專利名稱：羅漢果蛋白酶及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物蛋白酶，特別是羅漢果蛋白酶及其提取方法。
背景技術(shù)：
羅漢果是我國特有的葫蘆科植物，據(jù)報(bào)道羅漢果含有6～38％易為人體吸收利用的糖類和1～4％比蔗糖甜度高300倍的甜味素，還含有豐富的維生素C、蛋白質(zhì)等成分，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值。羅漢果的開發(fā)利用引起了國內(nèi)外科學(xué)工作者的廣泛重視。
目前，羅漢果主要以烘干果銷售。深層次的開發(fā)利用主要是羅漢果甜味素的提取和以羅漢果提取物為基料制成的羅漢果沖劑、羅漢果果珍、羅漢果飲料等保健食品。長期以來我國植物蛋白酶資源主要依賴于木瓜、菠蘿、無花果等少數(shù)熱帶植物，而羅漢果中含有活力很強(qiáng)的蛋白酶尚未見有報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要公開一種從鮮羅漢果中提取的羅漢果蛋白酶及其提取方法。
羅漢果蛋白酶的提取方法步驟是(1)挑選出沒有霉變的鮮羅漢果，清洗干凈并瀝干；(2)壓榨，濾布過濾，離心去渣，得清液；(3)清液通過下列三種方法均可得到粗酶粉，方法一清液用微孔膜過濾，濾液經(jīng)超濾膜超濾，得截留超濾液，真空冷凍干燥或噴霧干燥，便得粗酶粉；方法二清液加入有機(jī)溶劑，靜置沉淀過濾后，所得沉淀經(jīng)干燥，便得粗酶粉；方法三清液加入硫酸銨，靜置沉淀后，所得沉淀經(jīng)透析去鹽，透析袋中溶液經(jīng)真空冷凍干燥或噴霧干燥后，便得粗酶粉；(4)取粗酶粉用適當(dāng)?shù)恼麴s水溶解，離心除去不溶物后，進(jìn)行凝膠柱層析，收集具有酶活的部分，冷凍干燥，便得羅漢果蛋白酶。
用上述方法提取分離出的羅漢果蛋白酶，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明對酪蛋白具有強(qiáng)烈的水解活性。采用以酪蛋白為反應(yīng)底物的紫外分光光度法對酶的活力進(jìn)行測定，粗酶活力可達(dá)150萬單位/克，約為市面上的木瓜蛋白粗酶活力的兩倍，經(jīng)分離純化的羅漢果蛋白酶活力更高。羅漢果蛋白酶的發(fā)現(xiàn)和提取使我國又多了一個(gè)植物蛋白酶資源，本發(fā)明的推廣應(yīng)用將改變我國植物蛋白酶資源長期主要依賴于木瓜、菠蘿等少數(shù)植物資源的狀況。同時(shí)本發(fā)明對酶學(xué)研究和生物科學(xué)的發(fā)展，對應(yīng)用蛋白酶的食品、醫(yī)療、制革、化工等工業(yè)的發(fā)展，對羅漢果的深加工、提高羅漢果的綜合利用水平、增加其經(jīng)濟(jì)效益都有重大意義。
(四)具體實(shí)施例利用成熟鮮羅漢果果實(shí)提取分離羅漢果蛋白酶，具體工藝步驟是(1)粗酶提取選取新鮮羅漢果1000g，洗凈瀝干，壓榨取汁，濾布過濾，離心(4000r/min，15min)，收集上清液，清液通過下列三種方法均可得到粗酶粉。方法一將上清液用Φ150mm的0.45um微孔膜過濾，濾液經(jīng)中空管超濾器超濾，得截流超濾液，此超濾液在-40℃以下冷凍結(jié)冰，用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得白色粉末為粗酶粉15.8g；方法二清液加入預(yù)冷的乙醇至70％(v/v)，靜置一段時(shí)間后，過濾除去溶液，所得沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，得淺黃色粉末為粗酶粉20.5g；方法三清液加入硫酸銨至飽和度為0.7，靜置沉淀過濾后，得沉淀經(jīng)透析去鹽，并對透析袋溶液進(jìn)行冷凍干燥得白色粗酶粉12.3g。
(2)酶的進(jìn)一步純化先將凝膠層析柱(Φ25×700mm)用蒸餾水平衡，再取上述粗酶粉1g溶于10ml蒸餾水，離心(4000r/min，10min)取上清液5ml上柱，先后用蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol的NaCl溶液各洗脫40min(流速為1mL/min)，洗脫液通過紫外檢測器檢測(在250nm波長下檢測)，按峰進(jìn)行收集，取具酶活性的共30ml，用透析袋進(jìn)行透析，至用AgNO3檢測不到氯離子，將透析袋中溶液真空冷凍干燥，得0.034g白色羅漢果蛋白酶。
權(quán)利要求
1.一種羅漢果蛋白酶，其特征在于是從鮮羅漢果中提取分離得到的。
2.一種羅漢果蛋白酶的提取方法，其特征在于提取的工藝步驟為(1)挑選出沒有霉變的鮮羅漢果，清洗干凈并瀝干；(2)壓榨，濾布過濾，離心去渣，得清液；(3)清液通過下列三種方法均可得到粗酶粉，方法一清液用微孔膜過濾，濾液經(jīng)超濾膜超濾，得截留超濾液，真空冷凍干燥或噴霧干燥，便得粗酶粉；方法二清液加入有機(jī)溶劑，靜置沉淀過濾后，所得沉淀經(jīng)干燥，便得粗酶粉；方法三清液加入硫酸銨，靜置沉淀后，所得沉淀經(jīng)透析去鹽，透析袋中溶液經(jīng)真空冷凍干燥或噴霧干燥后，便得粗酶粉；(4)取粗酶粉用適當(dāng)?shù)恼麴s水溶解，離心除去不溶物后，進(jìn)行凝膠柱層析，收集具有酶活的部分，冷凍干燥，得羅漢果蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅漢果蛋白酶及其提取方法，羅漢果蛋白酶是用鮮羅漢果，經(jīng)榨汁、過濾、超濾或鹽析、有機(jī)溶劑沉淀方法，真空冷凍或噴霧干燥，制得粗酶粉，再用蒸餾水溶解粗酶粉，并進(jìn)行柱層析，透析去鹽，冷凍干燥而制得羅漢果蛋白酶。該酶對酪蛋白有強(qiáng)烈的水解活性，粗酶活力可達(dá)150萬單位/克，約為木瓜蛋白粗酶活力的兩倍，羅漢果蛋白酶及提取使我國又多了一個(gè)植物蛋白酶資源，本發(fā)明的推廣應(yīng)用將改變我國植物蛋白酶資源長期主要依賴于木瓜、菠蘿等少數(shù)植物資源的狀況。同時(shí)本發(fā)明對酶學(xué)研究和生物科學(xué)的發(fā)展，對應(yīng)用蛋白酶的食品、醫(yī)療、制革、化工等工業(yè)的發(fā)展，對羅漢果的深加工、提高羅漢果的綜合利用水平、增加其經(jīng)濟(jì)效益都有重大意義。
文檔編號C12N9/50GK1766099SQ20041004096
公開日2006年5月3日 申請日期2004年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月31日
發(fā)明者蘇小建, 梁成欽, 張健, 李俊, 何星存 申請人:廣西師范大學(xué)