專利名稱：一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羅非魚種質(zhì)資源保存和精子低溫生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，特別是針對尼羅羅非魚精子進(jìn)行超低溫保存。
背景技術(shù)：
羅非魚(Tilapia)為一種中小形魚，被譽(yù)為未來動(dòng)物性蛋白質(zhì)的主要來源之一。 原產(chǎn)于非洲，上世紀(jì)70年代被引進(jìn)到我國，目前已成為我國一個(gè)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。隨著我國對羅非魚品種的選育和改良，除最初引進(jìn)的尼羅羅非魚(0. niloticus)和奧尼亞羅非魚(0. aureus)外，又培育了許多新的品種。如尼羅羅非魚和奧尼亞羅非魚的雜交后代奧尼羅非魚；通過3系雜交選育的后代尼羅超雄魚；以及由8個(gè)品系的尼羅羅非魚經(jīng)雜交混合選育的吉富羅非魚等。為了能進(jìn)一步開展羅非魚的新品種選育，以及羅非魚的人工繁殖，為市場提供更優(yōu)質(zhì)的羅非魚新品種和苗種，需要進(jìn)行羅非魚精子超低溫保存。然而，不同魚類的精子其外形、大小、密度、滲透壓、激活后的壽命以及其它生物學(xué)特性都不一樣。因此，不同魚類的精子要求有不同的冷凍方法。尼羅羅非魚精子超低溫冷凍保存方法除了有一般魚類精子冷凍保存所必須的步驟外，還有幾個(gè)關(guān)鍵步驟。這些關(guān)鍵步驟的參數(shù)都是由尼羅羅非魚精子的生物學(xué)特性決定的。I.精子的滲透壓不同決定了精子的稀釋液配方就不同。滲透壓過高的稀釋液會(huì)使精子在稀釋過程中嚴(yán)重脫水，精子內(nèi)部滲透壓迅速升高，造成精子破裂。滲透壓過低的稀釋液，又會(huì)使精子在冷凍過程中不斷被激活，從而導(dǎo)致大量精子死亡。尼羅羅非魚精子的滲透壓在280 285m0sM之間，這就要求尼羅羅非魚的精子稀釋液滲透壓也在這個(gè)值的區(qū)間，從而確保精子在被稀釋后，即不被激活也不破裂。2.不同魚類的精子密度不同，決定了在冷凍過程中精子的稀釋比也不盡相同。尼羅羅非魚精液中所含精子的密度一般為I. 4 I. 8X IO9個(gè)/ml。當(dāng)對羅非魚精子進(jìn)行超低溫保存時(shí)，含高密度精子的精原液是不能直接進(jìn)行超低溫冷凍保存的。這是因?yàn)樵诶鋬鲞^程中，當(dāng)溫度降到0°C -20°C區(qū)間時(shí)，被保存的精液中會(huì)形成冰晶，冰晶像鋒利的刀一樣刺向四周的精子，將精子刺破。這種在冷凍過程中冰晶對精子的物理損傷將直接導(dǎo)致精子超低溫冷凍保存的失敗。因此，冷凍前必須要對精子進(jìn)行稀釋。如果稀釋比較低，稀釋不夠， 則精子密度仍然過高，精子被刺破的概率也仍然很高。稀釋比過高，則影響了精子保存的總量，精子保存的效率很低，而且還會(huì)影響到后期的凍精授精。3.不同魚類的精子膜通透性也不盡相同。精子膜的通透性決定了精子冷凍前在稀釋液中的最小平衡時(shí)間。通透性好的精子平衡時(shí)間較短，通透性差的精子平衡時(shí)間較長。 因此，每一種魚的精子都有一個(gè)相對恒定的最小平衡時(shí)間。精子在達(dá)到最小平衡時(shí)間后可以維持一段時(shí)間精子活力不衰減。不同的魚類這段時(shí)間是不完全相同的，它與精子被激活后的壽命有關(guān)。一般來講，當(dāng)激活液選擇正確時(shí)，壽命越長，則這段時(shí)間也越長。尼羅羅非魚精子的這段時(shí)間在4°C冰箱中可維持I小時(shí)40分鐘。超過這段時(shí)間，精子就開始呈幾何級數(shù)衰減。4.由于不同魚類精子的大小、形狀不同，導(dǎo)致溫度在精子中的傳導(dǎo)速度和時(shí)間也不相同。因此，每種魚精子超低溫保存的降溫程序也不盡相同。尼羅羅非魚精子的降溫程序是經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)后摸索出來的。上述因素的綜合效應(yīng)決定了尼羅羅非魚精子的超低溫冷凍保存必須要有其特定的方法。本發(fā)明中的方法是根據(jù)尼羅羅非魚精子的生物學(xué)特性所設(shè)計(jì)的，目前已成功的應(yīng)用到尼羅羅非魚精子的超低溫保存中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，方法易行， 操作簡便，應(yīng)用該方法保存尼羅羅非魚精子，可最大限度的提高精子復(fù)蘇后的存活率，減少冷凍過程對精子的各種損傷。對尼羅羅非魚精子進(jìn)行超低溫保存，從而為羅非魚的選育種提供必須的材料和手段。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，其步驟是(I)尼羅羅非魚精子的采集選擇性腺發(fā)育成熟的尼羅羅非魚雄魚，用干毛巾擦干生殖孔周圍及腹部的水。用手輕輕擠壓雄魚腹部，待能擠出精液后，前面幾滴(3-6)精液不要，然后將精液擠入干燥的容器中，混勻。(2)精子活力檢測在10X20倍的顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，計(jì)算機(jī)輔助檢測鮮精平均活率達(dá)到85%以上，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)達(dá)到35微米/秒以上，平均直線運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到20微米/秒以上，該精子便可用于超低溫冷凍保存。將鏡檢合格的精子放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?3)精子的稀釋精確量取需要被冷凍的尼羅羅非魚精液，加入精液約3倍體積 (為了分裝方便，稀釋液的量可適當(dāng)增減一點(diǎn)，增減的量一般不超過總量的10% )的精子稀釋液，使精液與稀釋液的稀釋比達(dá)到約I : 3。精液與稀釋液混勻，備用。所述的精子稀釋液所用稀釋液為羅非魚通用稀釋液，其配方為127. 5mmol/L氯化鈉(NaCl)，7. 5mmol/L 氯化鉀(KCl)，2. 5mmol/L 碳酸氫鈉(NaHCO3)，2. OmmoI/L 氯化鈣 (CaCl2)。該稀釋液滲透壓為283. 5m0sM, pH為8. 5。作用是盡可能減少冷凍過程中冰晶對精子的損傷。放置在4°C冰箱保存，備用(4)精液的凍前平衡將稀釋后的精液放入4°C冰箱，進(jìn)行凍前平衡。尼羅羅非魚精液的凍前平衡時(shí)間為20-120分鐘。20分鐘為最少平衡時(shí)間，如果平衡時(shí)間不到20分鐘， 則冷凍效果會(huì)下降。120分鐘為最長平衡時(shí)間，20分鐘到120分鐘以內(nèi)，冷凍效果沒有差異， 超過120分鐘，則冷凍效果隨著時(shí)間的延長逐漸降低。(5)加抗凍劑及分裝在平衡好的尼羅羅非魚精液中直接加入抗凍劑二甲亞砜 (DMSO)，加入的量為稀釋后精液總量的8 9%，使抗凍劑在精液中的終濃度達(dá)到8%左右。 抗凍劑加入后，立即混勻，分裝。目前分裝有2種容器，一種是0. 5ml麥管，6支麥管裝入I 個(gè)麥管套中，I個(gè)冷凍架上可放2個(gè)麥管套。一般冷凍精液稀釋后的總量低于18ml時(shí)，就采用這種方式分裝。這種分裝方式的優(yōu)點(diǎn)是冷凍保存的成功率高，解凍速度快。缺點(diǎn)是分裝較慢。另一種是2ml冷凍管，I個(gè)冷凍架上可放5支冷凍管。一般冷凍精液總量大于20ml時(shí)，就采用這種方式分裝。這種分裝方式的特點(diǎn)是分裝速度較快，適合大批量精子的超低溫保存，缺點(diǎn)是冷凍效果比麥管差，解凍速度也較慢。無論是麥管分裝，還是冷凍管分裝均需注意首先，所有的管內(nèi)必須被精液裝滿，不能留有氣泡。其次，所有的分裝過程必須在冰面完成，分裝完成的管子在沒有進(jìn)入程序降溫儀前，應(yīng)全部埋在冰里，確保管內(nèi)的精液不會(huì)升溫。所述的抗凍劑所用抗凍劑為二甲亞砜(DMSO)，無需配制，直接用原液。抗凍劑是利用其吸水作用，使精子中的部分水脫出，細(xì)胞質(zhì)濃度升高，從而達(dá)到降低精子冰點(diǎn)的目的，防止精子在冷凍過程中精子內(nèi)部形成冰晶。放置在4°C冰箱保存，備用(6)程序降溫降溫是在程序降溫儀(kryo. 550_16，英國)中進(jìn)行，程序降溫儀由計(jì)算機(jī)控制，當(dāng)計(jì)算機(jī)被輸入自行設(shè)計(jì)的降溫程序后，程序降溫儀會(huì)按照設(shè)計(jì)好的程序開始降溫。將分裝好的精液以最快的速度放入程序降溫儀的冷凍室中。尼羅羅非魚的降溫程序從0°C開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°c，在-15°c停留5分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從_15°C降至-85 °C，最后在_85°C處平衡10分鐘。所述的降溫程序?yàn)閺?°C開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5 分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從-15°C降至_85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘。(7)進(jìn)入液氮降溫完成后，直接將裝有精液的麥管或冷凍管連同冷凍支架一起從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在_196°C溫度中保存。與其他魚類精子超低溫冷凍保存方法的比較下表為尼羅羅非魚精子與其他幾種魚類超低溫保存方法的比較
權(quán)利要求
1.一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，其步驟是(1)尼羅羅非魚精子的采集選擇性腺發(fā)育成熟的尼羅羅非魚雄魚，用干毛巾擦干生殖孔周圍及腹部的水，用手輕輕擠壓雄魚腹部，待能擠出精液后，前面3-6滴精液不要，然后將精液擠入干燥的容器中，混勻；(2)精子活力檢測在10X20倍的顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，計(jì)算機(jī)輔助檢測鮮精平均活率達(dá)到85%，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到35微米/秒，平均直線運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到20微米/秒，該精子適合用于超低溫冷凍保存，將鏡檢合格的精子放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)精子的稀釋精確量取需要被冷凍的尼羅羅非魚精液，加入精液3倍體積的精子稀釋液，使精液與稀釋液的稀釋比達(dá)到I : 3，精液與稀釋液混勻，備用；(4)精液的凍前平衡將稀釋后的精液放入4°C冰箱，進(jìn)行凍前平衡，尼羅羅非魚精液的凍前平衡時(shí)間為20-120分鐘，20分鐘為最少平衡時(shí)間，120分鐘為最長平衡時(shí)間；(5)加抗凍劑及分裝在平衡好的尼羅羅非魚精液中直接加入抗凍劑二甲亞砜，加入的量為稀釋后精液總量的8 9 %，使抗凍劑在精液中的終濃度達(dá)到8 %，抗凍劑加入后，混勻，分裝;(6)程序降溫程序降溫是在程序降溫儀中進(jìn)行，程序降溫儀由計(jì)算機(jī)控制，計(jì)算機(jī)被輸入降溫程序后，程序降溫儀按照程序開始降溫，將分裝好的精液放入程序降溫儀的冷凍室中，尼羅羅非魚的降溫程序從0°C開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5 分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從-15°C降至_85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘；(7)進(jìn)入液氮降溫完成后，直接將裝有精液的麥管或冷凍管連同冷凍支架一起從程序降溫儀中取出，放入液氮罐中，在_196°C溫度中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，所述的精子稀釋液為羅非魚稀釋液，其配方為127. 5mmol/L氯化鈉,7. 5mmol/L氯化鉀,2. 5mmol/L碳酸氫鈉，2. OmmoI/L氯化鈣，該稀釋液滲透壓為293. OmOsM, pH為8. 5，放置在4°C冰箱保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種尼羅羅非魚精子超低溫保存的方法，其步驟是(1)尼羅羅非魚精子的采集選擇性腺發(fā)育成熟的尼羅羅非魚雄魚，將精液擠入干燥的容器中，混勻；(2)精子活力檢測在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，將鏡檢合格的精子放入冰箱保存?zhèn)溆茫?3)精子的稀釋精確量取需要被冷凍的尼羅羅非魚精液，加入精子稀釋液，精液與稀釋液混勻；(4)精液的凍前平衡將稀釋后的精液放入冰箱，進(jìn)行凍前平衡；(5)加抗凍劑及分裝；(6)程序降溫；(7)進(jìn)入液氮降溫完成后，直接將裝有精液的麥管從程序降溫儀中取出，放入液氮罐中，保存。方法易行，操作簡便，對尼羅羅非魚精子進(jìn)行超低溫保存，從而為羅非魚的選育種提供必須的材料和手段。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102578075SQ20121000738
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者張潔明, 張濤, 李忠, 柳凌, 梁宏偉, 鄒桂偉, 郭峰 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所