品種離體授粉后花柱內(nèi)花粉管生長的特性，發(fā)現(xiàn) 從離體花柱的基部切口處長出花粉管的花柱比率與田間人工授粉的坐果率有一一對應(yīng)的 關(guān)系，并通過田間驗證，證實了應(yīng)用該方法鑒定的梨品種自花結(jié)實性程度與應(yīng)用田間授粉 鑒定的結(jié)果完全一樣，非常可靠。該方法改變了長期以來一直僅靠田間人工自花授粉坐果 率高低來確定果樹品種自花結(jié)實性程度的費時、費工、效率低下的局面。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是創(chuàng)建了一套花柱離體授粉鑒定梨品種自花結(jié)實性的方法。通過 統(tǒng)計在培養(yǎng)基上離體授粉花柱基部切口處長出花粉管的花柱比率高低來確定各供試品種 自花結(jié)實性的程度，并對梨品種的自花結(jié)實性程度進行了分類。該方法方便快捷，改變了傳 統(tǒng)的僅靠田間人工授粉坐果率高低來確定品種的自花(不)結(jié)實性強度的局面，為在較短 時期內(nèi)大批量地篩選鑒定梨品種自花結(jié)實性程度提供了可能，巨大地提高了工作效率。該 方法還可應(yīng)用于其它果樹自花結(jié)實性的研究。技術(shù)方案1、離體授粉鑒定梨自花結(jié)實性品種的方法，其特征在于1)人工自花授粉從大花蕾中取出花藥，收集在自然干燥條件下散出的花粉，同 時對擬授粉的花蕾去雄后，立即進行人工自花授粉；2)授粉花柱的培養(yǎng)在培養(yǎng)基上放置一張用酒精洗滌過的濾紙7. OcmXO. 2cm，將 授粉后的花柱平子房上端切下，迅速的放置到培養(yǎng)皿中排好，柱頭枕于濾紙上，并使花柱切 口端水平接觸于培養(yǎng)基，每個授粉組合處理花柱30-40根，重復3次，在25°C、黑暗保濕條件 下培養(yǎng)48h后，在花柱切口附近滴上質(zhì)量比0. 1 %的苯胺藍染色液，而后在顯微鏡下觀察統(tǒng) 計從花柱基部長出花粉管的花柱比率=長出花粉管的花柱數(shù)/供試花柱數(shù)X 100%，其比 率在30%以上者為自花結(jié)實性品種，10%以下者為自花不結(jié)實品種，處于二者之間的品種 為自花半結(jié)實性品種。大批量鑒定品種自花授粉結(jié)實性程度時，在春季開花前2個月左右，剪取花芽飽 滿的健壯結(jié)果枝，插入含質(zhì)量比10%蔗糖、水溶液深度5 6厘米的桶中，每隔5天更換溶 液1次，放到溫室或人工氣候室內(nèi)催花，獲得比田間提早30 40天開花的大花蕾。有益效果本發(fā)明所提供的花柱離體授粉鑒定梨自花結(jié)實性品種的方法，具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明的鑒定方法簡便。傳統(tǒng)用于鑒別果樹自花結(jié)實性程度的方法是通過調(diào) 查田間人工自花授粉坐果率的高低來確定的。這一方法周期長，需要花費很多人力物力。本 發(fā)明可在短時間內(nèi)進行大量樣品的檢測，操作簡便，只涉及簡單的授粉試驗和花粉管統(tǒng)計試 驗，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本，縮短了育種時間，并可為探討其他果樹品種自花結(jié)實性提供借鑒。(2)本發(fā)明準確性高。坐果率的調(diào)查常常因外界氣候條件影響而不能真實反映出 品種自花結(jié)實性的強弱，本發(fā)明所提供的離體授粉后的花柱培養(yǎng)法可完全避免了外界因素 的干擾，大大提高了鑒定的準確性。(3)本發(fā)明將梨品種的自花結(jié)實性程度進行了強、中、弱三種類型的分類，這為今 后梨品種自花結(jié)實性強弱的鑒定提供了理論參考依據(jù)，并為自花結(jié)實性機理的研究豐富了 試材。
四

圖1:人工自花授粉A 摘取完整花序；B 去除小花蕾和已經(jīng)開放的花；C 去雄后人工自花授粉；D 平 子房切取花柱；
圖2 授粉花柱離體培養(yǎng)示意圖；圖3 顯微鏡下觀察自花授粉后的花柱基部花粉管生長情況；圖4 供試52個梨品種長出花粉管花柱的比率統(tǒng)計供試品種分別為1，‘54S-135，；2，‘54S-168，；3，‘54S-213，；4，‘奧嗄二十世紀，； 5，‘新雪，；6，‘日本山梨，；7，‘巴梨，；8，‘54S-102，；9，‘晚三吉，；10, ‘八里，；11，‘菊水，； 12，‘二十世紀，；13，‘喜水，；14，‘彗星，；15，‘六月，；16，‘清澄，；17，‘祗園，；18，‘早生幸 藏，；19，‘松風，；20, ‘青龍，；21，‘水秀，；22，‘新幸，；23，‘市原早生，；24，‘三重豆梨，；25， ‘新星’ ；26, ‘鴨梨’ ；27，‘赤穗’ ；28，‘明月，；29，1 蟲逸’ ；30, ‘金二十世紀’ ；31，‘八云，；32， ‘真瑜’ ；33, ‘慈梨’ ；34，‘今村秋’ ；35，‘明水’ ；36，‘鈴木’ ；37，‘朝鮮豆梨’ ；38，‘八幸’ ；39， ‘筑水，；40, ‘愛甘水，；41，‘長壽，；42，‘珠玉，；43，‘清玉，；44，‘幸藏，；45，‘幸水，；46，‘豐 水，；47, ‘君冢早生’ 48，‘愛宕，；49，‘長十郎，；50, ‘新水，；51，‘伊田，；52，‘新高’；
五具體實施例方式(一 )實驗方法1、水培促花供試的52個品種均來自于南京農(nóng)業(yè)大學江浦園藝試驗站梨種質(zhì)資 源圃(中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，國家梨種質(zhì)資源圃內(nèi)保存有這些品種，詳細信息見專 利遺傳資源來源披露登記表)，在春季開花前的2月上旬左右，剪取已經(jīng)通過低溫解除休眠 的花芽飽滿的健壯枝條，將枝條的基部剪成斜面，直立插入含10%蔗糖、水溶液深度5 6 厘米的桶中，每隔5天更換溶液1次，放到溫室或人工氣候室內(nèi)催花；2、自花授粉采取一完整花序，去除已開的盛花和頂花，留大蕾期的花苞，去雄后， 立即蘸取自花花粉(圖1_A，B，C)；3、授粉花柱離體培養(yǎng)在培養(yǎng)基上放置一張用酒精洗滌過的濾紙 (7. OcmXO. 2cm)，將授粉后的花柱平子房上端切下(圖1_D)，迅速的在培養(yǎng)皿中排好，柱頭 枕于濾紙上，并使花柱切口端接觸培養(yǎng)基(圖2)。每個授粉組合處理花柱30根左右，重復 3次，在25°C、黑暗保濕的條件下培養(yǎng)；4、長出花粉管的花柱比率的統(tǒng)計授粉花柱離體培養(yǎng)48h后，在花柱切口附近滴 上數(shù)滴0. 1 %苯胺藍染色液，在顯微鏡下觀察從花柱基部長出的花粉管數(shù)，并統(tǒng)計從花柱基 部長出花粉管的花柱比率(長出花粉管的花柱數(shù)/供試花柱數(shù)X 100% )。( 二)結(jié)果與分析經(jīng)顯微鏡觀察，不同品種從花柱基部長出花粉管的多少存在差異。有些品種花柱 基部能明顯的觀察到很多花粉管長出(圖3-1)，有些長一兩根(3-2，3-3)，有些則沒有一根 花柱能長出花粉管(3-4)。統(tǒng)計各供試品種長出花粉管的花柱比率可以看出，最高的為‘奧 嗄二十世紀’的自交后代‘54S-135’，花柱比率可達43士6. 4%。最低的為‘新水’和‘新高’， 因從它們的花柱基部沒有觀察到花粉管長出，故統(tǒng)計比率為0%?？v觀供試各品種花柱基部 長出花粉管的花柱比率，比率值越高則說明該自花發(fā)粉管通過花柱的幾率大，易完成受精， 自花結(jié)實性好，反之則不易通過花柱，坐果率低。對比發(fā)現(xiàn)，供試品種的離體授粉花柱基部 切口處長出花粉管的花柱比例與田間人工授粉坐果率的高低有一一對應(yīng)的關(guān)系，故可根據(jù) 這一比率的高低來確定各供試品種自花結(jié)實性的強弱。為便于分類統(tǒng)計，本發(fā)明對供試的52個梨品種自花結(jié)實性強度劃分為三個類型
5將花柱比率在30%以上的定義為自花結(jié)實，在30% 10%之間的定義為半自花結(jié)實，將 10%以下的定義為自花不結(jié)實(圖4)。最終確認了 ‘新雪’，‘日本山梨’，‘巴梨’，‘奧嗄二十 世紀，及其4株自交后代‘54S-135，、‘54S-168，、‘54S-213，、‘54S-102，為自花結(jié)實性品種 (株系)。 通過自花授粉后花柱離體培養(yǎng)的方法來篩選自花結(jié)實性株系，改變了傳統(tǒng)的僅靠 田間人工授粉坐果率高低來確定品種自花結(jié)實性的局面。該方法簡便快捷，可在短時間內(nèi) 進行大量樣品的鑒定，縮短了育種時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本，并對其它植物自花結(jié)實的研究也 有著重要的參考價值。
權(quán)利要求
離體授粉鑒定梨自花結(jié)實性品種的方法，其特征在于1)人工自花授粉從大花蕾中取出花藥，收集在自然干燥條件下散出的花粉，同時對擬授粉的花蕾去雄后，立即進行人工自花授粉；2)授粉花柱的培養(yǎng)在培養(yǎng)基上放置一張用酒精洗滌過的濾紙7.0cm×0.2cm，將授粉后的花柱平子房上端切下，迅速的放置到培養(yǎng)皿中排好，柱頭枕于濾紙上，并使花柱切口端水平接觸于培養(yǎng)基，每個授粉組合處理花柱30 40根，重復3次，在25℃、黑暗保濕條件下培養(yǎng)48h后，在花柱切口附近滴上質(zhì)量比0.1％的苯胺藍染色液，而后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計從花柱基部長出花粉管的花柱比率＝長出花粉管的花柱數(shù)/供試花柱數(shù)×100％，其比率在30％以上者為自花結(jié)實性品種，10％以下者為自花不結(jié)實品種，處于二者之間的品種為自花半結(jié)實性品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述離體授粉鑒定梨自花結(jié)實性品種的方法，其特征在于在大批量鑒定品種自花授粉結(jié)實性程度時，在春季開花前2個月左右，剪取花芽飽滿 的健壯結(jié)果枝，插入含質(zhì)量比10%蔗糖、水溶液深度5 6厘米的桶中，每隔5天更換溶液 1次，放到溫室或人工氣候室內(nèi)催花，獲得比田間提早30 40天開花的大花蕾。
全文摘要
本發(fā)明創(chuàng)建了一種在室內(nèi)離體授粉鑒定梨品種自花結(jié)實性的方法，屬于植物育種領(lǐng)域。用大花蕾進行自花授粉，授粉后馬上用刀片從花柱與子房基部切取花柱，放置于固體培養(yǎng)基上在黑暗、25度的溫度條件下培養(yǎng)48小時后取出，在花柱基部滴上數(shù)滴質(zhì)量比0.1％苯胺藍染染色液后，在普通顯微鏡下觀測花柱基部長出花粉管的情況，如果花柱基部能夠長出花粉管，表明該品種自花授粉能夠結(jié)實，如果花柱基部沒有長出花粉管表明該品種自花授粉不結(jié)實。該方法解決了1年內(nèi)大量鑒定品種自花結(jié)實性的問題，不僅能鑒定所有梨品種資源，也能借鑒于其他果樹自花結(jié)實性的鑒定，有著廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H1/02GK101889543SQ20101023058
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張紹鈴, 陶書田, 齊開杰, 齊永杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學