鐵皮石斛納米人工種子及其制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種鐵皮石斛納米人工種子及其制作 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛（Dendrobium officinal Kimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生型 草本植物，因其莖節(jié)處呈黑褐色，亦名黑節(jié)草。鐵皮石斛為我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，《中華人 民共和國藥典》2010版收錄石斛來源于石斛屬3種植物，將鐵皮石斛單列，具有養(yǎng)胃生津、 滋陰清熱、潤肺止咳等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛含有多糖、生物堿、氨基酸等成 分，具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力、擴(kuò)張血管及抗血小板凝集等作用，因此在臨床及 中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用。鐵皮石斛在我國主要分布于云南、貴州、廣東、廣西、浙江、四川等 地，其是一種生長緩慢、自身繁殖能力極低的蘭科附生植物，且十分嬌嫩，遇強光、直射光或 暴雨、雪凍即死亡，水分過多也會使其根部腐爛，甚至整株死亡。由于鐵皮石斛對生長環(huán)境 的要求較高，且受到自身繁殖方式的限制及近年來過度采挖野生藥材和整體生態(tài)環(huán)境的不 斷破壞，野生鐵皮石斛資源已接近枯竭。
[0003] 鐵皮石斛的種子細(xì)如粉末，又缺乏胚乳營養(yǎng)，自然條件下必須飄落在非常適宜的 環(huán)境與某些真菌共生才能萌發(fā)，很難用實生苗栽培；而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極 低。鑒于鐵皮石斛的重要價值，從20世紀(jì)70年代起科研人員就開始對鐵皮石斛人工栽培 技術(shù)進(jìn)行了研究，以便從根本上解決資源問題，因此發(fā)展鐵皮石斛良種繁育和人工栽培成 為保護(hù)和利用鐵皮石斛資源的必然之路。
[0004] 人工種子技術(shù)的誕生為珍稀緊缺的鐵皮石斛藥材產(chǎn)業(yè)化提供了一條新的途徑，其 本質(zhì)為無性繁殖，與試管苗相比，人工種子使得無菌生長的原球莖可以直接播入土壤，繁殖 速度快，從而減少了移栽馴化過程，且可大大降低試管苗培育和移栽馴化中的風(fēng)險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛納米人工種子及其制作方法。
[0006] 解決上述技術(shù)問題的具體技術(shù)方案如下：
[0007] -種鐵皮石斛納米人工種子的制作方法，包括如下步驟：
[0008] (1)原球莖的誘導(dǎo)：
[0009] 選取成熟未開裂的鐵皮石斛蒴果，分別用清潔劑、自來水清洗，再于超凈工作臺中 經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒、無菌水清洗、0. 1%升汞水溶液浸泡、無菌水清洗后，吸干表 面水分，切開，將種子均勻散布在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，即得原球莖；
[0010] (2)原球莖的增殖：
[0011] 選取步驟（1)中所得的原球莖，接種于MS+ (l-2mg/L) KT增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培 養(yǎng)，每30d轉(zhuǎn)瓶一次；所述培養(yǎng)的條件為：溫度24°C -26°C，光照12h/d，光照強度1500~ 20001x ；
[0012] (3)人工種子的制作：
[0013] 以 MS+1. 8-2. 2mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+1. 5wt% 木薯淀粉 +0? lwt% 保水劑 +4. 8-5. 2wt%納米TiO2光半導(dǎo)體溶膠+2wt%蔗糖+2wt%CaCl2+l. 8-2. 2wt%羧甲基纖維素 鈉為人工胚乳，以 MS+1. 8-2. 2mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+1. 5wt% 木薯淀粉 +0? lwt% 保水劑 +4. 8-5. 2wt%納米TiO2光半導(dǎo)體溶膠+2wt%蔗糖+1. 3-1. 7wt%海藻酸鈉為人工種皮基質(zhì)，將 原球莖與人工胚乳混勻，再用口徑為5mm的滴管吸起，滴到人工種皮基質(zhì)中，震蕩8-12min， 無菌去離子水沖洗，得球體；將所述球體用2wt%的CaCl 2溶液固化18-22min，沖洗，于表面 噴涂納米TiO2光半導(dǎo)體溶膠，吹干，即得人工種子。若羧甲基纖維素鈉的濃度為3. Owt%時， 其非常粘稠，在實際應(yīng)用中難于操作，且由于包裹層較厚而粘稠，反而降低了人工種子的萌 發(fā)率和成苗率。
[0014] 在其中一些實施例中，步驟（3)中所述人工胚乳為：MS+2mg/L6-BA+0. 5mg/ L NAA+1. 5wt%木薯淀粉+0. lwt%保水劑+5wt%納米TiO2光半導(dǎo)體溶膠+2wt%鹿糖 +2wt%CaCl2+2wt%羧甲基纖維素鈉。
[0015] 在其中一些實施例中，步驟（3)中所述人工種皮基質(zhì)為：MS+2mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+1. 5wt%木薯淀粉+0. lwt%保水劑+5wt%納米TiO2光半導(dǎo)體溶膠+2wt%鹿糖+1. 5wt% 海藻酸鈉。
[0016] 在其中一些實施例中，步驟（1)中所述酒精消毒的時間為28-32S。
[0017] 在其中一些實施例中，步驟（1)中所述0. 1%升汞水溶液浸泡的時間為13-17min。
[0018] 在其中一些實施例中，還包括步驟（4)人工種子的萌發(fā)：將步驟（3)制得的人工種 子于萌發(fā)基質(zhì)進(jìn)行萌發(fā)。
[0019] 在其中一些實施例中，所述萌發(fā)基質(zhì)為：純瓊脂培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基。
[0020] 在其中一些實施例中，所述萌發(fā)基質(zhì)為：純瓊脂培養(yǎng)基。
[0021] 根據(jù)上述制作方法制得的鐵皮石斛納米人工種子。
[0022] 在其中一些實施例中，所述人工種子的直徑為6. 5-7. 5mm，人工種皮的厚度為 0? 2-0. 3mm〇
[0023] 本發(fā)明所述一種鐵皮石斛納米人工種子及其制作方法具有以下優(yōu)點和有益效 果：
[0024] (1)本發(fā)明所述制作方法將納米技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)相結(jié)合，制得鐵皮石斛人工 種子的復(fù)合胚乳和人工種皮，顯著改善了傳統(tǒng)包埋的透氣性、保水性，又促進(jìn)了原球莖生 長，同時也顯著提高了人工種子的萌發(fā)率和成苗率，該制作方法工藝流程簡單、材料容易獲 得、不受季節(jié)影響、繁殖周期短、成本低廉，可有效解決鐵皮石斛野生資源日益枯竭的問題， 為鐵皮石斛人工種子實用化和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持，可通過規(guī)模化應(yīng)用快速繁育鐵皮 石斛種質(zhì)。
[0025] (2)本發(fā)明所述制備方法，經(jīng)發(fā)明人大量的實驗，確定人工胚乳中羧甲基纖維素鈉 和人工種皮基質(zhì)中的海藻酸鈉的含量，得出其制得的人工種子有較高的萌發(fā)率和成苗率； 且得出人工胚乳中羧甲基纖維素鈉的含量大于人工種皮基質(zhì)中的海藻酸鈉的含量，即存在 濃度差，可使得包裹原球莖的人工胚乳的液滴，完全浸沒在人工種皮基質(zhì)中，確保由里向外 絡(luò)合時形成的人工種皮的完整性。
[0026] (3)本發(fā)明所制得的人工種子在自然環(huán)境下具有較高的萌發(fā)率和成苗率。
[0027] (4)本發(fā)明所制得的人工種子呈半透明，在離子交換時可看到包裹在里面的原球 莖，以確保每粒人工種子中包裹一個原球莖。
【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明所制得的人工種子核心為液體和表面為海藻酸鈣膜；其中，海藻酸鈣膜的 厚度一般為〇. 2-0. 3_，該厚度可通過改變離子交換的時間進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
[0029] 本發(fā)明所述MS即MS培養(yǎng)基，其配方為：按1000 mL培養(yǎng)基計，硝酸鉀 (KNO 3) 1900mg/L、硝酸銨（NH4NO3) 1650mg/L、硫酸鎂（MgSO4. 7H20) 370mg/L、磷酸二氫 鉀（KH2PO4) 170mg/L、氯化鈣（CaCl2. 2H20)440mg/L、硫酸錳（MnSO4. 4H20) 22. 3mg/L、 硫酸鋅（ZnSO4. 4H20) 8. 6mg/L、硼酸（H3BO3) 6. 2mg/L、碘化鉀（KI)O. 83mg/L、鑰酸鈉 (Na2MoO4. 2H20)0. 25mg/L、硫酸銅（CuSO4. 5H20)0. 025mg/L、氯化鈷（CoCl2. 6H20)0. 025mg/L、 硫酸亞鐵（FeSO4. 7H20)27. 8mg/L、Na2-EDTA37. 3mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、鹽酸硫胺素 0? lmg/ L、鹽酸批卩多醇0? 5mg/L、煙酸0? 5mg/L、肌醇lOOmg/L;
[0030] 所述KT為激動素；6-BA為6-芐氨基嘌呤；NAA為萘乙酸；
[0031] 所述納米TiO2光半導(dǎo)體溶膠購自杭州萬景高新材料有限公司；
[0032] 所述成熟未開裂的鐵皮石斛蒴果購自廣東永生源生物科技有限公司。
[0033] 以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0034] 實施例1
[0035] -種鐵皮石斛納米人工種子的制作方法，包括如下步驟：
[0036] (1)原球莖的誘導(dǎo)：
[0037] 選取成熟未開裂的鐵皮石斛蒴果，分別用開米洗潔精清洗3_5min、自來水清洗 5-8min，再于超凈工作臺中經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒30s、無菌水清洗2次、然后用 0. 1%升汞溶液浸泡搖動消毒15min、無菌水清洗4-5次后，無菌紙巾吸干表面水分，備用。在 超凈工作臺上，將消毒過的蒴果用解剖刀對半切開，用鑷子夾緊蒴果的一端輕輕抖動，將種 子均勻散布在添加10%椰乳的MS培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，即得原球莖；
[0038] (2)原球莖的增殖：
[0039] 從步驟（1)中經(jīng)誘導(dǎo)獲得的原球莖選取大小基本一致的原球莖，接種于 MS+1. 5mg/L KT增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每30d轉(zhuǎn)瓶一次；所述培養(yǎng)的條件為：溫度 24°C -26°C，光照 12h/d，光照強度 1500 ~20001x ;
[0040] (3)人工種子的制作：
[0041]以 MS+2mg/L6_BA+0. 5mg/L NAA+1. 5wt% 木薯淀粉 +0? lwt% 保水劑 +5wt% 納米 TiO2光半導(dǎo)體溶膠+2wt%蔗糖+2wt%CaCl2+2wt%羧甲基