一種大薯組織培養(yǎng)再生體系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種大薯組織培養(yǎng)再生體系的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)今，大量的開(kāi)采和過(guò)度的使用礦物資源造成了嚴(yán)重的能源短缺和環(huán)境污染。因此，以能源植物為主的生物質(zhì)能將是人類未來(lái)的理想選擇，開(kāi)發(fā)能源植物作為現(xiàn)有能源的補(bǔ)充和替代品既能逐步緩解能源危機(jī)，又因生產(chǎn)成本低，符合可持續(xù)發(fā)展的要求和趨勢(shì)。草本植物具有對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、分布廣、生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)周期短，有利于大面積種植，進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。XmiD1scorea alata L.)又名參薯，為多年生纏繞草質(zhì)藤本，隸屬于薯蕷科薯預(yù)屬草本植物。大薯耐旱，耐熱，產(chǎn)量潛力高，且淀粉含量較高，生育期短，是一種頗具發(fā)展?jié)摿Φ哪茉粗参铩?br>[0003]目前，大薯主要通過(guò)地下塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，種子材料消耗大，且這種自留種的栽培形式會(huì)使其種性退化，品質(zhì)降低，產(chǎn)量下降，因此，改善品質(zhì)，提高產(chǎn)量，減少種植損耗，己成為大薯生產(chǎn)中急待解決的問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們利用組織培養(yǎng)技術(shù)恢復(fù)其品種的優(yōu)良性能，增強(qiáng)其抗御病害的能力，達(dá)到提高其產(chǎn)量，改善其品質(zhì)的目的。本發(fā)明通過(guò)外植體消毒處理一接種于萌動(dòng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷組織一愈傷組織增殖培養(yǎng)一愈傷組織分化為叢生芽一生根及成苗培養(yǎng)等流程建立了大薯離體培養(yǎng)再生體系，為大薯的工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種大薯組織培養(yǎng)再生體系的建立方法，本發(fā)明通過(guò):外植體消毒處理一接種于萌動(dòng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷組織一愈傷組織增殖培養(yǎng)一愈傷組織分化為叢生芽一生根及成苗培養(yǎng)等步驟，建立了大薯離體培養(yǎng)再生體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種大薯組織培養(yǎng)再生體系的建立方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒處理:晴天從田間取無(wú)病害大薯幼嫩莖，用自來(lái)水沖洗干凈后，用中性洗衣粉輕洗外植體。置于流水下沖洗I?2h后置于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，備用。先用75%酒精快速滅菌10?20s，然后用無(wú)菌水沖洗3?4次，接著用0.1% HgCl2*別消毒5?15min，無(wú)菌水沖洗3?5次后用無(wú)菌濾紙擦干外植體表面水分后備用。
[0006](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)消毒處理好的莖段接種于萌動(dòng)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先黑暗條件下培養(yǎng)，待種子萌發(fā)后再移至置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?20001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)萌動(dòng)率。
[0007](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)增殖情況。
[0008](4)分化培養(yǎng):將步驟(3)繼代得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)分化情況。
[0009](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(4)分化培養(yǎng)得到的無(wú)根試管苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)生根情況。
[0010](6)煉苗移栽:試管苗生根20天后，具備發(fā)達(dá)健壯的根時(shí)將組培苗不揭瓶蓋在自然光下煉苗7天。移栽時(shí)用鑷子從瓶中取出組培苗，小心洗凈基部殘留的培養(yǎng)基，選擇健壯苗移栽到消過(guò)毒的輕基質(zhì)中，澆足水，遮蔭處理。移栽后經(jīng)常噴水，保持空氣濕度。植株成活后轉(zhuǎn)入正常土壤中定植。
[0011]上述步驟(2)所述的萌動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+1.0?2.0mg/L 6-BA+ 2.0?5.0mg/L2，4-D+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0?5.0mg/L6_BA+l.0?3.0mg/LNAA+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
上述步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.1?0.5mg/LNAA+0.5?1.0mg/L6-BA+20?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1?1.0mg/LNAA+20?30g/L蔗糖+3.5?
6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:通過(guò)外植體消毒處理一接種于萌動(dòng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷組織一愈傷組織增殖培養(yǎng)一愈傷組織分化為叢生芽一生根及成苗培養(yǎng)等流程建立了大薯離體培養(yǎng)再生體系，為大薯的工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支持。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0014]實(shí)施例1
(I)外植體消毒處理:晴天從田間取無(wú)病害大薯幼嫩莖，用自來(lái)水沖洗干凈后，用中性洗衣粉輕洗外植體。置于流水下沖洗Ih后置于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，備用。先用75%酒精快速滅菌10s，然后用無(wú)菌水沖洗3次，接著用0.1% HgCl2*別消毒5min，無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙擦干外植體表面水分后備用。
[0015](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)消毒處理好的莖段接種于萌動(dòng)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先黑暗條件下培養(yǎng)，待種子萌發(fā)后再移至置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后萌動(dòng)率達(dá)到 96.8%ο 所述的萌動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+1.0mg/L 6-BA+ 2.0mg/L 2，4_D+25g/L 蔗糖 +3.5g/L瓊脂，pH為5.4。
[0016](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后增殖系數(shù)達(dá)到6.83。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0017](4)分化培養(yǎng):將步驟(3)繼代得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)分化率達(dá)到100%。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/LNAA+0.5mg/L6-BA+20g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0018](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(4)分化培養(yǎng)得到的無(wú)根試管苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后生根率達(dá)到100%。所述的