本發(fā)明涉及組培技術，尤其涉及一種平滑山楂的組培方法。

背景技術：

平滑山楂(綠山楂冬王)Crataegus viridis′Winter King′山楂屬落葉小喬木，樹高4.5一6米，冠寬3.5一6米。圓形樹冠，單葉互生，卵形或倒卵形，3一5裂，葉緣具鋸齒?；ò咨?，果紅色，果可保留到第二年春季。生長慢，喜光，適宜濕潤、肥沃土壤，適應性強，易栽培，耐修剪。原產于北美東部。我國可在北至黑龍江及內蒙古南部，南至湖南、安徽、江蘇北部區(qū)域內生長。該品種以其奪目鮮紅、掛果持久的山楂果而著名，樹齡可達100年之久，花、果具觀賞價值，適合庭園栽種，既可作庭園景觀樹，又可作綠籬等。

由于利用種子進行播種繁殖存在一些局限性，嫁接繁育技術目前在我國成活率較低，因此加強其無性繁殖的研究，建立無性繁殖技術體系，提高我國綠山楂冬王苗木的生產能力，能為其廣泛應用于城市園林中提供技術保障。目前我國對于平滑山楂組培的研究尚無。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于，針對上述問題，提出一種平滑山楂的組培方法，該方法簡便高效，成本低，誘導率高，增殖系數高。

為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種平滑山楂的組培方法，包括以下步驟：

步驟一、切取平滑山楂植株個體的半木質化莖芽進行預處理，然后接種到含0.01～0.1mg/L細胞分裂素、0.01～0.1mg/L生長素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L瓊脂的誘導培養(yǎng)基上，在溫度為20～30℃、濕度為40％～80％、光照強度為20～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～24h、20～30天獲得無菌芽苗；

步驟二、將獲得的無菌芽苗切割成1.5～5.0cm的帶頂芽的莖段，接種到含0.1～1mg/L細胞分裂素、0.01～0.1mg/L生長素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為20～30℃、濕度為40％～80％、光照強度為20～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～24h、每10～30天更換新鮮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)1～3個月，獲得叢生芽苗；

步驟三、挑選健壯的叢生芽苗，以單個芽苗為單位進行切離，將切離后的單個芽苗切割成長度為2.0～3.0cm的帶頂芽的莖段，然后將莖段接種到含有0.1～0.5mg/L生長素(兩種生長素，濃度均為0.1-0.5mg/L)、20～40g/L蔗糖和5～7g/L瓊脂的生根培養(yǎng)基上，在溫度為20～30℃、濕度為40％～80％、光照強度為20～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～24h條件下培養(yǎng)10～30天，獲得再生植株；

步驟四、將株高達4cm、根系發(fā)達、葉片展開的再生植株在培養(yǎng)室內敞口煉苗3d，然后洗凈根系附著的培養(yǎng)基，再移植到栽培基質中并澆透水，在溫度為20～30℃、濕度為60％～80％、光照強度為40～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～18h的條件下用塑料薄膜覆蓋容器口培養(yǎng)至長出的新葉完全展開后，去掉覆蓋的塑料薄膜，獲得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。

進一步地，步驟一所述預處理包括以下步驟：(大連地區(qū))5-6月份，晴天上午，選生長健壯、樹形優(yōu)美、無病蟲害的優(yōu)良母本，采集一年生枝條，剪成長1.5-2.5cm的帶腋芽莖段，用中性洗滌劑漂洗后，流水沖洗2h以上，后置于工作臺備用；在超凈工作臺上，先用70％乙醇處理10-30s，后用0.1％升汞處理1-5min，然后用無菌水漂洗5次。

進一步地，步驟一、切取平滑山楂植株個體的半木質化莖芽進行預處理，然后接種到含0.01-0.04mg/L細胞分裂素、0.02-0.05mg/L生長素、25～35g/L蔗糖和5～7g/L瓊脂的誘導培養(yǎng)基上，在溫度為20～25℃、濕度為50％～80％、光照強度為50～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～24h、20～30天獲得無菌芽苗。

進一步地，其中步驟一中誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、DKW培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基或QL培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為芐基腺嘌呤、玉米素、激動素或氯吡苯脲，生長素為萘乙酸或吲哚丁酸。

進一步地，步驟二、將獲得的無菌芽苗切割成1.5～5.0cm的帶頂芽的莖段，接種到含0.8-1.0mg/L細胞分裂素、0.02～0.05mg/L生長素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為20～30℃、濕度為60％～80％、光照強度為40～80μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～20h、每10～30天更換新鮮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)1～3個月，獲得叢生芽苗。

進一步地，步驟二中增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、DKW培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基或QL培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為芐基腺嘌呤、玉米素、激動素或氯吡苯脲，生長素為萘乙酸和/或吲哚丁酸。

進一步地，步驟三、挑選健壯的叢生芽苗，以單個芽苗為單位進行切離，將切離后的單個芽苗切割成長度為2.0～3.0cm的帶頂芽的莖段，然后將莖段接種到含有0.3-0.5mg/L(兩種生長素、濃度均為0.3-0.5mg/L)生長素、20～35g/L蔗糖和5～7g/L瓊脂的生根培養(yǎng)基上，在溫度為20～30℃、濕度為40％～60％、光照強度為50～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～20h條件下培養(yǎng)10～30天，獲得再生植株。

進一步地，步驟三中生根培養(yǎng)基為生長素為1/2MS培養(yǎng)基或1/3MS培養(yǎng)基，pH值為5～6，生長素為吲哚乙酸和/或吲哚丁酸。

進一步地，步驟四、將株高達4cm、根系發(fā)達、葉片展開的再生植株在培養(yǎng)室內敞口煉苗3d，然后洗凈根系附著的培養(yǎng)基，再移植到栽培基質中并澆透水，在溫度為20～30℃、濕度為70％～80％、光照強度為60～100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12～15h的條件下用塑料薄膜覆蓋容器口培養(yǎng)至長出的新葉完全展開后，去掉覆蓋的塑料薄膜，獲得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。

進一步地，步驟四中所述栽培基質包含體積比如下的各組分：草炭土3份，珍珠巖1-3份。優(yōu)選為草炭土3份，珍珠巖2份。

本發(fā)明平滑山楂的組培方法步驟科學、合理，與現有技術相比較具有以下優(yōu)點：

1、預處理簡便，污染率低，無菌材料的保存率高，可達80％。

2、初代培養(yǎng)基的誘導率高，可達80％以上。

3、增殖培養(yǎng)基的增殖速度快、苗生長整齊一致、增殖系數高，可達7.0

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明進一步說明：

實施例1

本實施例公開了一種平滑山楂的組培方法，包括以下步驟：

步驟一、切取平滑山楂植株個體的半木質化莖芽進行預處理，然后接種到含0.05mg/L細胞分裂素、0.05mg/L生長素、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂的誘導培養(yǎng)基上，在溫度為25℃、濕度為60％、光照強度為70μmol·m^-2·s^-1、每天光照20h、20～30天獲得無菌芽苗；

步驟二、將獲得的無菌芽苗切割成1.5～5.0cm的帶頂芽的莖段，接種到含0.05mg/L細胞分裂素、0.05mg/L生長素、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為30℃、濕度為60％、光照強度為60μmol·m^-2·s^-1、每天光照20h、每20天更換新鮮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)2個月，獲得叢生芽苗；

步驟三、挑選健壯的叢生芽苗，以單個芽苗為單位進行切離，將切離后的單個芽苗切割成長度為2.0～3.0cm的帶頂芽的莖段，然后將莖段接種到含有0.3mg/L生長素、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂的生根培養(yǎng)基上，在溫度為20～30℃、濕度為60％、光照強度為60μmol·m^-2·s^-1、每天光照19h條件下培養(yǎng)20天，獲得再生植株；

步驟四、將株高達4cm、根系發(fā)達、葉片展開的再生植株在培養(yǎng)室內敞口煉苗3d，然后洗凈根系附著的培養(yǎng)基，再移植到栽培基質中并澆透水，在溫度為25℃、濕度為70％、光照強度為70μmol·m^-2·s^-1、每天光照15h的條件下用塑料薄膜覆蓋容器口培養(yǎng)至長出的新葉完全展開后，去掉覆蓋的塑料薄膜，獲得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。

上述預處理以大連地區(qū)為例，包括以下步驟：5-6月份，晴天上午，選生長健壯、樹形優(yōu)美、無病蟲害的優(yōu)良母本，采集一年生枝條，剪成長1.5-2.5cm的帶腋芽莖段，用中性洗滌劑漂洗后，流水沖洗2h以上，后置于工作臺備用；在超凈工作臺上，先用70％乙醇處理20s，后用0.1％升汞處理3min，然后用無菌水漂洗5次。

其中步驟一中誘導培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為芐基腺嘌呤，生長素為萘乙酸；步驟二中增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為芐基腺嘌呤，生長素為萘乙酸；步驟三中生根培養(yǎng)基為生長素為MS培養(yǎng)基，pH值為5～6，生長素為吲哚乙酸和吲哚丁酸；步驟四中栽培基質按體積份數比為3份的草炭土、2份的珍珠巖。

實施例2

本實施例公開了一種平滑山楂的組培方法，包括以下步驟：

步驟一、切取平滑山楂植株個體的半木質化莖芽進行預處理，然后接種到含0.01mg/L細胞分裂素、0.1mg/L生長素、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的誘導培養(yǎng)基上，在溫度為20℃、濕度為40％％、光照強度為100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12h、30天獲得無菌芽苗；

步驟二、將獲得的無菌芽苗切割成1.5～5.0cm的帶頂芽的莖段，接種到含0.1mg/L細胞分裂素、0.1mg/L生長素、40g/L蔗糖和5g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為30℃、濕度為80％、光照強度為100μmol·m^-2·s^-1、每天光照24h、每30天更換新鮮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)3個月，獲得叢生芽苗；

步驟三、挑選健壯的叢生芽苗，以單個芽苗為單位進行切離，將切離后的單個芽苗切割成長度為2.0～3.0cm的帶頂芽的莖段，然后將莖段接種到含有0.5mg/L生長素、40g/L蔗糖和7g/L瓊脂的生根培養(yǎng)基上，在溫度為20℃、濕度為40％％、光照強度為100μmol·m^-2·s^-1、每天光照12h條件下培養(yǎng)10天，獲得再生植株；

步驟四、將株高達4cm、根系發(fā)達、葉片展開的再生植株在培養(yǎng)室內敞口煉苗3d，然后洗凈根系附著的培養(yǎng)基，再移植到栽培基質中并澆透水，在溫度為30℃、濕度為80％、光照強度為40μmol·m^-2·s^-1、每天光照12h的條件下用塑料薄膜覆蓋容器口培養(yǎng)至長出的新葉完全展開后，去掉覆蓋的塑料薄膜，獲得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。

上述預處理以大連地區(qū)為例，包括以下步驟：5-6月份，晴天上午，選生長健壯、樹形優(yōu)美、無病蟲害的優(yōu)良母本，采集一年生枝條，剪成長1.5-2.5cm的帶腋芽莖段，用中性洗滌劑漂洗后，流水沖洗2h以上，后置于工作臺備用；在超凈工作臺上，先用70％乙醇處理30s，后用0.1％升汞處理5min，然后用無菌水漂洗5次。

其中步驟一中誘導培養(yǎng)基為DKW培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為氯吡苯脲，生長素為吲哚丁酸；步驟二中增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為芐基腺嘌呤，生長素為吲哚丁酸；步驟三中生根培養(yǎng)基為生長素為WPM培養(yǎng)基，pH值為5～6，生長素為吲哚乙酸和吲哚丁酸；步驟四中栽培基質按體積份數比為3份的草炭土、2份的珍珠巖。

實施例3

本實施例公開了一種平滑山楂的組培方法，包括以下步驟：

步驟一、切取平滑山楂植株個體的半木質化莖芽進行預處理，然后接種到含0.07mg/L細胞分裂素、0.03mg/L生長素、25g/L蔗糖和5g/L瓊脂的誘導培養(yǎng)基上，在溫度為20℃、濕度為70％、光照強度為50μmol·m^-2·s^-1、每天光照18h、30天獲得無菌芽苗；

步驟二、將獲得的無菌芽苗切割成1.5～5.0cm的帶頂芽的莖段，接種到含0.8mg/L細胞分裂素、0.09mg/L生長素、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上，在溫度為20℃、濕度為80％、光照強度為100μmol·m^-2·s^-1、每天光照24h、每30天更換新鮮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)2個月，獲得叢生芽苗；

步驟三、挑選健壯的叢生芽苗，以單個芽苗為單位進行切離，將切離后的單個芽苗切割成長度為2.0～3.0cm的帶頂芽的莖段，然后將莖段接種到含有0.5mg/L生長素、20g/L蔗糖和5g/L瓊脂的生根培養(yǎng)基上，在溫度為30℃、濕度為40％、光照強度為80μmol·m^-2·s^-1、每天光照24h條件下培養(yǎng)30天，獲得再生植株；

步驟四、將株高達4cm、根系發(fā)達、葉片展開的再生植株在培養(yǎng)室內敞口煉苗3d，然后洗凈根系附著的培養(yǎng)基，再移植到栽培基質中并澆透水，在溫度為30℃、濕度為60％、光照強度為60μmol·m^-2·s^-1、每天光照18h的條件下用塑料薄膜覆蓋容器口培養(yǎng)至長出的新葉完全展開后，去掉覆蓋的塑料薄膜，獲得平滑山楂苗木，即完成平滑山楂的微繁方法。

上述預處理以大連地區(qū)為例，包括以下步驟：5-6月份，晴天上午，選生長健壯、樹形優(yōu)美、無病蟲害的優(yōu)良母本，采集一年生枝條，剪成長1.5-2.5cm的帶腋芽莖段，用中性洗滌劑漂洗后，流水沖洗2h以上，后置于工作臺備用；在超凈工作臺上，先用70％乙醇處理10s，后用0.1％升汞處理3min，然后用無菌水漂洗5次。

其中步驟一中誘導培養(yǎng)基為DKW培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為激動素，生長素為吲哚丁酸；步驟二中增殖培養(yǎng)基為DKW培養(yǎng)基，pH值為5～6，細胞分裂素為氯吡苯脲，生長素為萘乙酸；步驟三中生根培養(yǎng)基為生長素為DKW培養(yǎng)基，pH值為5～6，生長素為吲哚乙酸和吲哚丁酸；步驟四中栽培基質按體積份數比為3份的草炭土、2份的珍珠巖。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。