一種茖蔥快速繁殖方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農業(yè)技術領域，具體涉及一種茗蔥快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002] 植物組織培養(yǎng)技術是以植物生理學為基礎發(fā)展起來的一門新興技術，是指在無菌 條件下，將離體的植物器官、組織、細胞、原生質體在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的條件 進行培養(yǎng)，誘導產生愈傷組織或不定芽等，或者長成完整植株的過程。該技術自20世紀初 建立以來，在理論研究和應用技術上不斷發(fā)展，已廣泛應用于植物的快速繁殖、品種改良、 基因工程育種、種質資源保存、次生代謝產物生產等方面，產生了巨大的經濟效益和社會效 益，對現代農業(yè)和醫(yī)藥等領域產生了深刻影響。
[0003] 茗蔥，又名寒蔥，為百合科蔥屬的植物，多年生草本。近年來，國內外許多學者從茗 蔥中分離出許多化學成分，主要為含硫化合物、黃酮類化合物、莆體化合物及糖類，并對這 些化學成分的藥理方面展開了研究。經試驗驗證了其中一些化學成分對預防血栓、動脈硬 化、腦梗塞有良好的作用效果。并且，由于茗蔥蔥香味濃，略帶爽口野味，口感極佳。加之其 內含物有顯著的藥理作用，既能作美味見于餐桌，又是沒有副作用的天然保健食品。在日本 和韓國的市場上，茗蔥是極受歡迎的蔬菜之一。但是，目前我國關于茗蔥的引種馴化還鮮有 報道。野生茗蔥生長于海拔1，000米至2, 500米的地區(qū)，常生長在草地、林下、陰濕山坡或 溝邊。由于對野生茗蔥的掠奪式采摘，造成這一野生資源正面臨著枯竭，加之野生茗蔥生長 受氣候等條件的限制，遠遠不能滿足和市場需要。
[0004] 茗蔥的繁殖較難，同大多數蔥屬植物相同，其繁殖方式也可分為有性繁殖與無性 繁殖。研究表明，用鱗莖種植要比用種子繁殖好，因為用種子繁殖需要3-5年才能采摘食 用，并且種子的生命活力降低很快，發(fā)芽困難、發(fā)芽率較低，而用鱗莖繁殖可以提高鱗莖產 量；目前國外學者提出了用組織培養(yǎng)的方法進行繁殖，并且研究得較為深入，但因其費用較 高，還不能在生產上大量應用。因此，如何短時間內快速大量繁殖茗蔥成為茗蔥產業(yè)化生產 的關鍵。
[0005] 利用組織培養(yǎng)技術對茗蔥進行組培快繁，能夠實現茗蔥在短時間內的快速增殖， 但是增殖率的高低是決定茗蔥能否通過組培快繁途徑進行工廠化生產的瓶頸，因此發(fā)明一 種茗蔥快速繁殖的方法是從根本解決上述問題的有效途徑。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決茗蔥生長周期長，且組培快繁增殖效率不高，難以滿足 大規(guī)模生產的問題，而提供一種茗蔥快速繁殖方法。
[0007] 一種茗蔥快速繁殖方法，它包括： 1)茗蔥鱗莖盤的獲得 取茗蔥鱗莖，去除茗蔥須根，剝除外層鱗片，保留以中心生長點為中心，直徑為0. 4-lcm 的鱗莖盤及其上部包裹的鱗片，獲得茗蔥的中心部位； 將茗蔥中心部位沖洗，消毒，用濾紙吸干水分； 經過外植體滅菌后，在中心部位距底端3 - 5mm處橫切并去除上部鱗片，沿主生長點垂 直切線方向，縱向分割成4份，去除主生長點及主生長點所在的鱗莖盤，分別培養(yǎng)； 2) 茗蔥鱗莖盤增殖 以 MS 為基礎培養(yǎng)基，添加 6-BA 0. 5-2. O mg/L、NAA 0. 05-0. 5 mg/L，PH 調節(jié)至 5. 8,誘 導叢生芽； 3) 繼續(xù)培養(yǎng)成種植苗； 所述的切割成4份，是以主生長點兩條垂直的切線為切口，進行切割，切成4份，其中 只有一個1/4份切塊帶有主生長點所在的鱗莖盤，剝掉其主生長點和主生長點所在的鱗莖 盤； 所述的1/4份鱗莖盤上部的鱗片基部再進行切割，至遠主生長點端高，近主生長點端 低的斜面。
[0008] 所述的6-BA和NAA的添加量分別為I. 0 mg/L和0· I mg/L ; 步驟3)所述的繼續(xù)培養(yǎng)成苗，是以MS為基礎培養(yǎng)基，添加 NAA 0. 1-1 mg/L，PH調節(jié) 至5. 8 ;將叢生苗接種于生根培養(yǎng)基中，3周后叢生苗生根；將生根后的叢生苗分割成單株， 接種于壯苗培養(yǎng)基中，獲得茗蔥種苗；種苗經馴化后，種植； 所述的茗蔥中心部位消毒，用75%酒精浸泡消毒Imin后，隨后用1% NaClO溶液浸泡 消毒 15- 20min。
[0009] 本發(fā)明提供了一種茗蔥快速繁殖方法，將茗蔥中心部位清洗、消毒。經過外植體滅 菌后，在中心部位距底端3 - 5mm處橫切并去除上部鱗片，沿主生長點垂直切線方向，縱向 分割成4份，去除主生長點及主生長點所在的鱗莖盤，誘導叢生芽，并培養(yǎng)成苗，通過上述 培養(yǎng)過程的優(yōu)化建立了茗蔥鱗莖盤快速繁殖體系，獲得了大量的茗蔥試管苗，該體系增殖 時間短，增殖系數大，遺傳穩(wěn)定性高，通過該體系能夠實現茗蔥的快速繁育，實現茗蔥產業(yè) 的種植。
【附圖說明】
[0010] 圖1不同激素組合對分蘗洋蔥莖尖增殖的影響（a :分蘗洋蔥莖尖；b :莖尖在 6-BA、NAA組合中的增殖情況；c :莖尖在6-BA、IAA中的增殖情況）； 圖2分蘗洋蔥鱗莖盤的獲得； 圖3分蘗洋蔥試管微鱗莖盤切割步驟流程； 圖4分蘗洋蔥試管微鱗莖盤切割步驟流程示意圖； 圖5.分蘗洋蔥試管鱗莖盤增殖（a :分蘗洋蔥試管微鱗莖盤；b :第2周顯微鏡下觀察到 的增殖情況；c :第3周叢生芽增殖、生長情況；d :第4周叢生芽增殖、生長情況）； 圖6.分蘗洋蔥試管苗壯苗培養(yǎng)（a :分蘗洋蔥試管增殖叢生苗；b :單株分蘗洋蔥試管 苗；c :壯苗培養(yǎng)后的試管苗）； 圖7茗蔥中心部位的獲得； 圖8茗蔥鱗莖盤的獲得； 圖9茗蔥鱗莖盤增殖苗的獲得； 圖10茗蔥增殖苗生根； 圖11大蒜鱗莖盤的獲得； 圖12大蒜鱗莖盤接種； 圖13大蒜鱗莖盤增殖。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1分蘗洋蔥莖尖增殖 將分蘗洋蔥莖尖分別接種于不同濃度的6-BA、NAA組合，6-BA、IAA組合培養(yǎng)基中（表 1 )，兩種激素組合均能夠獲得分蘗洋蔥試管增殖苗，但相同濃度的IAA和NAA在進行增殖誘 導時，差異很大。其中在6-BA、NAA激素組合中誘導的增殖苗長勢較好，且分化系數較高，在 培養(yǎng)4周時，平均增殖系數可達3. 87 ;6-BA、IAA激素組合雖然也能夠實現莖尖增殖，但所獲 得的增殖苗細、弱，分化系數低，且有白化苗出現(如圖1)?？梢姡琁AA的作用效果不如NAA。 因此確定MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. lmg/L培養(yǎng)基為莖尖增殖最佳培養(yǎng)基。
注：MS為基礎培養(yǎng)基。
[0013] 實施例2分蘗洋蔥鱗莖盤增殖 取分蘗洋蔥一枚，去除分蘗洋蔥鱗莖盤木栓化的部位，保留以中心生長點為中心，直徑 為0. 4-lcm的鱗莖盤及其上部包裹的鱗莖，得到分蘗洋蔥中心部位。將分蘗洋蔥中心部位 用流水沖洗0. 5 h，用75%酒精浸泡消毒I min后，隨后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20 min，無菌水沖洗3-5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分備用（如圖2)。
[0014] 然后去除上部鱗莖，保留包含主生長點在內的鱗莖盤，將鱗莖盤切割成4份后去 除主生長點及主生長點鱗莖盤，分別接種于以MS為基礎培養(yǎng)基，添加 6-BA (0. 2-0. 8 mg/ L)、NAA (0. 1-2. Omg/L)，PH調節(jié)至5. 8的增值培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導叢生芽。在25°C、光照 時間為16h、光照強度為25001ux條件下，經過4周的誘導，以6-BA、NAA組合誘導效果最好； 6-BA、IAA組合也能誘導出叢生芽，但增殖系數低，再生苗存在畸形苗。其中鱗莖盤在添加 6-BAO. 6mg/L、NAAO. lmg/L的培養(yǎng)基中，4周后，分化數達到最大值，每個鱗莖盤最大增殖系 數(增殖系數=分化芽總數/接種數)可達20 (見表2)。隨著誘導時間的增加，鱗莖盤分化 數增加，但在誘導第4周后鱗莖盤分化數不再增加，鱗莖盤的分化率達最大值(見表3)。
注：MS為基礎培養(yǎng)基。
[0017] 實施例3分蘗洋蔥脫毒苗試管結球 取分蘗洋蔥莖尖部位，流水沖洗半小時，用75%酒精浸泡消毒Imin后，隨后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20min，無菌水沖洗3-5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分 備用，顯微鏡下剝離分蘗洋蔥莖尖生長點〈0. 3mm部分，在以MS為基礎培養(yǎng)基，添加 6-BA、 IAA的啟動培養(yǎng)基中誘導成苗。
[0018] 莖尖成苗后，分別以蔗糖為基礎碳源設置30mg/L、45mg/L、60mg/L、75mg/L、90mg/ L共5個碳源糖濃度，探討不同糖濃度對分蘗洋蔥試管苗結球的影響，篩選最佳結球培養(yǎng)基 中糖濃度，通過培養(yǎng)發(fā)現，隨著糖濃度的增加鱗莖結球直徑、鮮重增加。當糖濃度高于75 mg/L時，結球速度加快但影響根的生長，導致最終鱗莖平均直徑、鮮重降低(見表4)。
[0019] 在脫毒苗結球培養(yǎng)過程中，通過對培養(yǎng)晝夜溫差的調控，調節(jié)試管苗的結球速度， 針對分蘗洋蔥生長的適宜溫度分別設置25°C /25°C、25°C /20°C、25°C /15°C共3組晝夜溫 度處理，篩選最佳培養(yǎng)溫度。在晝夜溫差為KTC時鱗莖直徑和鱗莖鮮重要優(yōu)于其他處理。 由此確定在分蘗洋蔥脫毒苗結球過程中，最佳培養(yǎng)溫度為白天25°C，夜間15°C (見表5)。
[0020] 在脫毒苗結球培養(yǎng)過程中，通過對培養(yǎng)過程中的光照強度、光周期的調控，調節(jié) 試管苗的結球速度，針對分蘗洋蔥生長條件分別設置3組光照強度、光周期處理。結果表 明，隨光照強度和光照時間的延長，試管球的平均直徑和鱗莖鮮重逐步增加，在光照強度為 25001u X，16h光照、8h黑暗條件時有利于分蘗洋蔥脫毒試管苗結球，其試管球鱗莖平均直 徑、鱗莖