本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，特別是涉及一種香果樹高效快速繁殖的方法。

背景技術(shù)：

1、香果樹樹干挺直，適用于木材的制作，其纖維細致且有彈性，可用于制造蠟紙和人造棉；根和樹皮可作藥物，治療嘔吐等癥狀；枝干優(yōu)美，花朵艷麗，是良好的園林觀賞樹種。但香果樹野生種群規(guī)模非常小(徐小玉等2002，楊開軍等2007，方元平等2007)，由于棲息地破壞、過度開發(fā)和自然再生率低，其種群數(shù)量急劇下降。雖然香果樹的有翅種子小而輕，可以隨風傳播(李鐵華等2004)，但由于受到光照和濕度的限制，種子在自然生境中的萌發(fā)率較低，在森林中很少見到幼苗。因此，在野外香果樹面臨滅絕的危險(gan?et?al?2006)。

2、國內(nèi)對香果樹的研究多集中在種群結(jié)構(gòu)和動態(tài)方面。我國中東部等14個省區(qū)雖然也有少量香果樹分布，但只零散生長于高海拔、高濕度山地(楊開軍和張小平2007)，在多數(shù)地區(qū)表現(xiàn)出退化趨勢。香果樹種群在野外主要依賴群體繁殖、種子萌發(fā)和幼苗庫的補充進行更新，在樹齡為20-30年時才會迎來初花期(徐小玉等2002，郭連金等2015)，且花期和果期的敗育率極高(分別達到80％和60％)，結(jié)實率非常低(郭連金等2011)。香果樹種子只有一年的生命周期(李中岳和班青1995)，對光敏感(李鐵華等2004)，適宜的光環(huán)境對其種子的萌發(fā)和幼苗的建植至關(guān)重要(郭連金2021)。在野外，香果樹群體的更新還可通過扦插等方式進行無性繁殖，但扦插、埋根育苗的最高生根率只有68.61％(萬軍等2017)。此外，組織培養(yǎng)技術(shù)也是一種高效的無性繁殖方法，能夠以較少的成本，在短時間內(nèi)獲取大量高質(zhì)量的香果樹幼苗，是一種緩解其瀕危現(xiàn)狀的有效途徑。

3、在組織培養(yǎng)條件下，香果樹可用胚、莖段、葉片和芽等材料作為外植體，通過體細胞胚發(fā)生途徑、直接或間接器官發(fā)生途徑實現(xiàn)離體再生和擴繁(姬飛騰等2005，熊丹等2007，洪森榮和尹明華2010，宿靜等2008，彭祥等2018，李金蓉等2015)。如姬飛騰等(2005)通過葉片誘導(dǎo)獲得愈傷組織，然后將愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)體細胞胚，再通過體細胞胚的萌發(fā)獲得了植株，但該過程步驟多，且研究中缺乏具體數(shù)據(jù)的支持；熊丹等(2007)對香果樹葉片的不定芽直接誘導(dǎo)進行了研究，雖然不定芽誘導(dǎo)率高，但是培養(yǎng)40天后高度≥5mm的不定芽比例只占約43％；宿靜等(2008)利用香果樹葉片進行了不定芽的誘導(dǎo)，但實驗數(shù)據(jù)中缺乏重復(fù)，結(jié)果可靠性低，且缺乏誘導(dǎo)所得不定芽高度的數(shù)據(jù)；洪森榮和尹明華(2010)對香果樹無菌苗的增殖過程進行了研究，但缺乏不定芽誘導(dǎo)、伸長、生根等過程的研究；彭祥等(2018)利用葉片和葉柄誘導(dǎo)獲得了愈傷組織，再通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的分化，步驟多、花費時間長。

4、關(guān)于目前香果樹通過組織培養(yǎng)實現(xiàn)快速繁殖的研究報道，存在的主要問題概括如下：

5、(1)植株再生的過程需要經(jīng)過愈傷組織階段，步驟多、花費時間長；

6、(2)研究報道中缺乏系統(tǒng)的植株再生全過程，即使有些研究包含了再生和快速繁殖的各個步驟，但存在直接誘導(dǎo)不定芽困難、不定芽增殖系數(shù)低等問題，或?qū)嶒炄狈υ敿殧?shù)據(jù)或重復(fù)，不能判斷結(jié)果的可靠性；

7、(3)香果樹不定芽的伸長速度慢，大部分研究中缺乏不定芽高度和伸長速度的報道。

8、因此，如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前實現(xiàn)香果樹高效、快速繁殖亟需解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種香果樹高效快速繁殖的方法，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供的方法可以高效、快速地培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)的香果樹樹苗，為香果樹解除瀕危的困境提供重要技術(shù)指導(dǎo)。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供了一種香果樹高效快速繁殖的方法，包括以下步驟：

4、以香果樹實生苗帶芽嫩莖為外植體，在啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得無菌苗；

5、取所述無菌苗的葉片，在分化培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)分化，獲得不定芽；

6、將所述不定芽在增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得增殖后不定芽；

7、將所述增殖后不定芽在伸長培養(yǎng)基上進行伸長培養(yǎng)，獲得伸長后不定芽；

8、將所述伸長后不定芽在生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，獲得香果樹組培苗；

9、將所述香果樹組培苗移栽至混合基質(zhì)進行練苗。

10、優(yōu)選的是，所述啟動培養(yǎng)基為含2.0mg/l?6-ba、2.0mg/lkt和0.1mg/lnaa的ms培養(yǎng)基。

11、優(yōu)選的是，所述分化培養(yǎng)基為含1.0mg/l?6-ba、0.1mg/lnaa和0.01mg/l?tdz的ms培養(yǎng)基。

12、優(yōu)選的是，所述增殖培養(yǎng)基為含3.0mg/l?6-ba和0.1mg/l?iba的ms培養(yǎng)基。

13、優(yōu)選的是，所述伸長培養(yǎng)基為含3.0mg/l?6-ba、0.1mg/l?iba和0.1mg/l?ga3的ms培養(yǎng)基。

14、優(yōu)選的是，所述伸長培養(yǎng)前，還包括將所述增殖后不定芽去掉葉片，僅保留頂芽的步驟。

15、優(yōu)選的是，所述生根培養(yǎng)基為含有1.0mg/l?iba的1/2ms培養(yǎng)基。

16、優(yōu)選的是，所述混合基質(zhì)由泥炭土、基質(zhì)土和蛭石組成；

17、所述泥炭土、所述基質(zhì)土和所述蛭石的質(zhì)量比為3:3:1。

18、本發(fā)明還提供了一種香果樹的培養(yǎng)體系，包括啟動培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、伸長培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基；

19、其中，所述啟動培養(yǎng)基為含2.0mg/l?6-ba、2.0mg/lkt和0.1mg/lnaa的ms培養(yǎng)基；

20、所述分化培養(yǎng)基為含1.0mg/l?6-ba、0.1mg/lnaa和0.01mg/l?tdz的ms培養(yǎng)基；

21、所述增殖培養(yǎng)基為含3.0mg/l?6-ba和0.1mg/l?iba的ms培養(yǎng)基；

22、所述伸長培養(yǎng)基為含3.0mg/l?6-ba、0.1mg/l?iba和0.1mg/l?ga3的ms培養(yǎng)基；

23、所述生根培養(yǎng)基為含有1.0mg/l?iba的1/2ms培養(yǎng)基。

24、本發(fā)明還提供了一種所述的培養(yǎng)體系在香果樹繁殖中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

26、(1)在探索香果樹組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的優(yōu)化過程中，本發(fā)明系統(tǒng)比較了6-ba和naa組合以及6-ba、naa和tdz組合誘導(dǎo)葉片不定芽的效率。通過比較9種6-ba和naa組合以及5種6-ba、naa和tdz組合的培養(yǎng)基配方，本發(fā)明篩選出了最優(yōu)的不定芽直接誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：ms+1.0mg/l?6-ba+0.1mg/lnaa+0.01g/l?tdz+30g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂。此配方實現(xiàn)了香果樹無菌苗葉片81.7％的直接不定芽誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)得到的不定芽中74.2％為叢生芽，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。

27、(2)為提升香果樹的增殖效率，本發(fā)明比較了6-ba和iba組合對不定芽增殖的影響，得到最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基配方為ms+2.0mg/l?6-ba+0.1mg/l?iba+30g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂，在該培養(yǎng)基上增殖系數(shù)達3.9，不定芽生長良好；同時比較了提高6-ba濃度對不定芽芽增殖的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)將6-ba濃度提高至3.0mg/l時，其增殖系數(shù)可提高至4.7，且高度大于5mm的不定芽占比可達72.5％，明顯高于文獻中已發(fā)表的結(jié)果(熊丹等，2007)，這標志著香果樹快速繁殖技術(shù)的一大進步。

28、(3)香果樹生長速度較慢，為了促進香果樹不定芽的伸長，本發(fā)明比較了添加5種不同濃度ga3對香果樹不定芽伸長的影響。通過在增殖培養(yǎng)基中添加ga3，不定芽高度的增長速度得到顯著提高，其中在添加0.1mg/l?ga3的培養(yǎng)基中不定芽高度增長速度最快，顯著高于對照和其他濃度處理(圖2)，這標志著香果樹快速繁殖技術(shù)的另一大進步。