本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，特別涉及雜交楓香葉片起源體胚發(fā)生及獲得再生植株的方法，屬于植物無性繁殖。

背景技術(shù)：

1、近年來，由于農(nóng)林業(yè)優(yōu)良品種或無性系迫切需要大規(guī)模繁殖或深入研究，體胚發(fā)生成為了研究熱點。這是因為高等植物的再生主要分為以下三種:組織修復(fù)、器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生(許智宏等,2019)。體細(xì)胞胚胎發(fā)生，又稱體胚發(fā)生，其繁殖具有效率高，可以穩(wěn)定大規(guī)模生產(chǎn)，單細(xì)胞起源等特性，其胚胎的兩極性允許直接發(fā)育成植株，而不需要器官發(fā)生所必需的生根階段(張?zhí)鞊竦?2022)。而且，體胚發(fā)生類似合子胚胚胎發(fā)生的發(fā)育階段，可以為研究高等植物生命周期中最早的發(fā)育事件——合子胚的發(fā)育提供可行的參考模型(guan?et?al.,2016)。此外，體胚發(fā)生是遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯的重要材料來源，也是生產(chǎn)單倍體、體細(xì)胞雜交和人工種子的最佳選擇方法。

2、外植體來源直接決定體胚發(fā)生的能力，外植體到胚胎再生過程首先經(jīng)過脫分化形成具有全能性的細(xì)胞，接著通過再分化形成胚胎，所以一般認(rèn)為外植體距離合子胚階段越遠(yuǎn)，就需要越多的細(xì)胞重編程過程形成胚性愈傷組織，進(jìn)而誘導(dǎo)體胚(許智宏等,2019)。目前，林木體胚發(fā)生的外植體來源主要是生殖器官，包括合子胚、雄花等，而營養(yǎng)器官分化程度較高，建立體胚體系比較困難，目前只在楊樹(于志水等,2005)、桉樹(corredoira?etal.,2015)等體胚發(fā)生較為容易的闊葉樹種建立成功。然而營養(yǎng)器官能夠代表母樹本身的遺傳特性，且取材方便，可以實現(xiàn)全年供給，供給量也非常大，因此建立營養(yǎng)器官起源體胚體系對于提高優(yōu)良品種的生產(chǎn)效益非常重要。

3、目前誘導(dǎo)體胚發(fā)生最常用的方法是對外植體施加生物或非生物脅迫，以及改變內(nèi)源和外源植物生長調(diào)節(jié)劑(pgrs)的水平進(jìn)而觸發(fā)體胚發(fā)生。目前最常用的是高水平的植物激素處理，除此之外還包括創(chuàng)傷、高溫、化學(xué)小分子、滲透壓等(salaün?et?al.,2021)。其中最常用的植物激素是生長素和細(xì)胞分裂素。此外也有很多研究證明脫落酸(chen?et?al.,2021；thi?et?al.,2005；rudus?et?al.,2009)、乙烯(roustan?et?al.,1989；kepczynskaet?al.,2009；zheng?et?al.,2013)、水楊酸(hao?etal.,2006；hutchinson?et?al.,1996；hong?et?al.,2008)和茉莉酸(rudus?et?al.,2005,2009；ahmadi?et?al.,2014)在體胚發(fā)生過程中起著非常重要的作用。然而營養(yǎng)器官起源的體胚發(fā)生生物過程比較復(fù)雜，傳統(tǒng)的植物激素并不能解決尤其是林木體胚發(fā)生體系建立困難的問題，隨著體胚發(fā)生研究的進(jìn)一步深入，肽激素在植物生長發(fā)育中的作用研究成為新興熱點，其也成為解決林木營養(yǎng)器官起源體胚發(fā)生的一個方向。

4、植物中的肽激素是具有幾個到幾十個氨基酸的小肽，通常由含有n端信號肽的前體蛋白產(chǎn)生，經(jīng)過切割和修飾形成成熟肽，到目前為止，成熟肽的修飾方式主要分為三種：酪氨酸磺基化、脯氨酸羥基化和阿拉伯糖基化。小肽通常是細(xì)胞間的通訊信號，以非細(xì)胞自主的方式協(xié)調(diào)植物防御和發(fā)育過程，包括分生組織維持、細(xì)胞分裂、氣孔發(fā)育、繁殖和結(jié)瘤等(song?et?al.,2017)。目前研究發(fā)現(xiàn)了幾種對于植物再生非常關(guān)鍵的肽激素，包括磺肽素(phytosulfokine)(li?etal.,2024)、clavata3(clv3)/embryo?surrounding?region-related(cle)(yamaguchi?et?al.,2016)、plant?peptide?containing?sulfatedtyrosine(psy)(ogawa-ohnishi?et?al.,2022)。

5、磺肽素最初是蘆筍葉肉細(xì)胞增殖培養(yǎng)過程中作為細(xì)胞分裂因子被發(fā)現(xiàn)(matsubayashi?et?al.,1996)。體胚發(fā)生過程涉及細(xì)胞擴張與重編程，磺肽素在胡蘿卜(hanai?et?al.,2000)與雜交鵝掌楸(陳金慧等,2013)中被發(fā)現(xiàn)可以通過加快胚性細(xì)胞增殖促進(jìn)體胚發(fā)生，證實了磺肽素對于促進(jìn)細(xì)胞增殖的顯著作用。另外，有研究表明磺肽素可以促進(jìn)日本落葉松(umehara?et?al.,2005)、小麥(asif?et?al.,2014)、豆類(ochatt?etal.,2018)胚胎細(xì)胞的發(fā)育加快體胚發(fā)生，隨后杉木研究中解釋了這一現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)磺肽素可以通過維持氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)擺脫基因型依賴促進(jìn)體胚發(fā)生，而且研究還表明磺肽素還通過參與其他生物途徑調(diào)控杉木體胚發(fā)生(hao?et?al.,2023)。以上研究表明磺肽素可以作為一種促進(jìn)體胚發(fā)生的潛在關(guān)鍵因子，而且這種促進(jìn)作用不僅僅是通過調(diào)控細(xì)胞增殖實現(xiàn)的，還存在其他的途徑，例如維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。

6、目前有研究建立了雜交楓香葉柄通過體胚發(fā)生方式獲得再生植株的方法，但是體胚形成率和萌發(fā)率不高，并且以葉片作為外植體的體胚發(fā)生獲得再生植株的體系遲遲未被攻克，葉片為無性繁殖領(lǐng)域優(yōu)先使用的外植體，廣泛被用于植物組織培養(yǎng)、基因工程，因此打破葉片起源體胚發(fā)生進(jìn)而獲得再生植株的瓶頸是非常必要的。此外，目前傳統(tǒng)的植物激素的功能已經(jīng)明確，并且一些技術(shù)不能通過傳統(tǒng)的植物激素解決，因此挖掘一些新型的植物激素時非常必要的，本發(fā)明利用一種新型的植物小肽磺肽素打破了葉片起源體胚發(fā)生的瓶頸，并且大大提高了胚性愈傷組織形成率、體胚形成率和萌發(fā)率，對于雜交楓香無性系的發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)，也對其他闊葉樹營養(yǎng)器官體胚體系的建立提供了參考方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有雜交楓香葉柄體胚發(fā)生過程中存在的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、體胚形成率和萌發(fā)率低等技術(shù)問題，提供一種新穎的雜交楓香體胚的獲得方法，本發(fā)明方法以雜交楓香的功能葉片為外植體，通過磺肽素進(jìn)行體胚發(fā)生體系建立，獲得雜交楓香的體胚，顯著提高了雜交楓香繁殖效率；實現(xiàn)優(yōu)良品系的大規(guī)模無性繁殖，為闊葉樹體營養(yǎng)器官體胚發(fā)生的突破提供一個參考途徑。

2、為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種雜交楓香體胚的獲得方法，將雜交楓香的成熟器官作為外植體，于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得的愈傷組織再于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得體胚，其中，所述的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有磺肽素。

3、其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白1g/l+蔗糖40g/l+2,4-d?0.5-1.5mg/l+6-ba0.2-0.8mg/l+psk-α(磺肽素)0-0.2mg/l(優(yōu)選為0.1-0.2mg/l)+植物凝膠1g/l，ph為5.6～5.7。

4、特別是，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白1g/l+蔗糖40g/l+2,4-d?0.5-1.5mg/l+6-ba0.2-0.8mg/l+psk-α(磺肽素)0.1-0.2mg/l+植物凝膠1g/l。

5、特別是，所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+活性炭1g/l+蔗糖40g/l+psk-α0-0.8mg/l(優(yōu)選為0.2-0.8mg/l)+植物凝膠6g/l，ph為5.6～5.7。

6、特別是，所述的雜交楓香成熟營養(yǎng)器官為葉片、葉柄，優(yōu)選為葉片。

7、特別是，選擇培養(yǎng)7～8個月大的雜交楓香幼苗的葉片。

8、本發(fā)明另一方面提供一種雜交楓葉片起源體胚發(fā)生的方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟:

9、1)愈傷組織誘導(dǎo)處理

10、將雜交楓香無菌葉片置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織；

11、2)胚性愈傷組織成熟處理

12、將胚性愈傷組織置于液體胚性愈傷組織成熟培養(yǎng)基中，于黑暗條件下進(jìn)行胚性愈傷組織的成熟培養(yǎng)；

13、3)體胚誘導(dǎo)處理

14、將成熟培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織置于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)；

15、4)體胚發(fā)育處理

16、將體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)后的組織轉(zhuǎn)接到體胚發(fā)育培養(yǎng)基中，于黑暗條件下進(jìn)行體胚發(fā)育培養(yǎng)，獲得子葉胚；

17、5)體胚萌發(fā)處理

18、將體胚發(fā)育培養(yǎng)獲得的子葉胚置于體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體胚萌發(fā)培養(yǎng)，獲得雜交楓香再生植株。

19、其中，步驟1)中剪取雜交楓香7～8個月大試管苗的無菌葉片放置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

20、特別是，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃；培養(yǎng)時間：25-35天，優(yōu)選為30天。

21、特別是，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白1g/l+蔗糖40g/l+2,4-d?0.5-1.5mg/l+6-ba0.2-0.8mg/l+psk-α(磺肽素)0-0.2mg/l(優(yōu)選為0.1-0.2mg/l)+植物凝膠1g/l，ph為5.6～5.7。

22、特別是，還包括步驟1a)：愈傷組織增殖培養(yǎng)：將步驟1)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，于黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)。

23、特別是，所述愈傷組織增殖培養(yǎng)的溫度為25±2℃。

24、特別是，所述愈傷組織增殖培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白1g/l+蔗糖40g/l+2,4-d?0.5mg/l+6-ba0.2mg/l+psk-α0.1-0.2mg/l+植物凝膠3g/l，ph為5.6～5.7。

25、特別是，所述愈傷組織增殖培養(yǎng)基為改良blaydes基本培養(yǎng)基+水解酪蛋白1g/l+蔗糖40g/l+2,4-d?0.5+6-ba0.2mg/l+psk-α0.2mg/l+植物凝膠3g/l，ph為5.6～5.7。

26、特別是，愈傷組織增殖培養(yǎng)過程在，每12-17天(優(yōu)選15天)繼代一次，培養(yǎng)30天。

27、步驟1a)中愈傷組織增殖培養(yǎng)15天時會長出質(zhì)地更加分散，呈顆粒狀的次級愈傷組織，次級愈傷組織被認(rèn)定后續(xù)可以誘導(dǎo)體胚，此時繼代一次，增殖過程培養(yǎng)30天，以獲取數(shù)量足夠多的次級胚性愈傷組織。

28、特別是，步驟2)中所述胚性愈傷組織成熟培養(yǎng)條件為：暗培養(yǎng)；成熟培養(yǎng)溫度為25±2℃；成熟培養(yǎng)時間為12-17天，優(yōu)選為15天；成熟培養(yǎng)過程中，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，其中懸浮培養(yǎng)速率為120±20rpm。

29、特別是，所述胚性愈傷組織成熟培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+蔗糖40g/l+psk-α0-0.8mg/l(優(yōu)選為0.2-0.8mg/l，進(jìn)一步優(yōu)選為0.4mg/l)，ph為5.6～5.7。

30、特別是，胚性愈傷組織成熟培養(yǎng)過程中，每7天繼代一次；成熟培養(yǎng)時間12-17天，優(yōu)選為15天。

31、步驟2)中胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)15天(通常為12-17天)，7天繼代一次，成熟培養(yǎng)降低愈傷組織中的外源植物激素含量，便于后續(xù)的體胚誘導(dǎo)。

32、步驟2)中所述愈傷組織成熟培養(yǎng)是在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，其中每0.2g愈傷組織放入盛有50ml液體成熟培養(yǎng)基。

33、特別是，步驟3)中所述的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)為：將胚性愈傷組織成熟處理后的體系進(jìn)行過濾處理后，成熟培養(yǎng)的胚性愈傷組織連同濾紙一同置于固體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

34、特別是，步驟3)中所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：暗培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25±2℃；培養(yǎng)時間為25-35天，優(yōu)選為30天。

35、特別是，所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+活性炭1g/l+蔗糖40g/l+psk-α0-0.8mg/l(優(yōu)選為0.2-0.8mg/l，進(jìn)一步優(yōu)選為0.4mg/l)+植物凝膠6g/l，ph為5.6～5.7。

36、體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的目的是吸附胚性愈傷組織中的植物激素。

37、步驟3)的目的是進(jìn)一步通過活性炭和高劑量的植物凝膠來吸附胚性愈傷組織中的外源植物激素，為體胚誘導(dǎo)提供干燥的培養(yǎng)環(huán)境，提高體胚誘導(dǎo)效率，培養(yǎng)30天(25-35天)時，就會有球形胚陸續(xù)產(chǎn)生。

38、特別是，步驟4)中所述體胚發(fā)育培養(yǎng)條件為：暗培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25±2℃。

39、特別是，體胚發(fā)育培養(yǎng)時間為55-65天，優(yōu)選為60天，通常培養(yǎng)至獲得子葉胚。

40、特別是，體胚發(fā)育培養(yǎng)過程中，每30天繼代一次。體胚發(fā)育培養(yǎng)基中指紋凝膠含量低于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的植物凝膠的含量，培養(yǎng)基中植物凝膠含量降低，降低了培養(yǎng)基滲透壓，利于球形胚往心形胚、魚雷形胚和子葉胚發(fā)育。

41、特別是，所述體胚發(fā)育培養(yǎng)基為：改良blaydes基本培養(yǎng)基+活性炭1g/l+蔗糖40g/l+psk-α0-0.8mg/l(優(yōu)選為0.2-0.8mg/l，進(jìn)一步優(yōu)選為0.4mg/l)+植物凝膠3g/l，ph為5.6～5.7。

42、特別是，步驟5)中體胚萌發(fā)培養(yǎng)條件為：在光照條件下進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25±2℃；光照強度為1000-1500lx(優(yōu)選為1200lx)；光照時間為14-18h/d(優(yōu)選為16h/d)。

43、特別是，所述體胚萌發(fā)培養(yǎng)基為：wpm基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/l+植物凝膠3g/l，ph為5.8～5.9。

44、步驟5)中體胚萌發(fā)培養(yǎng)時間為25-35天，優(yōu)選為30天；體胚萌發(fā)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件由黑暗改為光照且向再生苗發(fā)育，本步驟基本培養(yǎng)基的使用和培養(yǎng)基酸堿度與其他過程有顯著變化。培養(yǎng)15天時，子葉胚就會生長出完整的根系，子葉長出，培養(yǎng)30天時，子葉胚就會發(fā)育為完整的植株。

45、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

46、1、本發(fā)明攻克了基因工程、生產(chǎn)應(yīng)用等使用更廣泛的葉片為外植體的通過體胚方式獲得再生植株的技術(shù)難題，現(xiàn)有的葉柄為外植體的技術(shù)體系，由于葉柄表面積較小、較不容易獲取，不便于利用在其他用途。

47、2、本發(fā)明將雜交楓香體胚發(fā)生的過程清晰的區(qū)分出了葉片去分化誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織再分化形成體胚兩個過程，對于研究植物組織去分化、再分化的分子機制提供了契合的體系，為基因工程育種提供了穩(wěn)定高效的技術(shù)體系。

48、3、基因型差異一直是制約體胚發(fā)生的關(guān)鍵因素，本發(fā)明對高胚性基因型和低胚性基因型都適用，對于生產(chǎn)實踐更有關(guān)鍵意義。

49、4、本發(fā)明采用新型的小肽激素-磺肽素進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、液體成熟培養(yǎng)、體胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)、體胚發(fā)育培養(yǎng)，大大提高了體胚發(fā)生效率。

50、5、本發(fā)明培養(yǎng)基中添加磺肽素提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，利用3種低胚性基因型(“東南-1-2”、“ht-4”、“ht-10”，為實生苗)設(shè)計試驗進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了0.2mg/l磺肽素時，不同基因型植株的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率雖然存在差異，但是均達(dá)到83％以上，整體愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

51、6、本發(fā)明中，在誘導(dǎo)體胚過程中，在低胚性基因型(“東南-1-2”)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中未添加磺肽素時，胚性愈傷組織無法發(fā)育形成體胚，添加0.4mg/l磺肽素時，胚性愈傷組織成功誘導(dǎo)出體胚，并且能正常發(fā)育形成子葉胚；在高胚性基因型(“sf15sh-5a”，為體胚苗)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中未添加磺肽素時，每0.2g愈傷組織可以形成38個子葉胚，當(dāng)添加0.4mg/l磺肽素時，每0.2g愈傷組織可以形成82個子葉胚，子葉胚形成率顯著提升，并且外源添加磺肽素并不會影響后續(xù)的體胚萌發(fā)，體胚萌發(fā)率可以達(dá)到50％以上，這大大優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。