本發(fā)明涉及一種prpf6基因突變引發(fā)單倍劑量不足的rp小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)。

背景技術(shù)：

1、crispr/cas9技術(shù)是一種近年來(lái)迅速發(fā)展的基因編輯工具，具有高度的精確性和效率，廣泛應(yīng)用于基因組編輯、基因功能研究和遺傳病治療等領(lǐng)域。crispr/cas9系統(tǒng)最早在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)菌的一種免疫系統(tǒng)，用來(lái)對(duì)抗外源dna的入侵。其主要組成部分包括sgrna(single-guide?rna)和cas9核酸酶。sgrna引導(dǎo)cas9到達(dá)特定的dna靶點(diǎn)，并通過(guò)cas9的雙鏈切割功能破壞靶dna。基因敲除的機(jī)制依賴于細(xì)胞對(duì)雙鏈斷裂的修復(fù)，通常通過(guò)非同源末端連接(non-homologous?end?joining，nhej)產(chǎn)生堿基缺失或插入，導(dǎo)致靶基因失去功能。crispr/cas9的高效、簡(jiǎn)便和特異性使其在多個(gè)基因位點(diǎn)的同時(shí)編輯中表現(xiàn)出色。盡管面臨脫靶效應(yīng)和修復(fù)效率問(wèn)題，但該技術(shù)的廣泛應(yīng)用包括基因功能研究、疾病模型構(gòu)建和基因治療。

2、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis?pigmentosa，rp)是一組以進(jìn)行性視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡和視網(wǎng)膜色素上皮變性為主要特征的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病，具有明顯的臨床及遺傳異質(zhì)性。2018年，我國(guó)公布的首批罕見(jiàn)病目錄中，rp位列其中。rp的初始臨床表現(xiàn)為夜盲癥和視覺(jué)狹窄，通常從青春期開(kāi)始。之后隨著視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的不可逆退化，最終完全失明。目前已有的臨床藥物和手段，均不能有效延緩或治療rp。大部分rp致病基因特異性表達(dá)在視網(wǎng)膜區(qū)域并且參與感光系統(tǒng)的不同功能，如光傳導(dǎo)信號(hào)，視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)通路，視網(wǎng)膜代謝，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，纖毛結(jié)構(gòu)和功能。其中有6個(gè)參與剪接的小核糖核蛋白(smallnuclear?ribonucleoprotein?particles,snrnp)組成成分(prpf3、prpf4、prpf6、prpf8、prpf31、snrnp200)也可以導(dǎo)致rp。此外我們前期對(duì)收集200多例的視網(wǎng)膜色素變性病人進(jìn)行了外顯組測(cè)序，也發(fā)現(xiàn)了包括prpf6基因的剪接位點(diǎn)新突變(c.2673+1g>a)在內(nèi)的多個(gè)snrnp基因新突變，目前已知大部分剪接因子突變導(dǎo)致rp的遺傳方式為常染色體顯性，致病原因都可以歸因于功能缺失(loss?of?function，lof)突變導(dǎo)致的單倍劑量不足(haplodeficiency)。且現(xiàn)有的關(guān)于prpf6突變所導(dǎo)致rp的研究過(guò)少，對(duì)于prpf6突變所導(dǎo)致rp的分子機(jī)制的研究仍需進(jìn)一步探索。

3、prpf6基因(pre-mrna?processing?factor?6)編碼一種與剪接體相關(guān)的蛋白質(zhì)，參與真核細(xì)胞中mrna前體的剪接過(guò)程。近年來(lái)的研究表明，prpf6的突變與rp密切相關(guān)。prpf6基因編碼的蛋白質(zhì)參與mrna前體的剪接，是剪接體u4/u6-u5三聯(lián)體的關(guān)鍵組成部分。prpf6的突變破壞了剪接體的正常功能，導(dǎo)致視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞中mrna剪接異常，引發(fā)蛋白質(zhì)生成錯(cuò)誤，進(jìn)而導(dǎo)致這些細(xì)胞退化。當(dāng)前的研究正在探索基因治療、rna剪接修正等潛在的治療方法，但仍需更多的研究和臨床驗(yàn)證。prpf6與rp的研究不僅揭示了剪接體功能障礙的致病機(jī)制，也為未來(lái)治療rp提供了重要的方向。

4、基于prpf6和rp的上述特征，雖然現(xiàn)有的技術(shù)已有prpf6基因敲除與rp的相關(guān)報(bào)道，但是由于rp的遺傳復(fù)雜性，上述小鼠模型雖然可以在一定程度上模擬類似于rp的相關(guān)癥狀，但是研究結(jié)果相對(duì)局限，很難接近prpf6突變導(dǎo)致的rp的理想疾病模型，從而很難用于prpf6突變導(dǎo)致的rp的基因治療方面的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種制備關(guān)于prpf6基因突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜色素變性的哺乳動(dòng)物模型的方法，所述方法包括：將小鼠同源染色體中在不影響上下游基因的情況下將prpf6基因第4到11外顯子切除，形成長(zhǎng)度約17kb的缺失，編碼序列為1165bp，占cds的41.27％，并且所敲除編碼序列為非3的倍數(shù)，導(dǎo)致移碼突變，使基因的功能被破壞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)prpf6的敲除。

2、本發(fā)明提供了一種制備視網(wǎng)膜色素變性(rp)疾病非人哺乳動(dòng)物模型的方法，所述方法包括：將所述動(dòng)物同源染色體中的prpf6基因的第4到11外顯子切除，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

3、根據(jù)prpf6基因結(jié)構(gòu)，選擇prpf6基因的exon4-11為敲除區(qū)域，須知，雖然我們選擇此區(qū)域?yàn)榍贸齾^(qū)域，但是在小鼠該敲除區(qū)域上下游的基因組上均為內(nèi)含子，內(nèi)含子的缺失對(duì)于本發(fā)明模型的構(gòu)建沒(méi)有影響，因此，本發(fā)明的敲除區(qū)域可以為prpf6基因的exon3-12中間的區(qū)域，不包含exon3外顯子和exon12外顯子，同時(shí)必須包含exon4-exon11區(qū)域。

4、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述prpf6基因可參考nm_133701.2(ncbi?refseq)，nm_133701.2為完整的已經(jīng)剪切和加工后的成熟mrna；還可參考ensembl?id為ensmusg00000002455的序列；還可參考prpf6201：ensmust00000002529的轉(zhuǎn)錄本。

5、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，使用crispr/cas9系統(tǒng)將所述prpf6基因的第4到11外顯子切除。

6、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括sgrna和cas9酶，sgrna序列分別如seq?id?no.1～4所示。

7、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因敲除的對(duì)象為受精卵的prpf6基因。

8、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述crispr/cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)入受精卵的方法為顯微注射。

9、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括將處理后受精卵移植到假孕雌性動(dòng)物體內(nèi)并產(chǎn)出f0代，進(jìn)行基因型鑒定，得到視網(wǎng)膜色素變性(rp)疾病動(dòng)物。

10、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述非人哺乳動(dòng)物為嚙齒類動(dòng)物。

11、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述非人哺乳動(dòng)物是小鼠。

12、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法包括：將rnp注射復(fù)合物注入到小鼠受精卵中，將所述受精卵移植到代孕小鼠體內(nèi)，產(chǎn)出rp病小鼠。

13、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rnp注射復(fù)合物為，在水中添加sgrna混勻孵育，之后再加入cas9蛋白混勻孵育，得到rnp注射復(fù)合物。

14、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述sgrna和cas9蛋白按照體積比為7：1的比例添加。

15、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述sgrna由序列為seq?id?no.1～4的sgrna混合得到。

16、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rnp注射復(fù)合物為，在5.2μl?rnase-free水中加入1.4μl?100pmol/μl的sgrna(由序列為seq?id?no.1～4的sgrna按照1：1：1：1(v/v/v/v)的比例混勻得到)混勻孵育5min，再加入0.2μl?cas9蛋白混勻孵育10min，得到rnp注射復(fù)合物。

17、本發(fā)明還提供了一種prpf6基因突變引發(fā)單倍劑量不足的rp病小鼠模型，所述小鼠模型為，將小鼠同源染色體中prpf6基因第4到11外顯子切除，導(dǎo)致移碼突變，破壞基因功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)prpf6的敲除。

18、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述小鼠模型是利用非同源末端連接的方式，通過(guò)crispr/cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)prpf6基因的第4到11號(hào)外顯子的敲除。

19、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括sgrna和cas9酶，sgrna序列分別如seq?id?no.1～4所示。

20、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rp病的致病原因?yàn)楣δ苋笔蛔儗?dǎo)致的單倍劑量不足。

21、本發(fā)明還提供了一種prpf6基因突變引發(fā)單倍劑量不足的rp病小鼠模型的制備方法，所述方法包括：使用crispr/cas9系統(tǒng)將小鼠prpf6基因第4到11外顯子切除。

22、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體包括如下步驟：

23、將seq?id?no.1～4所示的sgrna序列、cas9蛋白混合后得到rnp注射復(fù)合物，將rnp注射復(fù)合物注入到小鼠受精卵中，將所述受精卵移植到代孕小鼠體內(nèi)，產(chǎn)出小鼠并進(jìn)行基因型鑒定，得到基因成功敲除的f0代小鼠即rp病小鼠；

24、將基因成功敲除的f0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到f1代雜合基因敲除小鼠即rp病小鼠；

25、將得到的f1代雜合的雌雄小鼠進(jìn)行同型交配，得到f2代雜合基因敲除小鼠即rp病小鼠；

26、將得到的f2代雜合的雌雄小鼠進(jìn)行同型交配，獲得prpf6基因敲除雜合小鼠即rp病小鼠種系。

27、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rnp注射復(fù)合物為，在水中添加sgrna混勻孵育，之后再加入cas9蛋白混勻孵育，得到rnp注射復(fù)合物。

28、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述sgrna和cas9蛋白按照體積比為7：1的比例添加。

29、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述sgrna由序列為seq?id?no.1～4的sgrna按照1：1：1：1(v/v/v/v)的比例混勻得到。

30、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rnp注射復(fù)合物為，在5.2μl?rnase-free水中加入1.4μl?100pmol/μl的sgrna(由序列為seq?id?no.1～4的sgrna按照1：1：1：1(v/v/v/v)的比例混勻得到)混勻孵育5min，再加入0.2μl?cas9蛋白混勻孵育10min，得到rnp注射復(fù)合物。

31、本發(fā)明還提供了一種prpf6基因敲除小鼠模型的制備方法，所述方法包括：使用crispr/cas9系統(tǒng)將小鼠prpf6基因第4到11外顯子切除。

32、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括sgrna和cas9酶，sgrna序列分別如seq?id?no.1～4所示。

33、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體包括如下步驟：

34、將seq?id?no.1～4所示的sgrna序列、cas9蛋白混合后得到rnp注射復(fù)合物，將rnp注射復(fù)合物注入到小鼠受精卵中，將所述受精卵移植到代孕小鼠體內(nèi)，產(chǎn)出小鼠并進(jìn)行基因型鑒定，得到基因成功敲除的f0代小鼠；

35、將基因成功敲除的f0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到f1代雜合基因敲除小鼠；

36、將得到的f1代雜合的雌雄小鼠進(jìn)行同型交配，得到f2代雜合基因敲除小鼠；

37、將得到的f2代雜合的雌雄小鼠進(jìn)行同型交配，獲得prpf6基因敲除雜合小鼠種系。

38、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rnp注射復(fù)合物為，在水中添加sgrna混勻孵育，之后再加入cas9蛋白混勻孵育，得到rnp注射復(fù)合物。

39、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述sgrna和cas9蛋白按照體積比為7：1的比例添加。

40、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述sgrna由序列為seq?id?no.1～4的sgrna混合得到。

41、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述rnp注射復(fù)合物為，在5.2μl?rnase-free水中加入1.4μl?100pmol/μl的sgrna(由序列為seq?id?no.1～4的sgrna按照1：1：1：1(v/v/v/v)的比例混勻得到)混勻孵育5min，再加入0.2μl?cas9蛋白混勻孵育10min，得到rnp注射復(fù)合物。

42、本發(fā)明還提供了一種prpf6基因敲除小鼠模型，所述小鼠模型由上述方法制備得到。

43、本發(fā)明還提供了上述prpf6基因敲除小鼠模型在研究rp致病機(jī)理中的應(yīng)用。

44、本發(fā)明還提供了上述prpf6基因敲除小鼠模型在研究rp基因治療方法中的應(yīng)用。

45、本發(fā)明還提供了一種用于在小鼠prpf6基因切除第4到11外顯子的crispr/cas9系統(tǒng)，所述crispr/cas9系統(tǒng)包含sgrna和cas9酶，sgrna序列分別如seq?id?no.1～4所示。

46、本發(fā)明還提供了上述prpf6基因突變引發(fā)單倍劑量不足的rp病小鼠模型或上述方法制備得到的小鼠模型在篩選用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜色素變性疾病藥物中的應(yīng)用。

47、本發(fā)明還提供了上述prpf6基因突變引發(fā)單倍劑量不足的rp病小鼠模型或上述方法制備得到的小鼠模型在rp疾病研究中的應(yīng)用，所述研究是以非疾病的治療為目的。

48、本發(fā)明還提供了上述小鼠模型、或上述方法得到的小鼠模型在制備鑒別和/或測(cè)試視網(wǎng)膜色素變性疾病的藥物中的用途。

49、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物用于預(yù)防和/或治療的適應(yīng)癥為視網(wǎng)膜色素變性疾病、和/或治療與視網(wǎng)膜色素變性疾病相關(guān)的并發(fā)癥。

50、本發(fā)明還提供一種視網(wǎng)膜色素變性疾病小鼠模型的培育方法，所述方法包括如下步驟：將上述prpf6基因突變引發(fā)單倍劑量不足的rp病小鼠模型或上述方法制備得到的小鼠模型相互交配得到雜合子小鼠。

51、有益效果：

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：

53、(1)本發(fā)明提供了prpf6突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜色素變性的小鼠模型的構(gòu)建方法，應(yīng)用該方法構(gòu)建的小鼠模型可以穩(wěn)定傳代，為研究prpf6基因突變與視網(wǎng)膜色素變性的關(guān)系及其致病機(jī)理提供了便捷、可靠、經(jīng)濟(jì)的手段。

54、(2)在人類患者研究材料不易獲得且受醫(yī)學(xué)倫理制約的情況下，本發(fā)明提供的小鼠模型將成為prpf6突變相關(guān)的視網(wǎng)膜色素變性研究中的重要工具。

55、(3)本發(fā)明提供的小鼠模型在致病機(jī)理、治療方法、藥物篩選等方面的研究中提供可穩(wěn)定遺傳的有效研究模型，尤其是在基于基因編輯的治療方法中提供了prpf6突變所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜色素變性小鼠模型。

56、(4)本發(fā)明的構(gòu)建方法為研究人類中prpf6突變的相關(guān)因素和診斷治療提供了基礎(chǔ)。

57、(5)本發(fā)明的方法可影響prpf6基因整體的表達(dá)，從而達(dá)到剪接因子單倍劑量不足的效果，可以相對(duì)更加接近prpf6突變導(dǎo)致的rp的疾病模型。

58、(6)本發(fā)明提供的小鼠模型與其他視網(wǎng)膜色素變性疾病模型小鼠相比，表型緩慢，發(fā)展過(guò)程穩(wěn)健，使得研究人員能夠長(zhǎng)期觀察疾病的進(jìn)展和變化，更深入地了解疾病的本質(zhì)。