專(zhuān)利名稱(chēng)：人工合成用于轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物的epsps基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程學(xué)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因及其在抗草甘膦植株選育、組織細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
N-膦酰甲基甘氨酸，也稱(chēng)草甘膦，是使用最為廣泛的廣譜除草劑，具有對(duì)人畜無(wú)毒，自然條件下雜草和農(nóng)作物難以對(duì)其產(chǎn)生抗性，低土壤殘留量、易于被微生物分解等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的除草劑品種。然而由于草甘膦無(wú)選擇性的殺死雜草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物種植區(qū)使用，這便制約了其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。為了獲得抗草甘膦作物，從上世紀(jì)80年代，人們便開(kāi)始培育抗草甘膦農(nóng)作物，其中最成功的例子是將改良的草甘膦靶標(biāo)酶EPSP合酶導(dǎo)入植物中，以提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)草甘膦的抗性。草甘膦是通過(guò)抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，該酶催化莽草酸代謝途徑倒數(shù)第二個(gè)反應(yīng)。正常情況下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與3-磷酸莽草酸(S3P)反`應(yīng)生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和無(wú)機(jī)磷。由于草甘膦與PEP結(jié)構(gòu)相似，在植物和微生物體內(nèi)可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦復(fù)合物，阻截PEP與酶的結(jié)合，從而阻斷芳香族氨基酸的合成。該酶只在植物和微生物中存在，在動(dòng)物體中不存在。在一些極端環(huán)境下，如長(zhǎng)期噴灑草甘膦的農(nóng)田、草甘膦工廠(chǎng)的廢液池以及人為的加大對(duì)某植株草甘膦的選擇壓力等，發(fā)現(xiàn)了部分對(duì)草甘膦具有耐受能力的細(xì)菌和植物。如Amrhein等人通過(guò)逐漸增加草甘膦的濃度，分離到一個(gè)耐受草甘膦的矮牽牛細(xì)胞系；Baers0n等人在長(zhǎng)期噴灑草甘膦的果園中發(fā)現(xiàn)了一株耐受草甘膦的牛筋草，經(jīng)過(guò)后期實(shí)驗(yàn)證明這些抗性的產(chǎn)生均為EPSPS基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致了其與草甘膦的結(jié)合能力降低，并且保證了正常的催化能力。植物可以通過(guò)轉(zhuǎn)化對(duì)草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而獲得抗草甘膦的能力。根癌農(nóng)桿菌CP4、突光假單胞菌G2和Salmonella typhimuriumCT7的EPSPS已經(jīng)在植物中得到廣泛的驗(yàn)證和應(yīng)用。在植物和某些細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)對(duì)草甘膦具有抗性。在植物中草甘膦的抗性可以通過(guò)表達(dá)與草甘膦具有較低親和力的EPSPS而獲得，存在草甘膦時(shí)此酶也仍然保持其催化活性。植物對(duì)草甘膦耐受或?qū)Σ莞熟⒕哂锌剐允侵赣貌莞熟⒊輨﹪娛┲参锖螅参锟梢哉ＩL(zhǎng)發(fā)育?，F(xiàn)已被確定EPSP合成酶分為兩個(gè)家族(Ming He等2001)，家族I包括來(lái)源于大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的EPSP合成酶；家族II包括來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌CP4、無(wú)色桿菌LBAA、假單胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗體與家族I的EPSP合成酶不發(fā)生交叉反應(yīng)，且兩者間的氨基酸同源性低于50%。在天然的植物EPSPS基因中，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域包含在天然的編碼序列中(例如:CTP2, Klee 等，Mol.Gen.Genet.210:47_442，1987)，CTP 在葉綠體膜上從 EPSPS 酶上裂解下來(lái)，產(chǎn)生成熟的EPSPS。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)EPSPS酶行使正常功能是必須的，在蛋白結(jié)構(gòu)及功能一致的前提下，如果去掉信號(hào)肽，雖然整個(gè)植物組織EPSPS蛋白表達(dá)量一致，但是植株確不具有草甘膦抗性，不同來(lái)源的信號(hào)肽對(duì)EPSPS蛋白在不同轉(zhuǎn)化受體中行使功能的效率存在差異(Guy della Cioppa 1988, Guy della Cioppal986)。密碼子偏愛(ài)性是一個(gè)阻礙細(xì)菌基因在植物中表達(dá)的障礙。對(duì)于一個(gè)給定氨基酸的同義密碼子，不同的物種會(huì)有不同的偏愛(ài)性。例如在苜蓿中精氨酸的密碼子CGU出現(xiàn)的概率是罕見(jiàn)密碼子CGG的50多倍。而在玉米中AGG和CGC是精氨酸常用密碼子，CGG也經(jīng)常被使用。玉米中許多常用密碼子卻在細(xì)菌中很少見(jiàn)，反之亦然。來(lái)源于細(xì)菌P.1uminescens的兩個(gè)殺蟲(chóng)蛋白基因(tcdA和tcbA)的密碼子使用頻率中可以發(fā)現(xiàn)(Patent N0.US6，590，142B1)，丙氨酸的GCG密碼子，谷氨酸的GAA密碼子，亮氨酸的CTG密碼子并沒(méi)有在這兩個(gè)細(xì)菌基因中使用。但是這些密碼子在玉米中的使用頻率大約是23%、20%和26%。所以對(duì)于來(lái)源于細(xì)菌的基因在轉(zhuǎn)入植物之前都要根據(jù)宿主植物進(jìn)行基因改造和密碼子優(yōu)化。在植物分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)需要可提供陽(yáng)性選擇標(biāo)記表型的各種基因。具體地說(shuō)，草甘膦耐受可在植物中廣泛地用作陽(yáng)性選擇標(biāo)記，并且用在農(nóng)作物生產(chǎn)中是很有價(jià)值的表型。當(dāng)使用不同的陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因時(shí)，擴(kuò)展了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因性狀與新開(kāi)發(fā)性狀的堆積和組合。標(biāo)記基因提供了不同的表型如抗生素或草甘膦耐受，或者通過(guò)DNA檢測(cè)方法可區(qū)別的分子差異。通過(guò)多重抗生素或除草劑耐受分析，或通過(guò)DNA檢測(cè)方法檢測(cè)新型DNA分子的存在，可以篩選疊加性狀的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供了抗草甘膦EPSP合酶的DNA和蛋白組合物。本發(fā)明也提供了用于植物的DNA構(gòu)建和展示草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)CP4EPSPS不同區(qū)域的活性分析及玉米基因組特點(diǎn)，我們對(duì)CP4EPSPS (SEQ IDNo:1)的密碼子及編碼框進(jìn)行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID No:2)與原始的EPSPS同源性?xún)H為88%，而G的含量由原來(lái)的31.2%變?yōu)?5.5% ;C的含量也由原來(lái)的34.6%變?yōu)?2.7%汀的含量由原來(lái)的16.4%變?yōu)?5.2%，A的含量由原來(lái)的17.8%變?yōu)?6.7%。同時(shí)我們?cè)趦?yōu)化后的EPSPS 基因5’端增加了一個(gè)來(lái)源于高粱的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID No:3)，整合了葉綠體信號(hào)肽并經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的CP4EPSPS基因我們命名為CC-M EPSPS (SEQID No:4) ο通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)CP4EPSPS基因及CC-M EPSPS基因的玉米不同轉(zhuǎn)化事件的分析，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CC-M EPSPS基因更容易獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)化事件。本發(fā)明的一方面是包含啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物，此啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中有功能，有效與優(yōu)化后的CC-M分子連接。本發(fā)明的另一方面是一個(gè)制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括提供具有CC-M基因的植物表達(dá)載體，在允許植物表達(dá)載體能被受體植物細(xì)胞攝取的條件下，將受體植物細(xì)胞與植物表達(dá)載體接觸；選擇包含植物表達(dá)載體的受體植物細(xì)胞；從選擇的受體植物細(xì)胞再生植株；鑒定耐受草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的又一方面是可育的草甘膦耐受的轉(zhuǎn)基因植物，它包含具有CC-M基因的植物表達(dá)載體，將此轉(zhuǎn)基因植物與其他植物雜交，以提供耐受草甘膦的子代植物。本發(fā)明的還一方面提供了在作物田地中雜草防除的方法，其中作物田地用有效量的含草甘膦除草劑處理，并且田間作物包含具有CC-M基因的植物表達(dá)載體。
附圖簡(jiǎn)述


圖1.CP4EPSPS基因的植物表達(dá)載體圖2.CC-M EPSPS基因的植物表達(dá)載體圖3.轉(zhuǎn)CP4EPSPS基因的玉米檢測(cè)結(jié)果圖4.轉(zhuǎn)CC-M EPSPS基因的玉米檢測(cè)結(jié)果圖5.轉(zhuǎn)CP4EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果圖6.轉(zhuǎn)CC-M EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體實(shí)施步驟參考(Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，所用術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)。實(shí)施例1、CP4EPSPS基因的密碼子優(yōu)化。根據(jù)CP4EPSPS不同區(qū)域的活性分析及玉米基因組特點(diǎn)，我們對(duì)CP4EPSPS (SEQ IDNo:1)的密碼子及編碼框進(jìn)行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID No:2)與原始的EPSPS同源性?xún)H為88%，而G的含量由原 來(lái)的31.2%變?yōu)?5.5% ;C的含量也由原來(lái)的34.6%變?yōu)?2.7%汀的含量由原來(lái)的16.4%變?yōu)?5.2%，A的含量由原來(lái)的17.8%變?yōu)?6.7%。
權(quán)利要求
1.一種耐受草甘膦除草劑的EPSPS基因，其特征是該基因的序列如SEQ ID NO:2所/Jn ο
2.含有權(quán)利I所述的EPSPS基因的植物表達(dá)載體。
3.權(quán)利要求1所述的EPSPS基因在轉(zhuǎn)化植物以使植物具備對(duì)草甘膦除草劑產(chǎn)生抗性的用途。
4.利用權(quán)利要 求1所述的EPSPS基因轉(zhuǎn)化植物時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化陽(yáng)性細(xì)胞組織的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及人工合成用于轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物的EPSPS基因，它較其密碼子優(yōu)化前更容易獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明也涉及利用該基因培育抗草甘膦植物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103074351SQ20121040617
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者賴(lài)錦盛, 趙海銘, 宋偉彬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)