專利名稱：一種保護細胞連接的深低溫保存方法
技術領域：
本發(fā)明涉及深低溫生物保存技術領域，特別涉及有利于保存組織和器的，一種保護細胞連接的深低溫保存方法。
背景技術：
組織和器官的深低溫保存是困擾低溫生物學研究領域的復雜難題。細胞連接在組織中的部位、結構和功能特殊，其對冷凍損傷的反應及冷凍損傷的保護機制也應具有其特殊性。因此，有必要對深低溫保存中的細胞連接損傷特點和規(guī)律進行系統(tǒng)觀察和研究，建立針對性的、有效的深低溫保存技術方案，提高和保證組織和器官的深低溫保存效果。研究表明，細胞連接可能是深低溫保存過程中各種損傷因子作用靶點之一，并導致組織結構的損傷與破壞。為什么細胞連接易受損傷？首先，細胞連接通過跨細胞膜蛋白，外聯(lián)相鄰細胞或基質(zhì)，內(nèi)聯(lián)細胞骨架蛋白，整個細胞連接處于細胞內(nèi)、外的不同部位，在深低溫保存過程中這些部位所受到的損傷壓力是不同的，如水與離子運動導致的滲透壓變化、降溫和復溫過程中細胞體積變化造成的機械張力等，增加了細胞連接組成蛋白結構的變化、破壞和變性等。另外，根據(jù)已有研究，細胞連接的胞內(nèi)主要成分肌動蛋白對于冷凍損傷的敏感性極高， 較多的研究發(fā)現(xiàn)來源于對哺乳動物卵母細胞的深低溫保存研究。然而，目前對于深低溫保存后細胞連接的結構和功能完整性、損傷特點及其結果缺乏系統(tǒng)研究，更缺乏如何保護細胞連接免受冷凍損傷的實驗研究。在降低冷凍損傷、提高復溫后細胞結構與功能完整性的研究中，熱休克蛋白(Hsps)作為分子伴侶在深低溫保存中對保存細胞活性的保護效果得到較多研究證實。Hsps是一個蛋白質(zhì)家族，具有輔助蛋白質(zhì)折疊、防止蛋白質(zhì)聚集和變形的功能，并輔助促進錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解。生理狀態(tài)下Hsps低水平表達，在高溫、化學因子等刺激下，Hsps表達顯著提高，并在細胞內(nèi)發(fā)揮保護作用。研究證實，在低溫保護劑溶液中添加姜黃素可以明顯提高胰島細胞Hsp70的表達， 并明顯降低冷凍復溫后胰島細胞的死亡率和功能損害；經(jīng)熱休克處理或基因轉染提高細胞 Hsp70表達水平可顯著提高冷凍復溫后細胞的存活率，以及細胞對于多種損傷因子的抵抗能力，但是如何提高Hsp70高表達水平也是目前急待解決的問題。在低溫保護劑研究中，海藻糖的獨特作用機制和效果在多種生物材料的深低溫保存中被證實。海藻糖具有穩(wěn)定和保護細胞蛋白質(zhì)作用，促進深低溫保存中玻璃化狀態(tài)的形成，抑制I IF形成。海藻糖主要通過兩種機制發(fā)揮保護生物分子的作用替代氫鍵中的水和限制必需結合水分子，使細胞“脫水”以減少冷凍時胞內(nèi)水分，穩(wěn)定細胞膜和蛋白質(zhì)。然而與二甲基亞砜、乙二醇等(滲透性保護劑)不同，海藻糖是一種非滲透性物質(zhì)，不能透過細胞膜，只能在細胞外發(fā)揮保護作用。鑒于上述技術需要，迫切需要出現(xiàn)一種工藝簡單，使用方便，組織和器官在深低溫保存后細胞連接的結構和功能能夠保持其完整性，能夠有效避免細胞連接受損的一種保護細胞連接的深低溫保存方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的缺點，提供一種工藝簡單，使用方便，組織和器官在深低溫保存后細胞連接的結構和功能能夠保持其完整性，能夠有效避免細胞連接受損的一種保護細胞連接的深低溫保存方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種保護細胞連接的深低溫保存方法，其中，包括如下步驟a、MDCK細胞培養(yǎng)的步驟b、將步驟a所得MDCK細胞分配為正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組；C、將步驟b中的正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、分別做濾器培養(yǎng)；Hsp70高表達組做濾器培養(yǎng)和基因轉染，Hsp70+海藻糖組做濾器培養(yǎng)和基因轉染；d、將正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組進行深低溫保存；e、細胞生長及形態(tài)學觀察(培養(yǎng)細胞顯微鏡觀察、HE染色)；f、細胞活率測定；g、細胞連接形態(tài)與結構觀察與分析；h、熒光黃實驗；所述步驟a為MDCK細胞種植于75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)液DMEM+10 % /胎牛血清；培養(yǎng)2 3天，當細胞完全匯合時，吸棄培養(yǎng)液，加入2mL消化液消化，顯微鏡下觀察細胞完全脫離瓶壁分離成單個細胞后，吸去消化液，加培養(yǎng)液成細胞懸液，計數(shù)細胞密度；微孔濾器培養(yǎng)細胞以8X IO4個/孔Q.5X105f/mL)的密度接種于微孔濾器中，微孔濾器置于M孔板，微孔濾器內(nèi)外各加入400 μ L和600 μ L培養(yǎng)液，隔日換液，3 4 天后細胞生長達完全融合，7天后實施步驟b。步驟c中的Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組的提高Hsp70高表達的方法熱刺激誘導將微孔濾器培養(yǎng)融合的細胞置于42°C水浴箱孵育30分鐘，重新放回37°C二氧化碳培養(yǎng)箱恢復正常培養(yǎng)，分別繼續(xù)培養(yǎng)12 J4和48小時后測定細胞Hsp70表達水平，確定 Hsp70高表達的時間；然后，采用上述熱刺激誘導方法誘導Hsp70高表達細胞并進行深低溫保存，復溫后進行實驗觀察與檢測；具體為或者，谷氨酰胺(Gln)靜脈注0. 75g · kg—1，6小時后取血管(n = 8)；或者，加熱處理(熱休克)TEB樣本培養(yǎng)皿置于加熱板上，并加溫到41°C，分別保持 15min,回復37°C條件繼續(xù)培養(yǎng)120min，進行各項實驗。或者，HSP誘導劑(谷氨酸鹽)(參考H. J. Jang等，2008年):TEB培養(yǎng)皿中加入終濃度lOmmol/L谷氨酸鹽培養(yǎng)12h，然后回復正常培養(yǎng)12小時后，進行各項實驗；構建高表達Hsp70MDCK細胞系Hsp70目的基因的重組載體pLenti-Hsp70的構建，提取!fepG2肝癌細胞株基因組總DNA —設計引物、酶切并PCR擴增Hsp70片段一酶切、鑒定、克隆，構建pLenti-Hsp70質(zhì)粒一pLenti-Hsp70經(jīng)酶切及測序鑒定；病毒的包裝制備重組病毒質(zhì)粒和輔助包裝原件載體質(zhì)粒(pVpack VSV-G與psPAX》一無內(nèi)毒素抽提一共轉染細胞(按hvitrogen公司Lipofectamine 2000使用說明進行)— 收集細胞上清液，濃縮后的慢病毒濃縮液保存于-70°C備用。病毒經(jīng)有限稀釋后感染細胞，通過綠色熒光蛋白的表達標定病毒滴度；Hsp70細胞株篩選細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板(DMEM 不含抗生素、10%胎牛血清)—添加病毒液到細胞一24小時后換液處理；感染48小時熒光顯微鏡檢查GFP表達；96小時開始對細胞進行換液處理，并添加濃度為500mg/L的G418進行篩選一逐步放大培養(yǎng)( 孔、6孔、60mm和 IOOmm 培養(yǎng)皿)一反復傳代，Real time PCR 和 Western blotting 檢測 MDCK 細胞 Hsp70 穩(wěn)轉細胞的Hsp70表達情況；深低溫保存Hsp70穩(wěn)定高表達的MDCK細胞種植到微孔濾器，按步驟a細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并進行深低溫保存。步驟d為制備低溫保護溶液(CPM)A 深低溫保存組的CPM (無海藻糖)1 號 CPM :5% (w/w)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液；2 號 CPM 10 % (w/w) Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液。B 海藻糖組的CPM 深低溫保存組的CPM中加入海藻糖，海藻糖濃度分別為 0. 25M, 0. 5M 禾口 1. OM 三組 CPM，即0. 25M 組(1 號5% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖)0. 5M 組(1 號5% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖)1. OM 組(1 號5% Me2S0+DMEM+l. OM 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+l. OM 海藻糖)降溫冷凍方法第一步將細胞(微孔濾器)緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持 4°C冷平衡10分鐘；第二步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘；第三步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C，然后將細胞緩慢浸沒液氮中保存1 2周。復溫方法液氮中取出細胞冷凍瓶，液氮蒸發(fā)后將冷凍瓶置于37°C水浴箱內(nèi)復溫，待CPM冰球融化后，吸去CPM，加入細胞培養(yǎng)液洗滌2次。將細胞移入培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。步驟e為細胞生長及形態(tài)學觀察(培養(yǎng)細胞顯微鏡觀察、HE染色)細胞體外生長及形態(tài)觀察
A 倒置顯微鏡下，每日觀察并記錄細胞形態(tài)及生長情況、細胞分布及融合情況；B =HE染色(光學顯微鏡下觀察)磷酸緩沖液(PBQ沖洗微孔濾器并在福爾馬林中固定20分鐘，水洗；蘇木素染色5分鐘，水洗；伊紅染色1 2分鐘，水洗；梯度乙醇脫水， 將膜撕下，正面朝上放于載玻片上，樹脂膠封片后光鏡觀察。步驟f為細胞活率測定；0.25%胰蛋白酶溶液消化、吹打，將細胞從微孔濾器上消化、成為細胞懸液，進行細胞活率測定A:染色法0. 臺盼藍溶液(0.9%氯化鈉溶液配制)滴加入培養(yǎng)板內(nèi)，2分鐘后顯微鏡下觀察、計數(shù)細胞，至少計數(shù)200個細胞，計算拒染細胞百分率(％)。雙盲觀察、計算，每樣本重復3遍，B :MTT法測定細胞活率將細胞種植于96孔板(每孔1 X IO5個細胞)，每孔含180ul 培養(yǎng)液，培養(yǎng)M小時；加入20ul MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3 4小時；吸去IOOul培養(yǎng)液，加入等量 0. 04 0. lmol/L鹽酸的異丙醇溶液，震蕩5分鐘；酶標儀測定光吸收(測定波長490nm)，
換算細胞活率。步驟g為細胞連接形態(tài)與結構觀察與分析；A :SEM主要操作步驟細胞一2. 5%戊二醛(PBS配制)固定一脫水、臨界點干燥一噴金包被一SEM觀察并圖片記錄細胞及細胞連接表面情況；B :TEM主要操作步驟微孔濾器細胞用PBS沖洗一4°C、3%戊二醛固定一四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一超薄切片(50 70nm)—鈾鉛染色后透射電子顯微鏡。C:免疫細胞化學主要操作步驟微孔濾器細胞用PBS沖洗一4°C、3%戊二醛固定一四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一半薄片 (Ium)—單克隆抗體(VE-cadherin、occludin、actin)反應一熒光標記二抗檢測一抗一熒光染色細胞檢測激光共聚焦顯微鏡下觀察、獲取圖像(所有圖像掃描3次，取平均值，消除誤差和干擾)。D 細胞層電阻(TER)按照各分組實驗步驟，采用跨上皮細胞電阻儀分別測定各實驗組的TER(A值)，并以無細胞生長的微孔濾器的電阻作為背景電阻(空白對照，B值)。用測得的A值減去背景電阻值B，再除以微孔濾器的面(S:cm2)，即獲得單層細胞TER值(單位Q/cm2)；計算公式TER= (B-A)/S(Q/cm2)0繪制TER-時間曲線。每一時間點至少對3個微孔濾器進行測量，每孔測量重復3遍。步驟h為熒光黃實驗；檢測細胞連接對熒光黃的通透性損傷的細胞能夠吸收染料，并通過細胞連接把染料轉移到臨近的細胞，待檢測培養(yǎng)細胞，吸去培養(yǎng)液，加入含有0. 5mg/ml的熒光黃溶液(DMEM配制)；用薄刀片在生長融合細胞層上“劃” 3-5條痕線，繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘，PBS洗滌，10%中性緩沖福爾馬林固定，相差熒光顯微鏡下獲取數(shù)字圖片，沿劃痕線計算50個視野下染料移動的距離，取平均值。
本發(fā)明的優(yōu)點為本發(fā)明通過MDCK細胞體外培養(yǎng)體系，觀察和比較深低溫保存前后細胞連接的結構及功能變化(光鏡、超微結構、染料透過實驗等)、細胞層電阻變化、細胞連接相關蛋白(VE-鈣粘連蛋白(VE-cadherin)、縫合蛋白(occludin)、肌動蛋白(actin)) 的分布特征及表達變化，探討深低溫保存對細胞連接的損傷特性及規(guī)律；在此基礎上，通過熱刺激和基因轉染技術提高細胞熱休克蛋白70(Hsp70)的表達水平，以及應用含有海藻糖的低溫保護溶液兩種途徑，觀察和分析Hsp70高表達和海藻糖在深低溫保存中對細胞連接損傷的保護作用特點及機制，初步篩選和評價基于細胞連接有效保護的組織或器官的深低溫保存技術方案，探討相關的冷凍損傷保護機制。本發(fā)明在科學設計課題的基礎上，對所采用的研究方法同樣進行了認真設計和選擇。一方面，根據(jù)本研究課題需要，所采用方法能夠從不同層面和角度論證所有的觀察和檢測指標。如細胞連接結構的觀察包括細胞培養(yǎng)觀察、細胞層電阻測定、光學顯微鏡和電子顯微鏡超微結構觀察，以及免疫細胞化學分析方法等。另一方面，本課題擬采用的方法是在細胞生物學研究和分子生物學研究中普遍采用、技術方法先進和可靠的方法，如基因轉染技術、RT-PCR和Western blotting等，保證所獲得的各種觀察結果、檢測數(shù)據(jù)等客觀、可靠，能夠真實反映各項實驗研究結果，進而選取出最優(yōu)異的，有利于組織的器官的細胞連接保護的深低溫保存方法。盡管意義重大，但組織或器官的深低溫保存技術仍然處于探索研究中。在影響組織或器官深低溫保存效果的諸多因素中，細胞連接具有特殊意義，它是細胞間完成功能協(xié)調(diào)的結構基礎，有效可靠的組織或器官深低溫保存技術必須保證細胞連接免受或少受損傷，以利于移植后功能恢復和發(fā)揮。本發(fā)明，首先對深低溫保存復溫過程對于細胞連接的損傷特點和規(guī)律進行觀察和分析；在此基礎上，提出深低溫保存方法的改進方案提高細胞熱休克蛋白(Hsp70)表達和利用海藻糖低溫保護劑。前者，具有有效提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)對冷凍損傷的耐受能力的效果；后者，可以穩(wěn)定及保護細胞膜和細胞外蛋白質(zhì)結構，減輕冷凍損傷效應。二者協(xié)同發(fā)揮作用，提高細胞連接對深低溫保存中冷凍損傷的整體耐受能力，避免或減輕復溫后細胞連接的結構和功能的破壞。本發(fā)明將二者有機結合，得到工藝簡單，有利于組織的器官的細胞連接保護的深低溫保存方法。


圖1為發(fā)明選取優(yōu)異深低溫保存方法的流程圖。圖2為本發(fā)明例2的TEB分組示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖，對發(fā)明進行說明。如圖1所示，圖1為發(fā)明選取優(yōu)異深低溫保存方法的流程圖。保護細胞連接的深低溫保存方法，其中，包括如下步驟a、MDCK細胞培養(yǎng)的步驟b、將步驟a所得MDCK細胞分配為正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組；C、將步驟b中的正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、分別做濾器培養(yǎng)；Hsp70高表達組做濾器培養(yǎng)和基因轉染，Hsp70+海藻糖組做濾器培養(yǎng)和基因轉染；
d、將正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組進行深低溫保存；e、細胞生長及形態(tài)學觀察(培養(yǎng)細胞顯微鏡觀察、HE染色)；f、細胞活率測定；g、細胞連接形態(tài)與結構觀察與分析；h、熒光黃實驗；步驟a細胞培養(yǎng)方法MDCK細胞種植于75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 °C 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)液 DMEM+10% /胎牛血清。2 3天，細胞完全匯合時，吸棄培養(yǎng)液，加入消化液(0. 25%胰蛋白酶+0. 03% EDTA)2mL消化，顯微鏡下觀察細胞完全脫離瓶壁分離成單個細胞后，吸去消化液，加培養(yǎng)液成細胞懸液，計數(shù)細胞密度。微孔濾器培養(yǎng)(W.J. Armitage 等，1994 ；Salah Amasheh 等，2001)細胞以 8 X IO4 個/孔Q.5X105個/mL)的密度接種于微孔濾器(Falcon。聚四氟乙烯包被膠原蛋白，孔徑0. 45 μ m,有效面積4. 16cm2)中，微孔濾器置于24孔板，微孔濾器內(nèi)外各加入400 μ L和 600 μ L培養(yǎng)液，隔日換液，3 4天后細胞生長達完全融合，7天后分別進行下述的各項實驗觀察與研究。步驟cHsp70高表達①熱刺激誘導將微孔濾器培養(yǎng)融合的細胞置于42°C水浴箱孵育30分鐘，重新放回37°C二氧化碳培養(yǎng)箱恢復正常培養(yǎng)，分別繼續(xù)培養(yǎng)12J4和48小時后測定細胞Hsp70表達水平 (Western blotting, RT-PCR。測定方法見下述)，確定Hsp70高表達適宜時間；然后，采用確定的熱刺激誘導方法誘導Hsp70高表達細胞并進行深低溫保存，復溫后進行各項實驗觀察與檢測。具體為或者，谷氨酰胺(Gln)靜脈注0. 75g · kg—1，6小時后取血管(n = 8)； 或者，加熱處理(熱休克)TEB樣本培養(yǎng)皿置于加熱板上，并加溫到41°C，分別保持 15min,回復37°C條件繼續(xù)培養(yǎng)120min，進行各項實驗?；蛘撸琀SP誘導劑(谷氨酸鹽)(參考H. J. Jang等，2008年):TEB培養(yǎng)皿中加入終濃度lOmmol/L谷氨酸鹽培養(yǎng)12h，然后回復正常培養(yǎng)12小時后，進行各項實驗；②構建高表達Hsp70MDCK細胞系A :Hsp70目的基因的重組載體pLenti_Hsp70的構建提取H印G2肝癌細胞株基因組總DNA —設計引物、酶切并PCR擴增Hsp70片段一酶切、鑒定、克隆，構建pLenti-HSp70質(zhì)粒一pLenti-Hsp70經(jīng)酶切及測序鑒定。B 病毒的包裝制備重組病毒質(zhì)粒和輔助包裝原件載體質(zhì)粒(pVpack VSV_G與psPAX》一無內(nèi)毒素抽提一共轉染細胞(按hvitrogen公司Lipofectamine 2000使用說明進行)— 收集細胞上清液，濃縮后的慢病毒濃縮液保存于-70°C備用。病毒經(jīng)有限稀釋后感染細胞，通過綠色熒光蛋白的表達標定病毒滴度。C :Hsp70細胞株篩選
細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板(DMEM 不含抗生素、10%胎牛血清)一添加病毒液到細胞一24小時后換液處理；感染48小時熒光顯微鏡檢查GFP表達；96小時開始對細胞進行換液處理，并添加濃度為500mg/L的G418進行篩選一逐步放大培養(yǎng)( 孔、6孔、60mm和 IOOmm 培養(yǎng)皿)一反復傳代，Real time PCR 和 Western blotting 檢測 MDCK 細胞 Hsp70 穩(wěn)轉細胞的Hsp70表達情況。D 深低溫保存Hsp70穩(wěn)定高表達的MDCK種植到微孔濾器，按上述細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并進行深低溫保存，復溫后進行各項實驗觀察與檢測。步驟d深低溫保存方法①低溫保護溶液(CPM)A 深低溫保存組CPM (無海藻糖)1 號 CPM :5% (w/w)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液；2 號 CPM 10% (w/w)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液。B 海藻糖組CPM 深低溫保存組CPM中加入海藻糖，海藻糖濃度分別為0. 25M， 0. 5M 和 1. OM 三組 CPM，即0. 25M 組(1 號5% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖)0. 5M 組(1 號5% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖)1. OM 組(1 號5% Me2S0+DMEM+l. OM 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+l. OM 海藻糖)②降溫冷凍方法第一步將細胞(微孔濾器)緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持 4°C冷平衡10分鐘；第二步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘；第三步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C，然后將細胞緩慢浸沒液氮中保存1 2周。③復溫方法液氮中取出細胞冷凍瓶，液氮蒸發(fā)后將冷凍瓶置于37°C水浴箱內(nèi)復溫，待CPM冰球融化后，吸去CPM，加入細胞培養(yǎng)液洗滌2次。將細胞移入培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并進行各項實驗觀察與研究。步驟f觀察與測定(細胞活率測定)①細胞體外生長及形態(tài)觀察A 倒置顯微鏡下，每日觀察并記錄細胞形態(tài)及生長情況、細胞分布及融合情況等；B =HE染色(光學顯微鏡下觀察)磷酸緩沖液(PBQ沖洗微孔濾器并在福爾馬林中固定20分鐘，水洗；蘇木素染色5分鐘，水洗；伊紅染色1 2分鐘。水洗，梯度乙醇脫水，將膜撕下，正面朝上放于載玻片上，樹脂膠封片后光鏡觀察。②細胞活率測定0.25%胰蛋白酶溶液消化、吹打，將細胞從微孔濾器上消化、成為細胞懸液，進行細胞活率測定。A:染色法0. 臺盼藍溶液(0.9%氯化鈉溶液配制)滴加入培養(yǎng)板內(nèi)，2分鐘后顯微鏡下觀察、計數(shù)細胞，至少計數(shù)200個細胞，計算拒染細胞百分率(％)。雙盲觀察、計算，每樣本重復3遍。B :MTT法測定細胞活率將細胞種植于96孔板(每孔1 X IO5個細胞)，每孔含180ul 培養(yǎng)液，培養(yǎng)M小時；加入20ul MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3 4小時；吸去IOOul培養(yǎng)液，加入等量 0. 04 0. lmol/L鹽酸的異丙醇溶液，震蕩5分鐘；酶標儀測定光吸收(測定波長490nm)，
換算細胞活率。③細胞連接觀察與分析A :SEM主要操作步驟細胞一2. 5%戊二醛(PBS配制)固定一脫水、臨界點干燥一噴金包被一SEM觀察并圖片記錄細胞及細胞連接表面情況。B :TEM主要操作步驟微孔濾器細胞用PBS沖洗一4°C、3%戊二醛固定一四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一超薄切片(50 70nm)—鈾鉛染色后透射電子顯微鏡。C:免疫細胞化學主要操作步驟微孔濾器細胞用PBS沖洗一4°C、3%戊二醛固定一四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一半薄片 (Ium)—單克隆抗體(VE-cadherin、occludin、actin)反應一熒光標記二抗檢測一抗一熒光染色細胞檢測激光共聚焦顯微鏡下觀察、獲取圖像(所有圖像掃描3次，取平均值，消除誤差和干擾)。④細胞層電阻(TER)按照各分組實驗步驟，采用跨上皮細胞電阻儀分別測定各實驗組的TER(A值)，并以無細胞生長的微孔濾器的電阻作為背景電阻(空白對照，B值)。用測得的A值減去背景電阻值B，再除以微孔濾器的面(S :cm2)，即獲得單層細胞TER值(單位Ω/cm2)。計算公式:TER= (B-A)/S ( Ω/cm2)。繪制TER-時間曲線。每一時間點至少對3個微孔濾器進行測量，每孔測量重復3遍。⑤熒光黃遷徙實驗檢測細胞連接對熒光黃的通透性。損傷的細胞能夠吸收染料，并通過細胞連接把染料轉移到臨近的細胞(Angela Mally等，2006)。待檢測培養(yǎng)細胞，吸去培養(yǎng)液，加入含有0. 5mg/ml的熒光黃溶液(DMEM配制)；用薄刀片在生長融合細胞層上“劃” 3-5條痕線，繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘，PBS洗滌，10%中性緩沖福爾馬林固定，相差熒光顯微鏡下獲取數(shù)字圖片，沿劃痕線計算50個視野下染料移動的距離，取平均值。例1 試驗材料24只200_250gSD大鼠的胸主動脈，仔細清除血管周圍的結締組織，剪成數(shù)段長約 3-5mm的動脈環(huán)，分3組新鮮對照組、常規(guī)保存組(常規(guī)深低溫保存)、實驗組(熱休克蛋白高表達+海藻糖保存)。2.主要試劑
二甲基亞砜(Me2SO)，谷氨酰胺(Glu)，海藻糖，細胞培養(yǎng)液(DMEM)3.實驗方法熱休克蛋白高表達方法三組分別進行熱休克蛋白高表達谷氨酰胺(Gln)靜脈注0. 75g 4^,6小時后取血管(n = 8)。常規(guī)深低溫保存保護劑(CPM)1 號 CPM :5% (v/v)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液；2 號 CPM 10% (v/v)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液。海藻糖深低溫保護劑1 號 CPM :5% (v/v)Me2S0+DMEM+0. 5M海藻糖，2 號 CPM 10% (v/v)Me2S0+DMEM+0. 5M
海藻糖。離體血管環(huán)張力實驗(所有3組血管)將血管段置于盛有IOmL Krebs 液(118mmol/L NaC, 147mmol/L KC, 110mmol/L N aH2P04,25mmol/LN aH C03,llmmol/Lg lucose,12mmol/L M gS04,25mmol/L CaCl2, pH =74)的浴槽內(nèi)，維持溫度37°C，持續(xù)充入95%氧氣/5%二氧化碳混合氣體，調(diào)節(jié)靜息張力于2g。標本平衡2小時后以累加給藥的方式予以不同濃度去氧腎上腺素(PE。lnmol/ L-lOOmol/L)，建立PE的劑量-反應曲線，并計算PE的Emax、EC50值。血管收縮力強度以空白對照組標本對PE反應的Emax作為100%。降溫冷凍保存、復溫(常規(guī)深低溫保存組、實驗組分別操作。每組分別用常規(guī)深低溫保存保護劑和海藻糖深低溫保護劑進行下述操作)降溫冷凍保存第1步將血管緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持 4°C冷平衡10分鐘；第2步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘；第3步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C， 然后將冷凍瓶緩慢浸沒液氮中保存1 2周。復溫方法液氮中取出冷凍瓶，液氮蒸發(fā)后將冷凍瓶置于37°C水浴箱內(nèi)復溫，待 CPM冰球融化后，吸去CPM，加入細胞培養(yǎng)液洗滌2次，進行血管張力實驗和下述實驗測定及分析。熱休克蛋白表達測定(所有3組血管，冷凍保存前)主動脈固定于中性甲醛中，制成石蠟切片，免疫組化方法檢測血管HSP70表達。兩組血管表達水平進行圖像分析后，結果統(tǒng)計學處理。血管組織學評價(所有3組血管)血管組織固定，常規(guī)HE染色，觀察血管組織學變化特點。血管超微結構觀察(所有3組血管)3%戊二醛溶液固定血管組織。A 掃描電鏡(SEM)主要操作步驟脫水、臨界點干燥一噴金包被一SEM觀察并圖片記錄血管內(nèi)皮細胞及細胞連接表面情況。B 透射電鏡 (TEM)主要操作步驟四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一超薄切片(50 70nm)—鈾鉛染色后透射電子顯微鏡。主要觀察血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及細胞間的連接結構，其他亞細胞結構如線粒體、細胞核等。結果1.血管組織熱休克蛋白表達
新鮮對照組和常規(guī)深低溫保存組血管組織中僅有微量HSP70表達，實驗組大鼠的血管組織HSP70表達量顯著提高(P < 005)。2.不同方法深低溫保存后血管張力實驗在離體血管張力實驗中，血管對PE反應的Emax、EC50值依次為新鮮對照組血管、 實驗組血管、常規(guī)對照組血管。統(tǒng)計學處理，差異有顯著性。3.不同方法深低溫保存后鼠血管組織結構及超微結構的觀察比較研究HE染色與新鮮對照組血管相比，常規(guī)深低溫保存組血管內(nèi)皮細胞脫落明顯，僅有部分內(nèi)皮保存，細胞形態(tài)等無顯著變化；實驗組血管內(nèi)皮細胞僅有少部分脫落，多數(shù)內(nèi)皮保存完好，細胞形態(tài)及結構正常。SEM常規(guī)深低溫保存血管內(nèi)皮散落、血管內(nèi)模裸露，僅又局灶性的殘留內(nèi)皮細胞；實驗組血管內(nèi)皮基本完整、連續(xù)性良好，僅少部分區(qū)域內(nèi)皮細胞脫落。TEM常規(guī)深低溫保存血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等結構完整，內(nèi)皮細胞與血管內(nèi)模間連接縫隙增寬、脫離，細胞間連接結構破壞，血管壁彈力纖維與內(nèi)彈力膜有斷裂；實驗組血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞結構完整，內(nèi)皮細胞與血管內(nèi)模間結構完整、連續(xù)，細胞間連接結構清晰、正常。結論本例核心的深低溫保存方法為將組織或器官熱休克蛋白高表達谷氨酰胺(Gln)靜脈注0. 75g ·1 Ρ，6小時后取血管(n = 8)。再進行降溫冷凍保存第1步將血管緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持4°C冷平衡10 分鐘；第2步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘； 第3步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C，然后將冷凍瓶緩慢浸沒液氮中保存1 2周。其中，1號 CPM :5 % (v/v)]\fe2S0+DMEM+0· 5M 海藻糖，2 號 CPM :10 % (ν/ν) Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖。例2 1、實驗材料與方法cBMSCs (犬骨髓間葉干細胞)的分離、培養(yǎng)和成骨分化)犬骨髓間葉干細胞，Percoll梯度離心分離并培養(yǎng)間葉干細胞，當細胞達到 80-90%融合時，0. 25%胰島素-EDTA分離細胞，傳代培養(yǎng)，二代細胞進行誘導分化培養(yǎng)，鑒定后進行下述實驗。組織工程化骨(TEB)的準備(間葉干細胞/脫鈣基質(zhì)(BMSC/DBM)結構)犬松質(zhì)骨(股骨頭)制取脫鈣骨基質(zhì)，有空體積約80%，平均孔徑330士33. 6微米。分離成骨化誘導的BMSC種植支架上，37°C培養(yǎng)4小時，讓細胞附著。然后將支架移入 24孔板，加入成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)。每2-3天換液一次。細胞材料復合物體外培養(yǎng)的增殖檢測將P2代成骨誘導cBMSCs接種于pDBM上，置入96孔板中，加入成骨誘導培養(yǎng)液，次日起每天隨機選擇4孔細胞材料復合物，分別以4孔單純pDBM作為陰性對照，每孔加入 MTT溶液20 μ 1，37°C孵育4h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μ 1 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15min裂解細胞，隨后將溶液移至另一 96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定每孔的光密度(OD)值，繪制細胞生長曲線。TEB分組方式如圖2所示。Hsp70 高表達①加熱處理(熱休克)TEB樣本培養(yǎng)皿置于加熱板上，并加溫到41°C，分別保持 15min,回復37°C條件繼續(xù)培養(yǎng)120min，進行各項實驗。②HSP誘導劑(谷氨酸鹽)(參考H. J.Jang等，2008年)TEB培養(yǎng)皿中加入終濃度lOmmol/L谷氨酸鹽培養(yǎng)12h，然后回復正常培養(yǎng)12小時后，進行各項實驗。TEB的玻璃化深低溫保存和復溫常規(guī)深低溫保存保護劑(CPM) 1號CPM 5 % (w/w)Me2SCHDMEM培養(yǎng)液；2號CPM 10 % (w/w) Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液。海藻糖深低溫保護劑1號CPM 5 % Me2S0+DMEM+0. 5M海藻糖，2號CPM 10 % Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖。降溫冷凍保存(常規(guī)深低溫保存組與實驗組分別就常規(guī)深低溫保存保護劑和海藻糖深低溫保護劑進行下述步驟操作)第1步將TEB緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持4°C冷平衡10 分鐘；第2步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘； 第3步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C，然后將細胞緩慢浸沒液氮中保存，致復溫。復溫方法液氮中取出冷凍瓶，液氮蒸發(fā)后將冷凍瓶置于37°C水浴箱內(nèi)復溫，待CPM冰球融化后，吸去CPM，加入培養(yǎng)液洗滌2次。將TEB移入培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并進行各項實驗觀察與研究。復溫后細胞活性和TEB成骨性上述MTT法檢測各自復溫后1、3、5、7、9、11和13天的細胞活性。光鏡下組織學評價TEB組織固定，常規(guī)HE染色，觀察血管組織學變化特點。電鏡觀察3%戊二醛溶液固定TEB。A 掃描電鏡(SEM)主要操作步驟脫水、臨界點干燥一噴金包被一SEM觀察并圖片記錄細胞及細胞連接表面情況。B 透射電鏡(TEM)主要操作步驟四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一超薄切片(50 70nm)—鈾鉛染色后透射電子顯微鏡。主要觀察細胞間，及其與支架間的連接結構，以及其他亞細胞結構如線粒體、細胞核等。統(tǒng)計學處理所有結果表示為均數(shù)士標準差。配對學生T-檢驗分析，統(tǒng)計學顯著性值ρ < 0. 05。結果TEB細胞活性及生長
成骨誘導的cBMSCs表現(xiàn)為相對同質(zhì)的群體，表現(xiàn)一種成纖維樣形態(tài)，3天內(nèi)迅速
增殖完全融合。三組TEB比較發(fā)現(xiàn)，細胞活性為新鮮對照組>實驗組>常規(guī)深低溫保存組。復溫后，實驗組和常規(guī)深低溫保存組細胞OD值首先表現(xiàn)為降低，細胞數(shù)減少；然后逐漸恢復并升高，細胞數(shù)增多。常規(guī)深低溫保存組細胞OD值恢復較實驗組慢，前者約需3-5天，后者 2-3天；常規(guī)深低溫保存復溫后TEB細胞OD值一直低于實驗組(P < 0. 05)。此現(xiàn)象表明， 復蘇后細胞需經(jīng)過適應期，部分凍傷細胞或脫落，或修復，或凋亡和死亡，然后，存活下來的細胞逐漸恢復正常增殖與分化。TEB光鏡觀察結果與新鮮對照組TEB相比，常規(guī)深低溫保存后，TEB的細胞減少，細胞形態(tài)等無顯著變化；而實驗組TEB中附著細胞數(shù)目與新鮮對照組無明顯差異。SEM常規(guī)深低溫保存后，TEB細胞有較多缺失部位，細胞數(shù)量明顯減少，細胞多呈現(xiàn)收縮、分離狀態(tài)；實驗組TEB中細胞數(shù)量與新鮮組無明顯差異，細胞連續(xù)性良好。TEM常規(guī)深低溫保存TEB的細胞結構完整，細胞間、細胞與基質(zhì)間的連接連續(xù)、完整， 細胞核、線粒體等亞細胞結構完整、清晰，與新鮮對照組無明顯差異。常規(guī)深低溫保存TEB 內(nèi)細胞間、細胞與基質(zhì)間連接結構模糊、分離，細胞線粒體結構部分收縮、膜破裂，細胞核間隙多增寬、核膜皺縮等。結論本例子的核心深低溫保存方法組織或器官的Hsp70高表達①加熱處理(熱休克)TEB樣本培養(yǎng)皿置于加熱板上，并加溫到41°C，分別保持 15min,回復37°C條件繼續(xù)培養(yǎng)120min，進行各項實驗。②HSP誘導劑(谷氨酸鹽)(參考H. J.Jang等，2008年)TEB培養(yǎng)皿中加入終濃度lOmmol/L谷氨酸鹽培養(yǎng)12h，然后回復正常培養(yǎng)12小時后，進行各項實驗。深低溫保存第1步將TEB緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持4°C冷平衡10 分鐘；第2步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘； 第3步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C，然后將細胞緩慢浸沒液氮中保存，致復溫。其中，1號 CPM :5 % Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖，2 號 CPM 10 % Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖。本發(fā)明通過MDCK細胞體外培養(yǎng)體系，觀察和比較深低溫保存前后細胞連接的結構及功能變化(光鏡、超微結構、染料透過實驗等)、細胞層電阻變化、細胞連接相關蛋白 (VE-鈣粘連蛋白(VE-cadherin)、縫合蛋白(occludin)、肌動蛋白(actin))的分布特征及表達變化，探討深低溫保存對細胞連接的損傷特性及規(guī)律；在此基礎上，通過熱刺激和基因轉染技術提高細胞熱休克蛋白70(Hsp70)的表達水平，以及應用含有海藻糖的低溫保護溶液兩種途徑，觀察和分析Hsp70高表達和海藻糖在深低溫保存中對細胞連接損傷的保護作
16用特點及機制，初步篩選和評價基于細胞連接有效保護的組織或器官的深低溫保存技術方案，探討相關的冷凍損傷保護機制。本發(fā)明在科學設計課題的基礎上，對所采用的研究方法同樣進行了認真設計和選擇。一方面，根據(jù)本研究課題需要，所采用方法能夠從不同層面和角度論證所有的觀察和檢測指標。如細胞連接結構的觀察包括細胞培養(yǎng)觀察、細胞層電阻測定、光學顯微鏡和電子顯微鏡超微結構觀察，以及免疫細胞化學分析方法等。另一方面， 本課題擬采用的方法是在細胞生物學研究和分子生物學研究中普遍采用、技術方法先進和可靠的方法，如基因轉染技術、RT-PCR和Western blotting等，保證所獲得的各種觀察結果、檢測數(shù)據(jù)等客觀、可靠，能夠真實反映各項實驗研究結果，進而選取出最優(yōu)異的，有利于組織的器官的細胞連接保護的深低溫保存方法。 盡管意義重大，但組織或器官的深低溫保存技術仍然處于探索研究中。在影響組織或器官深低溫保存效果的諸多因素中，細胞連接具有特殊意義，它是細胞間完成功能協(xié)調(diào)的結構基礎，有效可靠的組織或器官深低溫保存技術必須保證細胞連接免受或少受損傷，以利于移植后功能恢復和發(fā)揮。本發(fā)明，首先對深低溫保存復溫過程對于細胞連接的損傷特點和規(guī)律進行觀察和分析；在此基礎上，提出深低溫保存方法的改進方案提高細胞熱休克蛋白(Hsp70)表達和利用海藻糖低溫保護劑。前者，具有有效提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)對冷凍損傷的耐受能力的效果；后者，可以穩(wěn)定及保護細胞膜和細胞外蛋白質(zhì)結構，減輕冷凍損傷效應。二者協(xié)同發(fā)揮作用，提高細胞連接對深低溫保存中冷凍損傷的整體耐受能力，避免或減輕復溫后細胞連接的結構和功能的破壞。本發(fā)明將二者有機結合，得到工藝簡單，有利于組織的器官的細胞連接保護的深低溫保存方法。
權利要求
1.一種保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，包括如下步驟a、MDCK細胞培養(yǎng)的步驟b、將步驟a所得MDCK細胞分配為正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組；C、將步驟b中的正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、分別做濾器培養(yǎng)；Hsp70高表達組做濾器培養(yǎng)和基因轉染，Hsp70+海藻糖組做濾器培養(yǎng)和基因轉染；d、將正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組進行深低溫保存；e、細胞生長及形態(tài)學觀察(培養(yǎng)細胞顯微鏡觀察、HE染色)；f、細胞活率測定；g、細胞連接形態(tài)與結構觀察與分析；h、熒光黃實驗；
2.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，所述步驟a為 MDCK細胞種植于75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)液DMEM+10% /胎牛血清；培養(yǎng)2 3天，當細胞完全匯合時，吸棄培養(yǎng)液，加入2mL消化液消化，顯微鏡下觀察細胞完全脫離瓶壁分離成單個細胞后，吸去消化液，加培養(yǎng)液成細胞懸液，計數(shù)細胞密度；微孔濾器培養(yǎng)細胞以8X IO4個/孔(2. 5X IO5個/mL)的密度接種于微孔濾器中，微孔濾器置于M孔板，微孔濾器內(nèi)外各加入400 μ L和600 μ L培養(yǎng)液，隔日換液，3 4天后細胞生長達完全融合，7天后實施步驟b。
3.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，步驟c中的 Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組的提高Hsp70高表達的方法熱刺激誘導將微孔濾器培養(yǎng)融合的細胞置于42°C水浴箱孵育30分鐘，重新放回37°C二氧化碳培養(yǎng)箱恢復正常培養(yǎng)，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、對和48小時后測定細胞Hsp70表達水平，確定Hsp70 高表達的時間；然后，采用上述熱刺激誘導方法誘導Hsp70高表達細胞并進行深低溫保存， 復溫后進行實驗觀察與檢測； 具體為或者，谷氨酰胺(Gln)靜脈注0. 75g · kg-1，6小時后取血管(n = 8)； 或者，加熱處理(熱休克)TEB樣本培養(yǎng)皿置于加熱板上，并加溫到41 V，分別保持 15min,回復37°C條件繼續(xù)培養(yǎng)120min，進行各項實驗。或者，HSP誘導劑(谷氨酸鹽)(參考H. J. Jang等，2008年):TEB培養(yǎng)皿中加入終濃度lOmmol/L谷氨酸鹽培養(yǎng)12h，然后回復正常培養(yǎng)12小時后，進行各項實驗； 接著，構建高表達Hsp70MDCK細胞系Hsp70目的基因的重組載體pLenti-Hsp70的構建，提取H印G2肝癌細胞株基因組總 DNA —設計引物、酶切并PCR擴增Hsp70片段一酶切、鑒定、克隆，構建pLenti-Hsp70質(zhì)粒 —pLenti-Hsp70經(jīng)酶切及測序鑒定； 病毒的包裝制備重組病毒質(zhì)粒和輔助包裝原件載體質(zhì)粒(pVpack VSV-G與psPAX》一無內(nèi)毒素抽提一共轉染細胞(按hvitrogen公司Lipofectamine 2000使用說明進行)一收集細胞上清液，濃縮后的慢病毒濃縮液保存于-70°C備用。病毒經(jīng)有限稀釋后感染細胞， 通過綠色熒光蛋白的表達標定病毒滴度； Hsp70細胞株篩選細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板(DMEM:不含抗生素、10%胎牛血清)一添加病毒液到細胞 —M小時后換液處理；感染48小時熒光顯微鏡檢查GFP表達；96小時開始對細胞進行換液處理，并添加濃度為500mg/L的G418進行篩選一逐步放大培養(yǎng)( 孔、6孔、60mm和IOOmm 培養(yǎng)皿)一反復傳代，Real time PCR和Western blotting檢測MDCK細胞Hsp70穩(wěn)轉細胞的Hsp70表達情況； 深低溫保存Hsp70穩(wěn)定高表達的MDCK細胞種植到微孔濾器，按步驟a細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并進行深低溫保存。
4.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，步驟d為 制備低溫保護溶液(CPM)A 深低溫保存組的CPM(無海藻糖)1號 CPM 5% (w/w)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液；2號 CPM 10% (w/w)Me2S0+DMEM 培養(yǎng)液。B 海藻糖組的CPM 深低溫保存組的CPM中加入海藻糖，海藻糖濃度分別為0. 25M， 0. 5M 和 1. OM 三組 CPM，即0. 25M 組(1 號5% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+0. 25M 海藻糖)0.5M 組(1 號5% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+0. 5M 海藻糖)1.OM 組(1 號5% Me2S0+DMEM+l. OM 海藻糖，2 號10% Me2S0+DMEM+l. OM 海藻糖) 降溫冷凍方法第一步將細胞(微孔濾器)緩慢移入冷凍瓶內(nèi)，添加預冷到4°C的1號CPM，保持4°C 冷平衡10分鐘；第二步吸去1號CPM，再向瓶內(nèi)添加預冷到4°C的2號CPM，再次4°C冷平衡10分鐘； 第三步將冷凍瓶移入程序控制降溫儀內(nèi)，以1. 0°C /分鐘速率降溫至-80°C，然后將細胞緩慢浸沒液氮中保存1 2周。 復溫方法液氮中取出細胞冷凍瓶，液氮蒸發(fā)后將冷凍瓶置于37°C水浴箱內(nèi)復溫，待CPM冰球融化后，吸去CPM，加入細胞培養(yǎng)液洗滌2次。將細胞移入培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，步驟e為細胞生長及形態(tài)學觀察(培養(yǎng)細胞顯微鏡觀察、HE染色)細胞體外生長及形態(tài)觀察A 倒置顯微鏡下，每日觀察并記錄細胞形態(tài)及生長情況、細胞分布及融合情況； B:HE染色(光學顯微鏡下觀察)磷酸緩沖液(PBS)沖洗微孔濾器并在福爾馬林中固定20分鐘，水洗；蘇木素染色5分鐘，水洗；伊紅染色1 2分鐘，水洗；梯度乙醇脫水，將膜撕下，正面朝上放于載玻片上，樹脂膠封片后光鏡觀察。
6.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，步驟f為細胞活率測定；·0. 25%胰蛋白酶溶液消化、吹打，將細胞從微孔濾器上消化、成為細胞懸液，進行細胞活率測定A 染色法0.1%臺盼藍溶液(0.9%氯化鈉溶液配制)滴加入培養(yǎng)板內(nèi)，2分鐘后顯微鏡下觀察、計數(shù)細胞，至少計數(shù)200個細胞，計算拒染細胞百分率(％)。雙盲觀察、計算，每樣本重復3遍，B =MTT法測定細胞活率將細胞種植于96孔板(每孔1 X IO5個細胞)，每孔含180ul培養(yǎng)液，培養(yǎng)M小時；加入20ul MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3 4小時；吸去IOOul培養(yǎng)液，加入等量 0. 04 0. lmol/L鹽酸的異丙醇溶液，震蕩5分鐘；酶標儀測定光吸收(測定波長490nm)，換算細胞活率。
7.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，步驟g為細胞連接形態(tài)與結構觀察與分析；A :SEM主要操作步驟細胞一2. 5%戊二醛(PBS配制)固定一脫水、臨界點干燥一噴金包被一SEM觀察并圖片記錄細胞及細胞連接表面情況；B :TEM主要操作步驟微孔濾器細胞用PBS沖洗一4°C、3%戊二醛固定一四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一超薄切片 (50 70nm)—鈾鉛染色后透射電子顯微鏡。C 免疫細胞化學主要操作步驟微孔濾器細胞用PBS沖洗一4°C、3%戊二醛固定一四氧化鋨后固定一乙醇逐級脫水一環(huán)氧樹脂+丙酮(1 1)浸透池一環(huán)氧樹脂包埋一半薄片(lym) — 單克隆抗體(VE-cadheriruoccludiruactin)反應一熒光標記二抗檢測一抗一熒光染色細胞檢測激光共聚焦顯微鏡下觀察、獲取圖像(所有圖像掃描3次，取平均值，消除誤差和干擾)。D 細胞層電阻(TER)按照各分組實驗步驟，采用跨上皮細胞電阻儀分別測定各實驗組的TER(A值)，并以無細胞生長的微孔濾器的電阻作為背景電阻(空白對照，B值)。用測得的A值減去背景電阻值B，再除以微孔濾器的面(S :cm2)，即獲得單層細胞TER值(單位Ω/cm2)；計算公式TER =(B-A)/S (Ω/cm2)。繪制TER-時間曲線。每一時間點至少對3個微孔濾器進行測量，每孔測量重復3遍。
8.根據(jù)權利要求1所述保護細胞連接的深低溫保存方法，其特征在于，步驟h為熒光黃實驗；檢測細胞連接對熒光黃的通透性損傷的細胞能夠吸收染料，并通過細胞連接把染料轉移到臨近的細胞，待檢測培養(yǎng)細胞，吸去培養(yǎng)液，加入含有0.5mg/ml的熒光黃溶液(DMEM配制)；用薄刀片在生長融合細胞層上“劃”3-5條痕線，繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘，PBS洗滌，10%中性緩沖福爾馬林固定，相差熒光顯微鏡下獲取數(shù)字圖片，沿劃痕線計算50個視野下染料移動的距離，取平均值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保護細胞連接的深低溫保存方法，其中，包括如下步驟a、MDCK細胞培養(yǎng)的步驟b、將步驟a所得MDCK細胞分配為正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組；c、將步驟b中的正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、分別做濾器培養(yǎng)；Hsp70高表達組做濾器培養(yǎng)和基因轉染，Hsp70+海藻糖組做濾器培養(yǎng)和基因轉染；d、將正常對照組、深低溫保存組、海藻糖組、Hsp70高表達組和Hsp70+海藻糖組進行深低溫保存；e、細胞生長及形態(tài)學觀察(培養(yǎng)細胞顯微鏡觀察、HE染色)；f、細胞活率測定；g、細胞連接形態(tài)與結構觀察與分析；h、熒光黃實驗。本發(fā)明工藝簡單，使用方便，組織和器官在深低溫保存后細胞連接的結構和功能能夠保持其完整性，能夠有效避免細胞連接受損。
文檔編號A01N1/02GK102487938SQ201110385220
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權日2011年11月15日
發(fā)明者王沛濤 申請人:青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院