一種油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，依次包括以下步驟1）外植體的消毒：剪取油點(diǎn)草莖段，清洗后消毒，接種到添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中；2）腋芽的誘導(dǎo)；3)叢生芽的誘導(dǎo)；4）不定芽的增殖和壯苗；5）不定芽的生根培養(yǎng)；6）再生苗的煉苗和移栽。在上述步驟中采用了不同成分和配比的培養(yǎng)基。采用本發(fā)明方法，油點(diǎn)草莖段腋芽誘導(dǎo)率達(dá)98.7%，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)88.3%，不定芽增殖倍數(shù)達(dá)5.4，幼苗生根率為96.6%以上，植株煉苗成活率為97.5%以上，移栽成活率達(dá)98%以上，按此方法，每年可以繁殖超過100萬株幼苗。
【專利說明】
一種油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速繁殖的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油點(diǎn)草(Tricyrtis macropoda Miq.)，又名粗柄油點(diǎn)草、粗軸油點(diǎn)草，是百合科 (Liliaceae)油點(diǎn)草屬(Tricyrtis)多年生草本植物，產(chǎn)浙江、江西、福建、安徽、江蘇、湖北、 湖南、廣東、廣西和貴州等地。生于山地林下、草叢中或巖石縫隙中。其根或全草入藥，名紅 酸七，也叫白七、牛尾參、水揚(yáng)羅，其性平，味甘，具補(bǔ)肺止咳之功效，主治肺虛咳嗽;其花被 片綠白色或白色，內(nèi)面具多數(shù)紫紅色斑點(diǎn)，具有良好的觀賞價(jià)值，有待于商業(yè)化。油點(diǎn)草屬 植物在全世界約15種，國內(nèi)有4種，分別為臺(tái)灣油點(diǎn)草（T . Formosana)、油點(diǎn)草（T . Macropoda)、黃花油點(diǎn)草(T. Maculata)、紫花油點(diǎn)草(T. Stolonifera)，目前尚未有該屬 植物的組織培養(yǎng)快速繁殖的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種成活率高，利 于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速 繁殖的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 油點(diǎn)草的消毒 4月至8月之間，剪取帶腋芽的莖段，先用軟毛刷于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔 精溶液浸泡2 min，傾倒洗潔精溶液后用流水沖洗0.5 h后，在紫外燈消毒30 min以上的超 凈工作臺(tái)里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用無菌水沖洗3次，浸泡入滴加有2滴 吐溫-80的0.1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒11-13 min，然后用無菌水充分浸洗3次，即可得到消 完毒的外植體； (2) 腋芽的誘導(dǎo) 將上一步得到的的外植體，以正常的極性方向插入到裝有添加 NAA 0.1-0.5 g/L，6-BA 1.0-5.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加 量為8 g/L，活性炭的添加量為0-2.0 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°(：下高溫高壓滅菌 20 min;接種好的培養(yǎng)瓶先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25± 1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度為30-40 ymol/(m2.s)，光源為白色節(jié)能燈； (3) 叢生芽的誘導(dǎo) 待上一步培養(yǎng)的腋芽長出后，在紫外燈滅菌30 min的超凈工作臺(tái)里切下帶腋芽的莖 段，以正常的極性方向接種到裝有添加 TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基 的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量 為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨 后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25± 1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ymol/(m2 · s)，光源為白色節(jié)能燈； (4) 不定芽的增殖 將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢切成2-3株不定芽的芽塊，接種到裝有添加6-84 0_ 6.0mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/ L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°C下高 溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（25±1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ym〇l/(m2.s)，光源為白色節(jié)能燈； (5) 再生植株的生根培養(yǎng) 切取葉片嫩綠、生長旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加 NAA 0-1.0 mg/L，AC 0.5 mg的12.5%-100% MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為10-50 g/L，瓊脂 添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓 滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光照 時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ym〇l/(m2 · s); (6) 煉苗移栽 待生根的組培苗的苗高長至5 cm以上，根長超過5 cm時(shí)，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中注 入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶蓋， 讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d;然后小心地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水浸潤根部過 夜后，小心將殘留的瓊脂沖洗干凈，將植株定植于珍珠巖、泥炭重量比為1:(1-5)的混合基 質(zhì)中，澆透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在15-25Γ，光源 可采用自然光或白色節(jié)能燈;第8 d松開薄膜，使與外面空氣相通，第9 d揭開薄膜，經(jīng)常于 葉面噴霧保持濕潤，適應(yīng)3-5 d后可移栽大田中。
[0005] 作為優(yōu)選方案:用于叢生芽誘導(dǎo)的材料為步驟(1)和(2)獲得的無菌萌發(fā)的腋芽。
[0006] 作為優(yōu)選方案:所述步驟（2)中MS基本培養(yǎng)基中添加了6-BA 4.0 mg/L，NAA 0.2 mg/L，活性炭0.5 mg/L。
[0007] 作為優(yōu)選方案:所述步驟（3)中MS基本培養(yǎng)基中添加了TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L〇
[0008] 作為優(yōu)選方案:所述步驟(4)中MS基本培養(yǎng)基中添加了6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L〇
[0009] 作為優(yōu)選方案:所述步驟(5)中的生根培養(yǎng)基為50%MS基本培養(yǎng)基，NAA 0.2 mg/L， 鹿糖 15-20 g/L。
[0010] 作為優(yōu)選方案:所述步驟(6)中混合基質(zhì)中珍珠巖與泥炭的重量比為1:2-3。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的有益效果是:采用本發(fā)明的方法，能夠快速地獲得植 株，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明方法，油點(diǎn)草莖段腋芽誘導(dǎo)率達(dá)98.7%，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá) 88.3%，不定芽增殖倍數(shù)達(dá)5.32，幼苗生根率為96.6%以上，幼苗煉苗成活率達(dá)97.5%以上，植 株移栽成活率達(dá)98%以上，按此方法，在一年內(nèi)可繁殖出幼苗超過100萬株。
【具體實(shí)施方式】 [0012] 實(shí)施例1 本實(shí)施例提供一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，包括以下步驟： (1) 油點(diǎn)草的消毒 4月至8月之間，剪取帶腋芽的莖段，先用軟毛刷于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔 精溶液浸泡2 min，傾倒洗潔精溶液后用流水沖洗0.5 h后，在紫外燈消毒30 min以上的超 凈工作臺(tái)里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用無菌水沖洗3次，浸泡入滴加有2滴 吐溫-80的0.1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒11-13 min，然后用無菌水充分浸洗3次。經(jīng)此步驟消 毒的外植體，接種培養(yǎng)基20 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其污染率3.3%，成活率在92.5%; (2) 腋芽的誘導(dǎo) 將上一步得到的的外植體，以正常的極性方向插入到裝有添加 NAA 0.2 g/L，6-BA 4.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為8 g/ L，活性炭(AC)的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌20 min;接種好的培養(yǎng)瓶先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25±1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度為30-40 ymol/(m2*s)，光源為白色節(jié)能燈;最早 培養(yǎng)5 d后腋芽出現(xiàn)明顯的萌動(dòng)，平均出現(xiàn)萌動(dòng)的時(shí)間為8.2 d;30 d統(tǒng)計(jì)腋芽的萌發(fā)率達(dá) 98.7%； (3) 叢生芽的誘導(dǎo) 待上一步培養(yǎng)的腋芽長出后，在紫外燈滅菌30 min的超凈工作臺(tái)里切下帶腋芽的莖 段，以正常的極性方向接種到裝有添加 TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培 養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 μ mol/(m2*s)，光源為白色節(jié)能燈;在培養(yǎng)9 d時(shí)節(jié)間膨大起來，14 d開始出現(xiàn)叢生芽，30 d 統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率為88.3%; (4) 不定芽的增殖 將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢切成2-3株不定芽的芽塊，以正常的極性方向接種到裝 有添加6-BA 2.0mg/L，IAA 1.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加 量為30 g/L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于 121°C下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為 (25±1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ym〇l/(m2.S)，光源為白色節(jié)能 燈;30 d統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖倍數(shù)為5.4，不定芽的生長正常，葉色濃綠； (5) 再生植株的生根培養(yǎng) 切取葉片嫩綠、生長旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加 NAA 0.2 mg/L，AC 0.5 mg 的50% MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為15-20 g/L，瓊脂添加量為 8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°(：下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25±1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ymol/(m2.s);生根最早在培養(yǎng)8-9 d后出現(xiàn)，30 d統(tǒng)計(jì)后發(fā) 現(xiàn)平均出根時(shí)間為10.5 d以下，生根率為96.6%以上； (6) 煉苗移栽 待生根的組培苗的苗高長至5 cm以上，根長超過5 cm時(shí)，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中注 入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶蓋， 讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d;然后小心地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水浸潤根部過 夜后，小心將殘留的瓊脂沖洗干凈，將植株定植于珍珠巖、泥炭重量比為1:2-3的混合基質(zhì) 中，澆透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在15-25Γ，光源可 采用自然光或白色節(jié)能燈;第8 d松開薄膜，使與外面空氣相通，第9 d揭開薄膜，經(jīng)常于葉 面噴霧保持濕潤，適應(yīng)5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)煉苗成活率為97.5%以上，煉好苗后，小心挖出移栽入 大田，按常規(guī)管理，移栽成活率可達(dá)98%以上。
[0013]文中涉及的縮略詞： 6-BA 6-芐氨基腺嘌呤 AC 活性炭 IAA吲哚乙酸 NAA萘乙酸 TDZ噻苯隆(脫葉脲） MS Murashige和Skoog(1962) 實(shí)施例2 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟(2)腋芽的誘導(dǎo)：以正常的極性方向插入到裝有添 加 NAA 0.1-0.6 mg/L，6-BA 1.0-6.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖 添加量為30 g/L，瓊脂添加量為8 g/L，AC添加量為0-2.0 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于 121°C下高溫高壓滅菌20 min;接種好的培養(yǎng)瓶先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條 件為：培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度為30-40 ym〇l/(m2· s )，光源為白色節(jié)能燈;30 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，腋芽誘導(dǎo)率在0-98.7%之間，腋芽出芽平均時(shí)間為 7.9-14.6 d之間，其中以NAA 0.2 mg/L，6-BA 4.0 mg/L，AC 0.5 g/L效果最佳，腋芽誘導(dǎo)率 為98.7%，腋芽出芽平均時(shí)間為8.2 d。結(jié)果還表明隨著6-BA濃度提高，腋芽誘導(dǎo)率增加，隨 著NAA濃度增加，腋芽生長速度加快。腋芽在萌發(fā)過程中可看到外植體周圍的培養(yǎng)基產(chǎn)生褐 色，而AC可去除褐化物質(zhì)，但過多的AC卻吸附過多營養(yǎng)，易導(dǎo)致生長的減緩。
[0014]表1不同處理對(duì)腋芽誘導(dǎo)率和腋芽出芽平均時(shí)間的影響
實(shí)施例3 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟(3)叢生芽的誘導(dǎo):在紫外燈滅菌30 min的超凈工 作臺(tái)里切下帶腋芽的莖段，以正常的極性方向接種到裝有添加 TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0- 6.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為 8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°(：下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25±1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ymol/(m2.s)，光源為白色節(jié)能燈。30 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不定芽 誘導(dǎo)率介于0-92.6%之間，不定芽數(shù)為1.0-7.5之間，其中以MS，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/ L效果最佳，不定芽誘導(dǎo)率在88.3%，不定芽數(shù)在6.6，而且不定芽葉色濃綠，生長良好，株高 和莖粗適中。結(jié)果還表明，6-BA對(duì)于叢生芽的誘導(dǎo)效果較弱，TDZ較強(qiáng)，兩者組合效果更佳。
[0015] 表2不同處理對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響
實(shí)施例4 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟(4)叢生芽的增殖:將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢 切成2-3株不定芽的芽塊，接種到裝有添加6-BA 0-6.0mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培養(yǎng) 基的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加 量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜， 隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為（25 ± 1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度 30-40 ymol/(m2*s)，光源為白色節(jié)能燈。30 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，各培養(yǎng)基中不定芽的增殖倍數(shù) 在1.0-6.7之間，高的生長素和細(xì)胞分裂素均容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，表現(xiàn)最佳的培養(yǎng)基為 MS，6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L其增殖倍數(shù)在5.4,且無玻璃化苗，植株粗壯，且生長較 快。
[0016] 表3不同處理對(duì)不定芽增殖的影響
實(shí)施例5 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟(5)再生植株的生根培養(yǎng):切取葉片嫩綠、生長旺 盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加 NAA 0-1.0 mg/L，活性炭0.5 mg/L的12.5%-100% MS基 本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為10-50 g/L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性 炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑 暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25 ± 1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗， 光照強(qiáng)度30-40 ymol/(m2.s);30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，最早生根時(shí)間8-10 d，生根率在62.5-97.2%，說明較易生根，MS基本培養(yǎng)基的濃度對(duì)于生根基本無影響，只不過太低的濃度下生 根的再生植株生長柔弱；蔗糖濃度對(duì)于不定芽的生根影響也不大;最佳的組合為50%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L，生根時(shí)間早，最早8 d就可以生根，生根率可達(dá)96.6%以上，根粗 適中，葉綠濃綠，適于煉苗移栽。
[0017] 表4不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響
實(shí)施例6 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟(6)煉苗移栽:待生根的組培苗的苗高長至5 cm以 上，根長超過5 cm時(shí)，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中注入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移 開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶蓋，讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d;然后小心 地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水浸潤根部過夜后，小心將殘留的瓊脂沖洗干凈，將植 株定植于珍珠巖、泥炭重量比為1:(1-5)的混合基質(zhì)中，澆透水并用透明的聚乙烯塑料薄 膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在15-25Γ，光源可采用非直射性自然光或白色節(jié)能燈； 第8 d松開薄膜，使與外面空氣相通，第9 d揭開薄膜，經(jīng)常于葉面噴霧保持濕潤，適應(yīng)3-5 d 后可移栽大田中。適應(yīng)5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，隨著泥炭的比例提高，幼苗的生長變得健壯，但煉苗 成活率卻有小幅下降，這主要是因?yàn)檎渲閹r在培養(yǎng)基中起到保水透氣的作用，而泥炭提供 幼苗生長所需的營養(yǎng)。綜合來看，珍珠巖與泥炭的比例在1:2-3時(shí)，煉苗成活率和幼苗生長 達(dá)到最佳。
[0018] 表5不同栽培基質(zhì)對(duì)煉苗成活率的影響
對(duì)比實(shí)施例1至6可知，實(shí)施例1為最優(yōu)選的實(shí)施例，實(shí)施例1的每個(gè)步驟均采用了實(shí)施 例2至6所述的最佳培養(yǎng)條件，能夠獲得最高的植株產(chǎn)量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種油點(diǎn)草組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步驟： (1)油點(diǎn)草的消毒 4月至8月之間，剪取帶腋芽的莖段，先用軟毛刷于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔 精溶液浸泡2 min，傾倒洗潔精溶液后用流水沖洗0.5 h后，在紫外燈消毒30 min以上的超 凈工作臺(tái)里將莖段轉(zhuǎn)入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用無菌水沖洗3次，浸泡入滴加有2滴 吐溫-80的0.1% HgCl2溶液內(nèi)浸泡消毒11-13 min，然后用無菌水充分浸洗3次，即可得到消 完毒的外植體； 腋芽的誘導(dǎo) 將上一步得到的的外植體，以正常的極性方向插入到裝有添加祖六0.1-0.611^/1，6-BA 1.0-6.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添 加量為8 g/L，活性炭的添加量為0-2.0 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°(：下高溫高壓滅 菌20 min;接種好的培養(yǎng)瓶先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25 ±1)°C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度為30-40 ym〇l/(m2.s)，光源為白色節(jié)能燈； (3) 叢生芽的誘導(dǎo) 待上一步培養(yǎng)的腋芽長出后，在紫外燈滅菌30 min的超凈工作臺(tái)里切下帶腋芽的莖 段，以正常的極性方向接種到裝有添加 TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基 的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量 為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨 后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25± 1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30_ 40 ymol/(m2 · s)，光源為白色節(jié)能燈； (4) 不定芽的增殖 將上一步誘導(dǎo)獲得的不定芽叢切成2-3株不定芽的芽塊，接種到裝有添加6-BA 0-6.0 mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為30 g/L，瓊 脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0,培養(yǎng)基曾于121°C下高溫高 壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為（25±1)°C，光 照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ym〇l/(m2.s)，光源為白色節(jié)能燈； (5 )再生植株的生根培養(yǎng) 切取葉片嫩綠、生長旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加 NAA 0-1.0 mg/L，活性炭 0.5 mg/L的12.5%-100% MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)基中的蔗糖添加量為10-50 g/ L，瓊脂添加量為8.0 g/L，活性炭的添加量為0.5 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)基曾于121°C下高 溫高壓滅菌20 min;先置于黑暗中過夜，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（25±1) °C，光照時(shí)間為14 h光/10 h暗，光照強(qiáng)度30-40 ym〇l/(m2.s); (6)煉苗移栽 待生根的組培苗的苗高長至5 cm以上，根長超過5 cm時(shí)，松開組培瓶的瓶蓋，往瓶中注 入少量清水，防止培養(yǎng)基干裂，但先不移開瓶蓋，12 h后半挪開瓶蓋，再過12 h，移走瓶蓋， 讓燈光直照再生植株培養(yǎng)2 d;然后小心地將培養(yǎng)基搗碎，拿出再生植株，用水浸潤根部過 夜后，小心將殘留的瓊脂沖洗干凈，將植株定植于珍珠巖、泥炭重量比為1:(1-5)的混合基 質(zhì)中，澆透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆蓋以保溫保濕，室內(nèi)溫度控制在15-25Γ，光源 可采用自然光或白色節(jié)能燈;第8 d松開薄膜，使與外面空氣相通，第9 d揭開薄膜，經(jīng)常于 葉面噴霧保持濕潤，適應(yīng)3-5 d后可移栽大田中。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于：用于叢生芽誘 導(dǎo)的材料為經(jīng)步驟(1)和(2)獲得的無菌萌發(fā)的腋芽，長度為2 cm左右。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于:所述步驟(2) 中MS基本培養(yǎng)基中添加了6-BA 4.0 mg/L，NAA 0.2 mg/L，活性炭0.5 mg/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于:所述步驟(3) 中MS基本培養(yǎng)基中添加了TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于:所述步驟(4) 中MS基本培養(yǎng)基中添加了6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于:所述步驟(5) 中的生根培養(yǎng)基為25-50%MS基本培養(yǎng)基，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法，其特征在于:所述步驟(6) 中混合基質(zhì)中珍珠巖與泥炭的重量比為1:2-3。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105830928SQ201610291158
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月5日
【發(fā)明人】黃蘇紅, 張進(jìn)杰, 李曉暉, 周偉, 黃文娟
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)