一種茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)誘導單倍體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)誘導單倍體的方法。通過體系優(yōu)化，單倍體誘導率提高至71%。選取生長在晝夜溫差10℃的健壯植株花蕾在添加了2mg/LKT的MS培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)。6天后從花藥中部切割，避免擠壓、離心等操作，使小孢子自然游離于液體培養(yǎng)基中，同時將花藥殘體保留在添加0.2mg/L2,4?D、1mg/LKT、1mg/L6BA 和5%葡萄糖的KM培養(yǎng)基中與游離出的小孢子共培養(yǎng)?；ㄋ幹胁亢图獠坑邪咨鷤M織長出后，切下愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加了0.01mg/LNAA、2mg/L6?BA、2%蔗糖、5g/L瓊脂和0.5g/L活性炭的MS培養(yǎng)基中，在弱光環(huán)境下進行分化培養(yǎng)。愈傷組織轉(zhuǎn)綠出芽后進行繼代和生根培養(yǎng)，該方法可克服基因型影響，提高了茄子單倍體誘導率。
【專利說明】
一種前子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)誘導單倍體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于茄子自然游離小孢子與花藥共 培養(yǎng)克服基因型影響，通過游離小孢子經(jīng)愈傷組織途徑獲得單倍體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單倍體育種是進行種質(zhì)資源創(chuàng)新并快速固定優(yōu)良性狀的最佳途徑，具有育種周期 短、選擇效率高、克服遠緣雜不親和等優(yōu)點。特別是小孢子單倍體誘導技術(shù)，近年來已成為 育種工作者研究的熱點。與十字花科蔬菜比較，茄果類蔬菜小孢子培養(yǎng)難度大，大多實驗停 留在愈傷組織或類胚狀體階段，成功應用的報道較少。本專利在前人研究的基礎(chǔ)上進行了 大量優(yōu)化調(diào)整，旨在克服基因型影響，并進一步提高有效出愈率和成苗率，最終達到應用水 平。本課題現(xiàn)在已通過花藥看護培養(yǎng)使小孢子培養(yǎng)愈傷組織有效出愈率和成苗率由原來的 7%提高到了41%。經(jīng)檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)基于茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)可克服基因 型影響，最終通過游離小孢子經(jīng)愈傷組織途徑獲得單倍體的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明公開了一種基于茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)克服基因型影響，通過 游離小孢子經(jīng)愈傷組織途徑獲得單倍體的方法，其特征在于如下的步驟進行： 1) 種植環(huán)境:花蕾所在前子植株為人工氣候箱或是保護地栽培，夜間溫度為15 °C，晝夜 溫差達到10°C-20°C，植株健壯無病蟲害； 2) 花蕾標準:花蕾采集標準為花冠與萼裂處齊平，對茄至八面風節(jié)位，內(nèi)部花藥為黃綠 色，且花冠包裹緊密。采集花蕾后用牛皮紙袋包好放置在4°C冰箱24小時后開始進行花藥預 培養(yǎng)； 3) 預培養(yǎng)特點：預培養(yǎng)基為添加了2mg/LKT(激動素）的MS培養(yǎng)基，pH 5.8,花藥預培養(yǎng) 后放置于36 °C光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)6天； 4) 自然游離與共培養(yǎng):機械切割花藥，避免擠壓和離心，使小孢子自然游離于液體培養(yǎng) 基中，同時將花藥殘體保留在液體培養(yǎng)基中與游離出的小孢子進行共培養(yǎng)； 培養(yǎng)基為添加了 〇. 2mg/L2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸）、lmg/LKT (激動素）、lmg/L6-BA( 6-芐氨基腺嘌呤)和5%葡萄糖的KM培養(yǎng)基，PH 5.8; 5) 培養(yǎng)條件:小孢子培養(yǎng)條件為25°C暗培養(yǎng)60-90天，當花藥中部和尖部有白色愈傷 組織長出，達到3毫米以上直徑就可轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中25°C弱光培養(yǎng);所述的分化培養(yǎng)基 為添加了 〇.〇lmg/LNAA(萘乙酸）、2mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤）、2%蔗糖、5g/L瓊脂和0.5g/L 活性炭的MS培養(yǎng)基； 6) 當分化培養(yǎng)基中愈傷組織轉(zhuǎn)綠就可放置在光照強度2000LX、光照14h/d、溫度25°C 的組培架上進行培養(yǎng)，每間隔15天切割繼代一次，一個月后可長出綠色芽苗； 7) 提前配制生根培養(yǎng)基，主要成分為l/2MS+0.2mg/LIBA(吲哚丁酸)+ 5g/L瓊脂+3%蔗 糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8，當綠色芽苗長至1-3厘米高時即可轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，放置于 光照強度2000Lx、光照14h/d、溫度25 °C的組培架上培養(yǎng)； 8)8-12天左右切口處可見不定根生長，20天后長成帶根小苗，之后用流式細胞儀檢測 每株小孢子再生苗，確定再生苗倍性，如為單倍體及時進行加倍處理。
[0004] 本發(fā)明首先采集新鮮花蕾，花蕾所在茄子植株為人工氣候箱或是保護地栽培，夜 間溫度為15°c，晝夜溫差10°c-20°c，健壯無病蟲害?；ɡ俨杉瘶藴蕿榛ü谂c萼裂處齊平，對 茄至八面風節(jié)位，內(nèi)部花藥為黃綠色，且花冠包裹緊密。采集花蕾后用牛皮紙袋包好放置在 4°C冰箱24小時后開始進行花藥預培養(yǎng)。預培養(yǎng)基為添加了 2mg/LKT的MS培養(yǎng)基，PH5.8，花 藥預培養(yǎng)后放置于36°C光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)6天。之后進行小孢子游離培養(yǎng)，培養(yǎng)基為添加 了0? 2mg/L2，4-D、lmg/LKT、lmg/L6BA和5%葡萄糖的KM培養(yǎng)基，pH 5? 8。游離方法采用機械 切割花藥后，將花藥殘體保留在液體培養(yǎng)基中與游離出的小孢子進行共培養(yǎng)。小孢子培養(yǎng) 條件為25°C暗培養(yǎng)30-90天，當花藥中部和尖部有白色愈傷組織長出，達到3毫米以上直徑 就可轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中25 °C弱光培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基為添加了 0.0 lmg/LNAA、2mg/L6-BA、2% 蔗糖、5g/L瓊脂和0.5g/L活性炭的MS培養(yǎng)基。當分化培養(yǎng)基中愈傷組織轉(zhuǎn)綠就可放置在光 照強度2000LX、光照14h/d、溫度25°C的組培架上進行培養(yǎng)。每間隔15天切割繼代一次，一個 月后可長出綠色芽苗。提前配制生根培養(yǎng)基，主要成分為1/21^+0.21^/118六+58/1瓊脂+3% 蔗糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8。當綠色芽苗長至1-3厘米高時即可轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，放置 于光照強度2000LX、光照14h/d、溫度25°C的組培架上培養(yǎng)。8-12天切口處可見不定根生長， 20天后長成帶根小苗。之后用流式細胞儀檢測每株小孢子再生苗，確定再生苗倍性，如為單 倍體及時進行加倍處理。本發(fā)明的實驗對象為茄子F1雜交種(有市售）。
[0005] 本發(fā)明首次實現(xiàn)了克服基因型影響通過游離小孢子培養(yǎng)誘導單倍體的目標。采用 自然游離可避免傳統(tǒng)方法離心擠壓等操作過程對小孢子的刺激，提高游離小孢子成活率； 同時，一些不易誘導基因型通過花藥共培養(yǎng)可以成功誘導愈傷組織，分化成苗。首先對供體 材料種植環(huán)境和季節(jié)提出嚴格要求，第二步通過改變激動素(KT)濃度進行花藥預培養(yǎng)，第 三步通過花藥共培養(yǎng)游離小孢子提高愈傷組織誘導率，第四步采取暗培養(yǎng)等措施提高愈傷 組織分化率，最后利用現(xiàn)有技術(shù)生根成苗，進行倍性鑒定。
[0006] 本發(fā)明進一步公開了茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)高效誘導單倍體方法在 提高茄子單倍體誘導率方面的應用。本發(fā)明采用高低溫差異生長誘導小孢子脫離二倍體途 徑向單倍體途徑發(fā)展，通過激動素影響小孢子發(fā)育途徑，自然游離和花藥共培養(yǎng)提高游離 小孢子成活率進而誘導出愈傷組織，愈傷組織通過暗培養(yǎng)等措施提高分化率，最后生根成 苗。
[0007] 本發(fā)明的原理在于:與十字花科蔬菜比較，茄子小孢子培養(yǎng)難度大，大多試驗停留 在愈傷組織或類胚狀體階段，成功應用的報道較少。主要原因是小孢子游離后胚誘導困難， 誘導頻率低，誘導出的胚狀體發(fā)育能力較差，再生植株誘導頻率更低。茄子小孢子培養(yǎng)依然 存在基因型障礙，一部分關(guān)鍵育種資源因基因型不易誘導而出現(xiàn)小孢子培養(yǎng)誘導率低，發(fā) 育遲緩甚至停滯，嚴重制約著該技術(shù)的應用推廣。第二是小孢子游離后大量死亡，直接影響 出胚率，導致茄子出胚率一般保持在10%以下。第三是茄子愈傷組織和胚狀體分化出芽困 難，影響植株再生。
[0008] 通過實驗發(fā)現(xiàn)，日溫25-32°C、夜溫12-15°c，溫差10-20°c生長的供體植株，產(chǎn)生的 小孢子細胞生理活性高、發(fā)育同步性強，而且誘導率還高。健壯且生長旺盛植株的花藥具有 最大的孤雄生殖能力。從季節(jié)上，冬、春季更適于花藥的培養(yǎng)可能是由于溫度與光周期共同 作用的原因。低夜溫可能改變了供體小孢子的發(fā)育方向，使小孢子偏離配子體發(fā)育方向并 促使其脫分化形成愈傷組織。小孢子處于單核靠邊期，對培養(yǎng)條件的誘導敏感，能很好啟動 胚胎發(fā)生途徑。熱激處理促使花藥的極性分布從形態(tài)上發(fā)生改變，改變了小孢子的分裂方 式以及發(fā)育途徑，導致小孢子配子體發(fā)育方向發(fā)生偏離。試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6 d熱激處理的小 孢子群體膨大率最高且活力最高。
[0009] 通過藥壁組織與小孢子共培養(yǎng)，愈傷組織誘導率可以快速提高?；ㄋ幵谝后w培養(yǎng) 基經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，藥室自然開裂，小孢子從花藥里散落出來形成愈傷組織?；ㄋ幗M織 在胚狀體形成過程中也起著重要作用。試驗證實小孢子與藥壁組織共培養(yǎng)7天，可以明顯提 高愈傷組織的誘導頻率。
[0010] 〇、6-84，144主要用來誘導細胞分裂以及根分化，而祖六和2,4-〇在促使細胞分裂、 胚狀體形成和愈傷組織生根生芽方面應用較廣。有報道證實活性炭能夠提高小孢子愈傷組 織的誘導率，因為可以吸附培養(yǎng)基、空氣和試驗材料所釋放的抑制物質(zhì)，而且活性碳能吸附 和清除小孢子脫分化時產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。但是許多愈傷組織分化出芽存在障礙，成苗率低。 采用暗培養(yǎng)與弱光培養(yǎng)相結(jié)合措施，可以大大提高愈傷組織分化率。
[0011] 本發(fā)明公開的基于茄子花藥看護培養(yǎng)克服基因型影響通過游離小孢子經(jīng)愈傷組 織途徑獲得單倍體的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于： (1)克服基因型影響:所有茄子基因型材料，包括難誘導材料，只要種植環(huán)境和季節(jié)符 合要求，花蕾健壯，采用本專利方法都可以成功誘導單倍體。小孢子培養(yǎng)愈傷組織有效出愈 率和成苗率由原來的7%提高到了41%。
[0012] (2)單倍體誘導率高，結(jié)果可靠：實驗證實，利用本方法誘導單倍體，誘導率可達 45%以上，流式細胞儀檢測倍性結(jié)果可靠。
[0013] (3)成本低:組織培養(yǎng)技術(shù)所用激素種類少，而且相對廉價。
[0014]
【附圖說明】： 圖1切割后的花藥與自然游離的小孢子共培養(yǎng)圖； 圖2游離小孢子產(chǎn)生愈傷組織圖； 圖3愈傷組織分化出綠色芽點圖； 圖4綠色芽點分化出小苗圖； 圖5植株再生圖。
【具體實施方式】
[0015] 為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，提供下述制備方法實施實例。這些實施實例僅 僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。需要特別說明是：本發(fā)明所用到的雜交種來源于包 括:斯卡特、圓雜471、改良綠罐種子均由市售。
[0016] 實施例1 茄子雜交種斯卡特單倍體誘導 1、首先采集新鮮花蕾，花蕾所在茄子植株為人工氣候箱或是保護地栽培，夜間溫度為 15°C，晝夜溫差10°C-2(TC，健壯無病蟲害?；ɡ俨杉瘶藴蕿榛ü谂c萼裂處齊平，對茄至八面 風節(jié)位，內(nèi)部花藥為黃綠色，且花冠包裹緊密。采集花蕾后用牛皮紙袋包好放置在4°C冰箱 24小時后開始進行花藥預培養(yǎng)。
[0017] 2、預培養(yǎng)基為添加了2mg/LKT的MS培養(yǎng)基，pH 5.8，花藥預培養(yǎng)后放置于36°(：光照 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)6天。
[0018] 3、之后進行小孢子游離培養(yǎng)，培養(yǎng)基為添加了 0 ? 2mg/L2，4-D、lmg/LKT、lmg/L6BA 和5%葡萄糖的KM培養(yǎng)基，pH5.8。游離方法采用機械切割花藥后，將花藥殘體保留在液體培 養(yǎng)基中與游離出的小孢子進行共培養(yǎng)。小孢子培養(yǎng)條件為25 °C暗培養(yǎng)63天。
[0019] 4、當花藥中部和尖部有白色愈傷組織長出，達到3毫米以上直徑就可轉(zhuǎn)接到分化 培養(yǎng)基中25 °C弱光培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基為添加了 0.0 lmg/LNAA、2mg/L6-BA、2%蔗糖、5g/L瓊脂 和0.5g/L活性炭的MS培養(yǎng)基。
[0020] 5、當分化培養(yǎng)基中愈傷組織轉(zhuǎn)綠就可放置在光照強度2000LX、光照14h/d、溫度25 °C的組培架上進行培養(yǎng)。每間隔15天切割繼代一次，一個月后可長出綠色芽苗。
[0021] 6、提前配制生根培養(yǎng)基，主要成分為1/21^+0.211^/1184+58/1瓊脂+3%蔗糖+ 〇.5g/L活性炭，pH值5.8。當綠色芽苗長至1-3厘米高時即可轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，放置于光照 強度2000Lx、光照14h/d、溫度25°C的組培架上培養(yǎng)。8-12天左右陸續(xù)切口處見不定根生長， 20天后長成帶根小苗。
[0022] 7、之后用流式細胞儀檢測每株小孢子再生苗，確定再生苗倍性，如為單倍體及時 進行加倍處理。
[0023]附表： 表1 MS預培養(yǎng)基配方(已知的通用配方）
表2 KM培養(yǎng)基配方(已知的通用配方）

表3中英文對照表
花藥有效出愈率和愈傷組織出芽率見表4和表5，成苗率100%。
[0024] 實施例2 茄子雜交種圓雜471單倍體誘導 同實施例1，不同的是小孢子培養(yǎng)條件為25°C暗培養(yǎng)74天，花藥有效出愈率和愈傷組織 出芽率見表4和表5，成苗率100%。
[0025] 實施例3 茄子雜交種改良綠罐單倍體誘導 同實施例1，不同的是小孢子培養(yǎng)條件為25°C暗培養(yǎng)86天，花藥有效出愈率和愈傷組織 出芽率見表4和表5，成苗率100%。
[0026] 表4花藥有效出愈率(％) ::品_ 囊如 麗 :輋 L 平均y ::斯卡特e 3L- _ m 2扣 圖雜471c 30v 6-^ 4知 2如 改良綠罐。 咖 29，= 32、。 36^ 表5愈傷組織出芽率(％) 品,s 董賽翻.. ：:董復少 .董褢f. 等 斯2取 .::_1加￥ ： 6f^：' 63^5 鐘雜欲私 涵w IQifc :運58^ -VyVX<.-￥--,v-z ..... 敗SB_; 卿 ?r :碼》 40- 實施例4 表6茄子小孢子游離誘導單倍體方法比較試驗
結(jié)論： 本發(fā)明公開的基于茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)高效誘導單倍體的方法與現(xiàn)有 技術(shù)相比有以下三個特點。
[0027] (1)克服基因型影響 (2) 單倍體誘導率高，結(jié)果可靠 (3) 成本低。
【主權(quán)項】
1. 一種茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)誘導單倍體的方法，其特征在于如下的步驟 進行： 1) 種植環(huán)境:花蕾所在前子植株為人工氣候箱或是保護地栽培，夜間溫度為15°C，晝夜 溫差達到10°C-20°C，植株健壯無病蟲害； 2) 花蕾標準:花蕾采集標準為花冠與萼裂處齊平，對茄至八面風節(jié)位，內(nèi)部花藥為黃綠 色，且花冠包裹緊密； 采集花蕾后用牛皮紙袋包好放置在4°C冰箱24小時后開始進行花藥預培養(yǎng)； 3) 預培養(yǎng)特點：預培養(yǎng)基為添加了 2mg/LKT的MS培養(yǎng)基，pH 5.8，花藥預培養(yǎng)后放置于 36 °C光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)6天； 4) 自然游離與共培養(yǎng):機械切割花藥，避免擠壓和離心，使小孢子自然游離于液體培養(yǎng) 基中，同時將花藥殘體保留在液體培養(yǎng)基中與游離出的小孢子進行共培養(yǎng)； 培養(yǎng)基為添加了 〇 · 2mg/L2，4-D、lmg/LKT、lmg/L6-BA和5%葡萄糖的KM培養(yǎng)基，PH 5 · 8; 5) 培養(yǎng)條件:小孢子培養(yǎng)條件為25°C暗培養(yǎng)60-90天，當花藥中部和尖部有白色愈傷 組織長出，達到3毫米以上直徑就可轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中25°C弱光培養(yǎng);所述的分化培養(yǎng)基 為添加了 0 · Olmg/LNAA、2mg/L6-BA、2%蔗糖、5g/L瓊脂和0 · 5g/L活性炭的MS培養(yǎng)基； 6) 當分化培養(yǎng)基中愈傷組織轉(zhuǎn)綠就可放置在光照強度2000LX、光照14h/d、溫度25°C 的組培架上進行培養(yǎng)，每間隔15天切割繼代一次，一個月后可長出綠色芽苗； 7) 提前配制生根培養(yǎng)基，主要成分為1/2MS+0.2mg/LIBA+ 5g/L瓊脂+3%蔗糖+0.5g/L活 性炭，pH值5.8,當綠色芽苗長至1-3厘米高時即可轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，放置于光照強度 2000Lx、光照14h/d、溫度25 °C的組培架上培養(yǎng)； 8) 8-12天左右切口處可見不定根生長，20天后長成帶根小苗，之后用流式細胞儀檢測 每株小孢子再生苗，確定再生苗倍性，如為單倍體及時進行加倍處理。2. 采用權(quán)利要求1所述茄子自然游離小孢子與花藥共培養(yǎng)誘導單倍體方法在克服基因 型影響，提高茄子單倍體誘導率方面的應用。
【文檔編號】A01H4/00GK105850738SQ201610227166
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】王利英, 喬軍, 李素文, 劉婧, 黃亞杰
【申請人】天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所