一種歐李愈傷組織再生體系的培植方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種歐李愈傷組織再生體系的培植方法。
技術(shù)背景
[0002]自從1902年德國(guó)科學(xué)家GottberIandt提出植物細(xì)胞的全能性理論后，細(xì)胞全能性研究逐漸成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，而培植在細(xì)胞全能性基礎(chǔ)上的植物組織培養(yǎng)技術(shù)從此逐漸興起和發(fā)展。近年來(lái)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)(Plant Tissue Culture)作為一種基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和基礎(chǔ)的研究手段，顯示出巨大的應(yīng)用潛力，被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、栽培學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域之中。
[0003]植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無(wú)菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體，在人工配制的環(huán)境里培養(yǎng)成完整的植株。組織培養(yǎng)技術(shù)是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興技術(shù)，其包括器官培養(yǎng)、莖尖分生組織培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等。這項(xiàng)技術(shù)已在科研和生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用，已成為舉世矚目的生物技術(shù)之一。該技術(shù)具有加速育種、縮短繁殖過(guò)程、改良品質(zhì)、節(jié)省空間、減少勞動(dòng)力、可終年生產(chǎn)、不受自然條件限制等特點(diǎn)，且組培苗的體積小，便于攜帶和資源交流，在推動(dòng)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化方面已有了巨大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益，被認(rèn)為是一項(xiàng)很有潛力的高新技術(shù)。
[0004]歐李(Prunus humilis)，薔薇科樓桃屬，多年生落葉灌木，多分枝。主要分布在的山西、山東、內(nèi)蒙古、河北、遼寧等地。歐李植株矮小，花白中透粉，果鮮艷美麗，可開(kāi)發(fā)盆景供觀賞。其根系發(fā)達(dá)，根冠比高達(dá)9:1，能夠耐受極端環(huán)境、保持水土、改良土壤、治理荒漠化，是調(diào)節(jié)生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良樹(shù)種。近幾年，鈣果種苗供不應(yīng)求。通常果樹(shù)苗木繁殖時(shí)，多采用嫁接、扦插、壓條、分株等無(wú)性繁殖的方式，但是對(duì)于鈣果不適應(yīng)這些常規(guī)的繁殖方法。鈣果結(jié)果幾年后，它原來(lái)的枝條逐漸老化死掉，在近根部重新萌發(fā)新枝，所以嫁接樹(shù)，不能保持接穗品種的連續(xù)生產(chǎn)。扦插、壓條、分株等方法，成活率低、繁殖慢。由于試材基因型、外植體類(lèi)型及其生理狀態(tài)對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑敏感程度不同，外植體高效再生成苗也相應(yīng)存在差升，
[0005]歐李是我國(guó)特色果樹(shù)，歐李種植面積越來(lái)越大，科研人員對(duì)歐李的抗逆性研究越來(lái)越多，但受制于沒(méi)有可同源轉(zhuǎn)化體系的培植，使歐李抗逆關(guān)鍵基因的功能研究不能深入開(kāi)展，因此，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)培植的的歐李組織快繁體系，還將為歐李的抗逆研究奠定可同源轉(zhuǎn)化的平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是克服一般的組織培養(yǎng)難，耗時(shí)長(zhǎng)等難題，完成了復(fù)雜的條件摸索，提供了一種可以在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)愈傷組織獲得大量的歐李愈傷組織再生體系的培植方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種歐李愈傷組織再生體系的培植方法，包括以下步驟:
[0007]步驟(I)選取歐李生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的葉片，流水沖洗30分鐘，無(wú)菌條件下，直接用體積百分比為75%乙醇對(duì)葉片表面消毒I分鐘，將葉片平均分成9等份，再用質(zhì)量百分比為1%NaClO對(duì)葉片分別滅菌I分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘，然后采用無(wú)菌水分別涮洗7次，每次I分鐘，將滅菌后的外植體接種到基礎(chǔ)鹽混合物培養(yǎng)基(MS)+30g/L蔗糖+8g//L瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上，放在每日光照18小時(shí)、黑暗6小時(shí)、溫度25 土1°C的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，7天后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率和死亡率，每組重復(fù)20個(gè)外植體，重復(fù)3次，合消毒時(shí)間為濃度為體積百分比為75%酒精4分鐘和濃度為質(zhì)量百分比1%次氯酸鈉4分鐘，統(tǒng)計(jì)獲得歐李葉片污染率最低為0.08 %和歐李葉片死亡率為39.54%；
[0008]步驟(2):取歐李生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的葉片，將消毒后的完整葉片切成lcm2(立方厘米)，莖段切成2cm(厘米)長(zhǎng)的小段，使葉片背面和莖段傷口處充分接觸到添加正交設(shè)計(jì)的不同PGR (PGR-植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，NAA-萘乙酸，6-BA芐氨基嘌呤)濃度的MS培養(yǎng)基上，設(shè)置芐氨基嘌呤的濃度梯度是:0.5mg/L、1.0mg/L,1.5mg/L、2.0mg/L;NAA-萘乙酸的濃度梯度是:0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L ； pH值為5.6-5.8，加空白對(duì)照共17個(gè)梯度的培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接種后的外植體放在溫度為25±1°C，光照強(qiáng)度為2.0klx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，15天后進(jìn)行繼代并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，每個(gè)濃度梯度選取生長(zhǎng)狀態(tài)相近的30個(gè)外植體做重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)3次，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比為:葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+30g/L蔗糖+8g/U京脂粉+1.0mg/L6-BA(6-BA-6-芐氨基嘌呤)+0.6mg/LNAA(NAA-萘乙酸)，且統(tǒng)計(jì)獲得的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到95.31%；莖段誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0.5mg6-BA_6-芐氨基嘌呤+0.8mg/NAA-萘乙酸，且統(tǒng)計(jì)獲得的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到92.21%；
[0009]步驟(3)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織，接種到添加正交設(shè)計(jì)的不同PGR濃度的MS培養(yǎng)基上，促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)，6-BA-6-芐氨基嘌呤的濃度梯度是:0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、I.25mg/L、1.5mg/L ； 2.4-天-2.4-二氯苯氧乙酸的濃度梯度是:0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L;加空白對(duì)照共21個(gè)梯度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)15個(gè)梯度后進(jìn)行繼代，并統(tǒng)計(jì)的愈傷組織的生長(zhǎng)狀況，每組重復(fù)50個(gè)愈傷組織，統(tǒng)計(jì)獲得誘導(dǎo)愈傷組織增殖的培養(yǎng)基為MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0.5mg/6-BA-6-芐氨基嘌呤+0.6mg/2.4-二氯苯氧乙酸；
[0010]步驟(4)將外植體上誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織切成小塊，轉(zhuǎn)接到分化芽的MS培養(yǎng)基上，6-BA(6-BA_6-節(jié)氨基嘌呤)的濃度梯度是:2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L ； NAA (NAA-萘乙酸)的濃度梯度是:0.lmg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L;加空白對(duì)照共21個(gè)梯度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)30天后進(jìn)行繼代，并統(tǒng)計(jì)的愈傷組織分化芽數(shù)量，每組重復(fù)40個(gè)愈傷組織，誘導(dǎo)愈傷組織生芽的培養(yǎng)基為MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+5.0mg/芐氨基嘌呤+0.9mg/萘乙酸；
[0011]步驟(5)將愈傷組織誘導(dǎo)生芽獲得歐李芽切下，豎直接種到添加正交設(shè)計(jì)的不同PGR濃度的MS和I /2MS培養(yǎng)基上，NAA (NAA-萘乙酸)的濃度梯度是:Omg/L、0.lmg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7、0.9mg/L ； IBA(IBA-卩引噪丁酸)的濃度梯度是:Omg/L、0.lmg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7 mg/L、0.9mg/L；共24個(gè)梯度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)30d后進(jìn)行繼代，并統(tǒng)計(jì)不同處理中芽的生根率，每個(gè)濃度梯度選取生長(zhǎng)狀態(tài)相近的30個(gè)幼芽做重復(fù)試驗(yàn)，芽誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為l/2MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0.5mg/萘乙酸；
[0012]步驟(6)待生根的無(wú)菌苗根長(zhǎng)長(zhǎng)到3-5cm即可煉苗、移栽。
[0013]本發(fā)明歐李(懷柔)離體組培快繁體系培植方法主要具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn):
[0014]1、縮短繁殖過(guò)程:繁殖速度快、繁殖系數(shù)大:用快繁技術(shù)繁殖，可節(jié)約繁殖材料，只取原材料上的一小塊組織就能在短期內(nèi)生產(chǎn)出大量市場(chǎng)所需的優(yōu)質(zhì)苗木，每年可以繁殖出幾萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)的小植株，既不損傷原材料又可獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)選明取歐李生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的葉片和莖段，將消毒后的完整葉片切成Icm2(立方厘米)，莖段切成2cm長(zhǎng)的小段，使葉片背面和莖段傷口處充分接觸到添加正交設(shè)計(jì)而獲得的最優(yōu)化的不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGR)濃度配比的MS培養(yǎng)基上，通過(guò)繼續(xù)的愈傷分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量的無(wú)菌組培苗。相較扦插等傳統(tǒng)方法要快，且用時(shí)短。更為重要的是，以往見(jiàn)諸于報(bào)道的研究，包括相關(guān)的專(zhuān)利研究，僅是利用直接誘導(dǎo)的方法試圖快繁，但歐李的抗逆性研究越來(lái)越多，但卻受制于沒(méi)有可同源轉(zhuǎn)化體系的培植，使歐李抗逆關(guān)鍵基因的功能研究不能深入開(kāi)展，傳統(tǒng)的快繁衍技術(shù)不能解決可同源轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因進(jìn)而進(jìn)行功能研究的問(wèn)題。因此，本發(fā)明通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)培植的歐李組織快繁體系，將為歐李的抗逆研究奠定可同源轉(zhuǎn)化的平臺(tái)。
[0015]2、采用愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)，具有分化程度低，再生能力強(qiáng)的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的直接誘導(dǎo)根莖的方法，繁殖率低，成本高，且后代均一性不好。通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)，能保持原有品種的優(yōu)良性狀。對(duì)保質(zhì)、保純有著特殊作用?？色@得大量的統(tǒng)一規(guī)格、高質(zhì)量的苗木，苗木商品性好，成本低。
[0016]3、本發(fā)明中愈傷組織的誘導(dǎo)是發(fā)明中的關(guān)鍵，不同的材料