本發(fā)明屬于茄子抗逆性鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，涉及到篩選茄子耐冷性的方法和耐冷性評價體系，具體是一種茄子耐冷性快速鑒定的方法。

背景技術(shù)：

茄子(Solanum melongena L.)是世界十大蔬菜作物之一，在世界大多數(shù)地區(qū)都有栽培，尤其以亞洲、歐洲、非洲、北美洲等地區(qū)種植廣泛。中國是世界上最大的茄子生產(chǎn)國，也是茄子的次生起源中心，其栽培面積約占世界的50％。2013年，我國茄子的種植面積為80.1萬公頃，總產(chǎn)量達(dá)到2845.58萬噸。茄子營養(yǎng)價值高，維生素和礦物質(zhì)豐富，特別是維生素E、P以及鐵元素的含量較高。此外，茄子含有多種生物堿，具有廣泛的藥用價值。

隨著茄子早春栽培面積的增加，生產(chǎn)上要求茄子幼苗具有極強的抗寒性，秋延后栽培也需要抗寒性強的種質(zhì)，生產(chǎn)上急需耐冷品種。目前，國內(nèi)關(guān)于茄子品種或材料耐冷性鑒定的研究多集中在生理指標(biāo)測定方面，而對于快速鑒定指標(biāo)與方法的研究鮮有報道。因此，開展茄子品種資源耐冷性快速鑒定研究，對大量品種資源的篩選及茄子的耐冷育種具有重要意義。所以，本發(fā)明針對茄子材料的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)進行茄子品種耐冷性鑒定，以探索茄子的耐冷性鑒定的快速方法，為茄子耐冷育種提供參考。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、快捷、準(zhǔn)確的茄子耐冷性鑒定方法，該法可真實有效地鑒定茄子資源的耐冷性，有利于加速茄子耐冷育種。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：測定低溫條件下的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，對其做綜合隸屬函數(shù)值分析，同時活力指數(shù)、下胚軸伸長速率和茄子葉MDA含量可進行分析驗證。

低溫條件下的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和下胚軸伸長速率分別是置于18℃人工氣候箱中，對照組置于25℃人工氣候箱中，在黑暗中發(fā)芽。茄子葉MDA含量測定將3片真葉茄子分別進行5℃低溫和22～25℃室溫處理。

本發(fā)明涉及一種茄子耐冷性快速鑒定的方法，包括以下步驟：

步驟一：溫湯浸種后對種子進行18℃低溫和25℃常溫發(fā)芽處理；

步驟二：測定18℃和25℃發(fā)芽處理條件下各品種種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)；

步驟三：單一指標(biāo)與綜合指標(biāo)的鑒定

通過步驟二測定的各品種茄子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)來計算相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)，

相對發(fā)芽率＝18℃發(fā)芽率/25℃發(fā)芽率

相對發(fā)芽勢＝18℃發(fā)芽勢/25℃發(fā)芽勢

相對發(fā)芽指數(shù)＝18℃發(fā)芽指數(shù)/25℃發(fā)芽指數(shù)

并用公式(1)分別計算各品種的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)三者的耐冷隸屬函數(shù)值X_ij，每個品種的3種耐冷隸屬函數(shù)值累加可得該品種的綜合隸屬函數(shù)數(shù)值，利用綜合隸屬函數(shù)值比較不同茄子品種之間的耐冷性，若綜合隸屬函數(shù)值越高，則表明茄子耐冷性越強；所述耐冷隸屬函數(shù)值X_ij用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)值方法，計算公式為：

公式:

表示第i種的第j指標(biāo)的耐冷隸屬函數(shù)值，X_ij表示第i種的第j指標(biāo)的數(shù)值，X_jmax表示j指標(biāo)的最大數(shù)值，X_jmin表示j指標(biāo)的最小數(shù)值。所述的指標(biāo)是指相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)等。

步驟一中，具體操作如下：茄子種子采用常規(guī)55℃溫湯浸種，再用1％次氯酸鈉消毒5min，最后沖洗潔凈。用沙布包好，將其放在30℃左右的溫水中浸泡8h，浸泡結(jié)束后再洗凈置于空氣中4h，注意與空氣充分接觸。準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿，在其中放好兩層濾紙。將每個培養(yǎng)皿中加入少量的水，把茄子種子均勻地放入，再將培養(yǎng)皿蓋上蓋，分別置于18℃、25℃人工氣候箱中，使其在黑暗中發(fā)芽。

步驟二中，觀察供試材料的發(fā)芽情況，每日記錄發(fā)芽數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)芽材料的胚根、胚軸長度。采用的標(biāo)準(zhǔn)是胚根的長度超過種子長度的一半，即胚根伸長約為0.5mm。對照溫度設(shè)為25℃，在實驗進行的第10天對發(fā)芽勢進行統(tǒng)計，第18天對發(fā)芽率進行統(tǒng)計。并計算出相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)。計算公式分別為：

發(fā)芽勢(％)＝10d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100％

發(fā)芽率(％)＝發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100％

發(fā)芽指數(shù)(GI)＝∑Gt/Dt式中:Gt為浸種后t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

相對發(fā)芽率＝18℃發(fā)芽率/25℃發(fā)芽率

相對發(fā)芽勢＝18℃發(fā)芽勢/25℃發(fā)芽勢

相對發(fā)芽指數(shù)＝18℃發(fā)芽指數(shù)/25℃發(fā)芽指數(shù)

步驟三中，利用綜合隸屬函數(shù)值可以比較茄子材料的耐冷性。通過利用公式計算相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)的隸屬函數(shù)值，可以對茄子耐冷性進行量化分析。利用隸屬函數(shù)值公式并對單一隸屬函數(shù)值進行累加計算綜合隸屬函數(shù)值，數(shù)學(xué)公式綜合隸屬函數(shù)值可以定量比較茄子的耐冷性，更具有說服力。

對本發(fā)明的結(jié)果可進行活力指數(shù)、下胚軸伸長速率和茄子葉MDA含量的耐冷性分析驗證：

當(dāng)茄子幼苗長出3片真葉時，拔除長勢較弱的植株，進行低溫處理，分別進行5℃低溫和22～25℃室溫處理，待茄子幼苗長至4葉1心的時候，利用硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)法進行MDA提取與測定。

將4葉1心的茄子幼苗移到室內(nèi)，把各植株的第2、3、4葉剪下來，注意從上往下剪，剪好后分別用自來水、蒸餾水沖洗干凈后放入30℃的人工氣候箱中，曬干幼苗表面的水分。剪取葉片，稱取1g，加入2ml10％的TCA和少量石英砂，混合研磨至勻漿后再加入8mlTCA繼續(xù)研磨，勻漿后放于離心機內(nèi)，以4000r·min^-1的速度離心10min，量取上清液2ml后加樣品提取液(對照試驗中加2ml的蒸餾水)，再加入2ml 0.6％TBA溶液，混合均勻后放在沸水浴上加熱，加熱15min，待其迅速冷卻后進行新一次的離心，最后吸取上清液分別測定532、600和450nm波長下的吸光度。

針對茄子育種材料耐冷性鑒定存在的局限性，發(fā)明人建立了一種茄子耐冷性快速鑒定的方法，測定低溫條件下的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，并通過其綜合隸屬函數(shù)值進行種子耐冷性的快速鑒定。該法通過精確的數(shù)字手段處理模糊的函數(shù)值，并作出科學(xué)、合理和準(zhǔn)確的量化評價。同時，通過活力指數(shù)、下胚軸伸長速率和MDA含量來提高耐冷性鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。因而應(yīng)用本發(fā)明可通過低溫發(fā)芽綜合隸屬函數(shù)值簡單、快捷、準(zhǔn)確的鑒定茄子耐冷性。

附圖說明

圖1是發(fā)芽的平均隸屬函數(shù)值。

圖2是下胚軸伸長速率比值。

圖3是對照組和低溫處理組茄子葉MDA含量。

圖4是MDA含量增加率。

具體實施方式

下面結(jié)合具體方案實施例，進一步闡述本發(fā)明的步驟與快速鑒定方法。

實施例

1.供試材料

供試茄子材料由揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院提供，試驗選取5個品種：黑馬墨茄、蘇州牛角茄、二苠茄、洛陽早青茄、安陽紫冠茄。并設(shè)置多個重復(fù)。

2.試驗方法

(1)測定發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)，活力指數(shù)與下胚軸伸長速率

采用55℃溫湯浸種，再用1％次氯酸鈉消毒5min，最后沖洗潔凈。用沙布包好，將其放在30℃左右的溫水中浸泡8h，浸泡結(jié)束后再洗凈置于空氣中4h，注意與空氣充分接觸。準(zhǔn)備好培養(yǎng)皿，在其中放好兩層濾紙。將培養(yǎng)皿中加入少量的水，把茄子種子均勻地放入，再將培養(yǎng)皿蓋上蓋，分別置于18℃、25℃人工氣候箱中，使其在黑暗中發(fā)芽。在實驗進行的第10天對發(fā)芽勢進行統(tǒng)計，第18天對發(fā)芽率進行統(tǒng)計。其中計算公式分別為：

發(fā)芽勢(％)＝10d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100％

發(fā)芽率(％)＝發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100％

發(fā)芽指數(shù)(GI)＝∑Gt/Dt式中:Gt為浸種后t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

活力指數(shù)(GRI)＝發(fā)芽率×胚根長度

胚軸伸長速率(PAR)＝胚軸長度/天數(shù)

(2)MDA含量的測定

將4葉1心的茄子幼苗的第2、3、4葉剪下來，注意從上往下剪，剪好后分別用自來水、蒸餾水沖洗干凈后放入30℃的人工氣候箱中，曬干幼苗表面的水分。剪取葉片，稱取1g，加入2ml10％的TCA和少量石英砂，混合研磨至勻漿后再加入8mlTCA繼續(xù)研磨，勻漿后放于離心機內(nèi)，以4000r·min^-1的速度離心10min，量取上清液2ml后加樣品提取液(對照試驗中加2ml的蒸餾水)，再加入2ml 0.6％TBA溶液，混合均勻后放在沸水浴上加熱，加熱15min，待其迅速冷卻后進行新一次的離心，最后吸取上清液分別測定532、600和450nm波長下的吸光度。計算公式為：

丙二醛濃度＝6.45*(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56*OD₄₅₀

丙二醛質(zhì)量＝丙二醛濃度*3/樣品鮮重(g)

3.試驗結(jié)果

(1)綜合隸屬函數(shù)值分析

18℃和25℃兩種溫度下的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在茄子品種間表現(xiàn)出很大的差異，同一品種不同溫度間也是如此，說明18℃是一個適合區(qū)分茄子不同品種抗寒性的適宜溫度，利用這個溫度下測量的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)可以代表該品種茄子抗寒性的大小。同時，這兩種溫度下，茄子發(fā)芽率沒有表現(xiàn)出很大差異，說明對于茄子來說，在這兩種溫度條件下都能正常生長，是茄子種子發(fā)芽的有效溫度，18℃是適合耐冷性鑒定的發(fā)芽溫度。

總體來看，發(fā)芽指數(shù)比發(fā)芽勢下降的幅度較大，說明可將茄子發(fā)芽指數(shù)作為其耐冷指標(biāo)。不同茄子品種的發(fā)芽指數(shù)與對照相比，降低的幅度越大，說明低溫處理對其影響也越大，也就是該種茄子的耐低溫性越弱。

相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢在比較不同品種的發(fā)芽情況的時候更準(zhǔn)確，所以利用18℃和25℃下相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽勢構(gòu)建一個綜合活力指標(biāo)，三者隸屬函數(shù)平均值代表種子活力及其生活力大小。從圖1可以得出不同茄子之間的綜合隸屬函數(shù)值存在明顯差異，在低溫條件下，這個值可以較準(zhǔn)確的反映茄子種子發(fā)芽的速率和幼苗的長勢，以此來鑒定供試茄子品種的耐冷性強弱。平均隸屬函數(shù)值越大，表明低溫脅迫后該茄子品種的脅迫變化較小，即耐冷性更強，反之亦然。由表1可知5種茄子的綜合隸屬函數(shù)值，圖1客觀顯示出5種茄子材料耐冷性的大小順序為：洛陽早青茄、二苠茄、安陽紫冠茄、黑馬墨茄、蘇州牛角茄。

表1茄子種子發(fā)芽參數(shù)及其相對值隸屬函數(shù)值

Table1 Germination indexes and relative integrate subjection value of eggplant

(2)活力指數(shù)、下胚軸伸長速率分析

由表2可知，在25℃條件下，5種茄子品種間的活力指數(shù)差異不明顯，與茄子的耐冷性相關(guān)不顯著；18℃條件下，品種間種子活力指數(shù)的差異較明顯，但耐冷性強的品種下降幅度小于耐冷性弱的品種。同時，幼苗下胚軸伸長速率的比值越大的品種，表明該茄子品種幼苗耐低溫能力越強。因此，利用圖2顯示茄子在25℃和18℃下的下胚軸伸長速率比值，通過比值可以相對表明茄子耐冷性強弱，由圖2可知耐冷性由強到弱的的順序是：洛陽早青茄，二苠茄，安陽紫冠，黑馬墨茄，蘇州牛角。與綜合隸屬函數(shù)值的分析相一致。

表2不同溫度處理下茄子種子活力指數(shù)及下胚軸伸長的比值

Table2 Relative vigor indexes and the rates of hypocotyls of eggplant under different temperature

(3)MDA含量與耐冷性分析

植物細(xì)胞膜的破壞是因為植物體內(nèi)發(fā)生了脂質(zhì)過氧化作用，當(dāng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用時，其細(xì)胞中產(chǎn)生的超氧物自由基誘導(dǎo)膜質(zhì)中的不飽和脂肪酸，從而造成細(xì)胞膜受損傷。丙二醛(MDA)正是膜脂過氧化過程中的分解產(chǎn)物，葉片中MDA的含量可用來表示細(xì)胞膜損傷程度的大小。對表3中的數(shù)據(jù)進行作圖與計算，可以從圖3和圖4中客觀反應(yīng)茄子在18℃和25℃下的MDA含量情況，從圖3、4可知，在低溫脅迫下，茄子葉片MDA含量明顯增加，增加5.73％至182.84％。而且品種間的差異顯著。洛陽早青茄較小，耐冷性較強。

表3低溫處理對茄子葉片中MDA含量的影響

Table3 Effect of low temperature stress on MDA contents in leaves of eggplant

綜上所述，本發(fā)明建立的一種茄子耐冷性快速鑒定的方法，耐冷性隸屬函數(shù)值是用幾個指標(biāo)綜合評定植物的耐冷性，可以彌補使用單個指標(biāo)鑒定的局限性，而且相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢在比較不同品種的發(fā)芽情況的時候更準(zhǔn)確，活力指數(shù)和MDA含量也驗證了綜合隸屬函數(shù)值的準(zhǔn)確性，所以它的評價更為確切，方案實施過程中操作簡單易行，所以說綜合隸屬函數(shù)值是最簡單、快捷、準(zhǔn)確的鑒定抗冷性的方法和指標(biāo)。

以上就是對本發(fā)明具體實施例的詳細(xì)描述，上述評價結(jié)果與供試材料實際觀察相一致，可見，本發(fā)明適用于茄子耐冷性快速鑒定的方法。