本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，涉及一種抗根腫病的甘藍(lán)-大白菜遠(yuǎn)緣雜種的創(chuàng)制方法。

背景技術(shù)：

根腫病是由根腫菌屬蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的、危害十字花科作物的一種傳染性非常強(qiáng)的土壤病害，結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea L.Var.Capitata,，2n＝2x＝CC＝18，簡稱甘藍(lán))是受其危害嚴(yán)重的寄主之一；目前生產(chǎn)上非常缺乏抗根腫病甘藍(lán)品種。甘藍(lán)對(duì)根腫病抗性屬于數(shù)量性狀遺傳，由多基因控制，易受環(huán)境影響；而且主要是隱性基因，這就使得利用常規(guī)育種方法改良甘藍(lán)根腫病抗性存在困難并且進(jìn)展緩慢。國內(nèi)外對(duì)大白菜抗根腫病的研究表明，大白菜對(duì)根腫病菌的侵染大多表現(xiàn)受顯性單基因控制。其中位于A3連鎖群的CRb基因?qū)Ω[菌生理小種2、4和8表現(xiàn)抗性，是一個(gè)優(yōu)良的抗性基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)目前甘藍(lán)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗根腫病資源缺乏這一現(xiàn)狀，提供一套利用胚胎拯救獲得甘藍(lán)-大白菜遠(yuǎn)緣雜種的方法，創(chuàng)造一批抗根腫病的甘藍(lán)-大白菜遠(yuǎn)緣雜種；同時(shí)為擴(kuò)大甘藍(lán)基因庫，引進(jìn)近緣種中優(yōu)異的目標(biāo)性狀(基因)，形成一套甘藍(lán)品種改良的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種抗根腫病的甘藍(lán)-大白菜遠(yuǎn)緣雜種的創(chuàng)制方法，包括以下步驟：

(1)授粉方法：以抗根腫病大白菜為母本，甘藍(lán)為父本，配置雜交組合,采用人工剝蕾去雄重復(fù)授粉的方法，取父本新鮮花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱頭上；

(2)胚珠培養(yǎng)：取授粉后10d的子房消毒滅菌，剝?nèi)∽臃恐械呐咧榻臃N到胚挽救培養(yǎng)基上,在環(huán)境25±0.5℃，光照強(qiáng)度50-100μmol·m^–2·s^–1，光照時(shí)長12-14h·d^–1條件下培養(yǎng)25～30d，所述的胚挽救培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(3)分化培養(yǎng)：待幼胚長至子葉形胚時(shí)，接入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽分化，所述的分化培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(4)繼代培養(yǎng)：20～30d后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(5)生根培養(yǎng)：繼代2周后接入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.90～5.95；

(6)人工加倍：將修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中進(jìn)行加倍，所述的處理?xiàng)l件為含2％二甲基亞砜濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理18-20h，處理完畢后，將根部的秋水仙素殘液沖洗干凈，最后定植于含有草炭土、珍珠巖和蛭石的穴盤中；

(7)形態(tài)學(xué)鑒定：對(duì)幼苗營養(yǎng)生長階段、生殖生長階段的主要形態(tài)特征進(jìn)行觀察；

(8)細(xì)胞DNA相對(duì)含量測(cè)定：用流式細(xì)胞儀對(duì)后代加倍植株進(jìn)行細(xì)胞DNA相對(duì)含量測(cè)定；

(9)根腫病抗性鑒定：通過菌土法接種鑒定和抗根腫病基因CRb的分子標(biāo)記驗(yàn)證相結(jié)合鑒定根腫病抗性，將基質(zhì)滅菌后，每克滅菌土中接種0.001g病根，然后直接將鑒定材料播于菌土中，于25-28℃下培養(yǎng)，2個(gè)月后拔出幼苗，洗凈根部雜質(zhì)，觀察發(fā)病情況；同時(shí)，利用與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13對(duì)后代植株進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，當(dāng)后代材料的擴(kuò)增譜帶中出現(xiàn)抗根腫病大白菜所具有的特異條帶時(shí)，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

其中，步驟(1)中所述的雜交組合的配置為：抗根腫病大白菜為母本，甘藍(lán)為父本。其中母本為引進(jìn)的1份對(duì)根腫病表現(xiàn)免疫、攜帶CRb基因的大白菜材料。

步驟(2)中子房消毒滅菌方法為：用75％(體積分?jǐn)?shù))的乙醇消毒1min，然后用7％(體積分?jǐn)?shù))的次氯酸鈉滅菌15min，再用用無菌水沖洗3次，每次5min。

步驟(6)中秋水仙素溶液進(jìn)行加倍處理時(shí)一定要沒過根部。

步驟(6)中草炭土、珍珠巖和蛭石的體積比為8:1:1。

步驟(9)中所述的與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13上游引物序列為TGTTGATTGTGGATTTTTGTGA(SEQ ID NO.1)，下游引物序列為CCAAACTAGCCAATAACCATTGTA(SEQ ID NO.2)。

步驟(9)中當(dāng)后代材料的擴(kuò)增譜帶中出現(xiàn)抗根腫病大白菜所具有的313bp特異條帶時(shí)，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

有益效果

本發(fā)明利用抗根腫病大白菜和甘藍(lán)為材料，采用幼胚拯救技術(shù)進(jìn)行甘藍(lán)抗性改良，促進(jìn)大白菜與甘藍(lán)之間的遺傳雜交，合并兩個(gè)種的優(yōu)異基因，獲得了一批優(yōu)異的種間新種質(zhì)，為進(jìn)一步漸滲轉(zhuǎn)移利用抗根腫病基因、改良甘藍(lán)品種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的一種大白菜與甘藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交新種質(zhì)創(chuàng)制方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

(1)本發(fā)明利用的是攜帶CRb基因的大白菜抗源，經(jīng)鑒定其對(duì)根腫病抗性達(dá)免疫水平，是一個(gè)非常理想的抗源材料。

(2)本發(fā)明在胚挽救的MS培養(yǎng)基添加了0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白，提高了胚胎拯救率和誘導(dǎo)率。

(3)本發(fā)明在人工加倍中使用的處理是含2％二甲基亞砜(DMSO)濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理18h，提高了種間雜種的加倍率。

附圖說明

圖1遠(yuǎn)緣雜種F₁形態(tài)學(xué)鑒定。

(a)甘藍(lán)(左)、雜種F₁(中)、大白菜(右)營養(yǎng)生長期表型；(b)甘藍(lán)(左)、雜種F₁(中)、大白菜(右)生殖生長期表型；(c)甘藍(lán)(左)、雜種F₁(中)、大白菜(右)種子表型；

圖2引物TCR13對(duì)遠(yuǎn)緣雜種F₁鑒定的擴(kuò)增結(jié)果

1-4為母本大白菜，5-10和13-17攜帶CRb基因的真雜種，11-12為假雜種，18-19為父本甘藍(lán)。箭頭所示為與CRb基因連鎖的抗病帶型

具體實(shí)施方案

本發(fā)明所提供的一種抗根腫病的甘藍(lán)-大白菜遠(yuǎn)緣雜種的創(chuàng)制方法，通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不局限于此：

1.甘藍(lán)-大白菜種間雜交后代材料的獲得

1.1材料選擇

甘藍(lán)為不同基因型的二倍體高代純合材料，大白菜為抗根腫病的二倍體材料。

1.2幼胚拯救及雜種獲得

(1)授粉方法：于塑料大棚內(nèi)進(jìn)行雜交，甘藍(lán)和大白菜互為父母本進(jìn)行雜交，在母本開花前1～2d剝蕾去雄,授以父本的花粉,套袋隔離。次日開始采用重復(fù)授粉法進(jìn)行人工授粉(每天授粉一次，重復(fù)三次)。結(jié)果表明，以大白菜為母本的幼胚拯救率高于以甘藍(lán)為母本。

(2)幼胚拯救：取授粉后7d、10d、12d的子房,用75％(體積分?jǐn)?shù))的乙醇消毒1min，然后用7％(體積分?jǐn)?shù))的次氯酸鈉滅菌15min，再用用無菌水沖洗3次，每次5min。剝?nèi)∽臃恐械呐咧榻臃N到胚挽救培養(yǎng)基上在環(huán)境溫度25±0.5℃，光照強(qiáng)度75μmol·m^–2·s^–1，光照時(shí)長14h的條件下培養(yǎng)28d。所述的胚挽救培養(yǎng)基處理為：0(CK，MS+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95)、添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA、添加0.6g/L水解酪蛋白、添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白。結(jié)果表明,授粉后10d的子房，在MS培養(yǎng)基中添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白,pH為5.95時(shí)獲得了最高的誘導(dǎo)率。

(3)分化培養(yǎng)：待幼胚長至子葉形胚時(shí)，接入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽分化，所述的分化培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.95。

(4)繼代培養(yǎng)：25d后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95。

(5)生根培養(yǎng)：繼代2周后接入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.95。

(6)利用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍

先將待處理的植株從生根培養(yǎng)基中取出，于自來水管下將根部沖洗干凈，用剪子將根剪至1～2cm長，然后將修剪好的植株根部浸泡在配制的含2％二甲基亞砜(DMSO)濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理(秋水仙素溶液一定要沒過根部)。每個(gè)處理4～5棵植株。處理時(shí)間為12h、18h、24h、30h。將處理的植株置于25℃、通風(fēng)、光照條件下。結(jié)果表明，當(dāng)處理時(shí)間為18h的時(shí)候，植株加倍率最高。處理完畢后，將植株從秋水仙素溶液中取走，于自來水管下將根部的秋水仙素的殘液沖洗干凈。最后定植于含有草炭土、珍珠巖和蛭石(8:1:1)的穴盤中。當(dāng)植株長到4～5片葉后移栽到大田。

2.種間雙二倍體雜種的鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定從F₁出苗至開花、結(jié)籽，對(duì)其主要形態(tài)特征進(jìn)行觀察并拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：F₁營養(yǎng)生長階段的生長形態(tài)為生長勢(shì)大于雙親，綜合性狀介于雙親之間；抽薹始期與大白菜相近，種株整個(gè)生長形態(tài)介于雙親之間，生長勢(shì)大于雙親。自交授粉后收獲的種子獲得的種子黑褐色，比雙親的種子大，整體性狀具有超親優(yōu)勢(shì)。

(2)DNA相對(duì)含量的分析：用流式細(xì)胞儀對(duì)雙親和經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為遠(yuǎn)緣雜交種的F₁的葉片細(xì)胞DNA相對(duì)含量進(jìn)行了定和比較。結(jié)果表明，雙親大白菜、甘藍(lán)二倍體植株的細(xì)胞DNA高峰值均出現(xiàn)在橫坐標(biāo)200的相對(duì)位置上，而獲得的后代植株的細(xì)胞DNA高峰值則均出現(xiàn)在400的相對(duì)位置上，這表明后代加倍植株的細(xì)胞DNA相對(duì)含量較其二倍體親本增加了一倍，即后代植株的染色體已進(jìn)行了加倍。

(3)根腫病抗性鑒定：通過菌土法接種鑒定和抗根腫病基因CRb的分子標(biāo)記驗(yàn)證相結(jié)合鑒定根腫病抗性。將基質(zhì)滅菌后，每克滅菌土中接種0.001g病根，然后直接將鑒定材料播于菌土中，于25-28℃下培養(yǎng)，2個(gè)月后拔出幼苗，洗凈根部雜質(zhì)，觀察發(fā)病情況。同時(shí)，利用與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13對(duì)后代加倍雙二倍體植株進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定。提取父母本及后代材料的DNA，然后進(jìn)行經(jīng)PCR擴(kuò)增及6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離獲得擴(kuò)增譜帶。當(dāng)后代材料的擴(kuò)增譜帶中出現(xiàn)抗根腫病大白菜所具有的313bp特異條帶時(shí)，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

綜上所述，在大白菜和甘藍(lán)進(jìn)行雜交時(shí)，最好以大白菜為母本；在對(duì)授粉后10d的子房進(jìn)行消毒后，將胚珠置于為：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95中進(jìn)行培養(yǎng)；待幼胚長至子葉形胚時(shí)，接入MS+0.1mg/L NAA+1mg/L6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.95。分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽分化；20-30d后轉(zhuǎn)入MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95的繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)；繼代2周后接入1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.95。生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根；出苗前，將植株在秋水仙素濃度為0.4％的條件下處理18h進(jìn)行人工加倍，然后使用形態(tài)學(xué)特征、流式細(xì)胞儀和根腫病抗性對(duì)其雜種進(jìn)一步鑒定。

<110> 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種抗根腫病的甘藍(lán)-大白菜遠(yuǎn)緣雜種的創(chuàng)制方法

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TCR13上游引物序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TCR13下游引物序列

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ccaaactagc caataaccat tgta 24