專利名稱：核酸的處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用亞硫酸氫鹽對(duì)核酸，特別是甲基化的核酸進(jìn)行處理的修飾方法。
背景技術(shù)：
作為自動(dòng)化測(cè)序技術(shù)發(fā)展的結(jié)果，已經(jīng)進(jìn)行了許多工作以確定在許多動(dòng)物基因組、包括人類基因組的全序列測(cè)定中獲得的DNA的編碼區(qū)。但是，多年來(lái)，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到大部分的基因組DNA是非編碼的，這些DNA曾經(jīng)被當(dāng)作“垃圾”DNA。對(duì)DNA非編碼區(qū)的分析現(xiàn)在被認(rèn)為對(duì)基因表達(dá)和功能的研究來(lái)說(shuō)是重要的。核酸，特別是基因組DNA中的甲基化狀態(tài)或方式被認(rèn)為在動(dòng)物的基因表達(dá)和控制中具有功能性或調(diào)控性作用。
已經(jīng)證實(shí)在單鏈DNA中，亞硫酸氫鈉優(yōu)先將胞嘧啶脫氨基成為尿嘧啶，與此相比將5-甲基胞嘧啶脫氨基成為胸腺嘧啶的速度則非常慢(Shapiro，R.，DiFate，V.，和Welcher，M.，(1974)J.Am.Chem.Soc.96906-912)。這項(xiàng)觀察成為Frommer等1992年開(kāi)發(fā)的亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序方案的基礎(chǔ)(Frommer M，McDonald LE，Millar DS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL.PNAS 891827-1831(1992)，在此引為參考)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，現(xiàn)在使用的該方法包括下面的基本步驟DNA的堿變性；使用亞硫酸氫鈉進(jìn)行脫氨基作用；通過(guò)脫鹽接著用氫氧化鈉處理進(jìn)行脫磺酸基；中和并脫鹽。
亞硫酸氫鹽修飾方法以及現(xiàn)有的對(duì)它的修改所具有的一個(gè)主要的缺點(diǎn)是已經(jīng)顯示出該方法導(dǎo)致84-96％的原始輸入的DNA發(fā)生降解(Grunau等，Nucleic Acids Research 29(13)e65；(2001))。與該方法相關(guān)的這種巨大的損失意味著實(shí)際上很難成功地分析少量細(xì)胞的甲基化狀態(tài)，或成功地分析DNA已經(jīng)處于部分降解狀態(tài)的古代檔案樣本。此外，由于現(xiàn)有方法內(nèi)在的降解作用，不可能以已經(jīng)被公共的人類基因組計(jì)劃(International Human Genome Sequencing Consortium，2001，Nature，409，860-921)或私人的CELERA測(cè)序計(jì)劃(J Craig Venter等，2001，Science，291，1304-1351)所成功使用的相同的方式對(duì)生物體的完整基因組進(jìn)行測(cè)序和裝配，以確定整個(gè)基因組范圍內(nèi)的甲基化狀態(tài)，因?yàn)镈NA已經(jīng)變得片段，以致由于在序列中存在巨量的“間隙”使其不能以任何有意義的方式被克隆、測(cè)序和組裝。
現(xiàn)在使用的亞硫酸氫鹽方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是一般來(lái)說(shuō)，只有小片段的DNA可以被擴(kuò)增。經(jīng)驗(yàn)表明，一般小于大約500堿基對(duì)(bp)可以被成功地處理和擴(kuò)增。現(xiàn)有的技術(shù)不能應(yīng)用于新的分子生物學(xué)方法，例如長(zhǎng)距離聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，這種技術(shù)使得擴(kuò)增大段的未處理的基因組DNA成為可能，一般多達(dá)約50kb。目前，甚至還不可能分析完整的基因的甲基化狀態(tài)，因?yàn)樵诓溉閯?dòng)物基因組中大量的基因長(zhǎng)度超過(guò)50kb。
甚至為了查看相對(duì)小的基因(＜4kb)的甲基化狀態(tài)，也不得不使用PCR反應(yīng)艱難地通過(guò)目的基因區(qū)域(D.S Millar，K.K Ow，C.L.Paul，P.J.Russell，P.L.Molloy，S.J.Clark，1999，Oncogene，18(6)1313-24；Millar DS，Paul CL，Molloy PL，Clark SJ.(2000).J Biol Chem；275(32)24893-9)。目前使用的亞硫酸氫鹽DNA處理的方法也是繁瑣和耗時(shí)的。標(biāo)準(zhǔn)方法一般需要轉(zhuǎn)換多個(gè)試管、柱純化、透析、將DNA包埋在瓊脂糖珠中或在反應(yīng)中加入添加劑以試圖減少例如基因組DNA的某些區(qū)域未轉(zhuǎn)化這樣的問(wèn)題。因此，需要一種更可靠的方法，它基本上不導(dǎo)致DNA降解，并克服或至少減輕了與現(xiàn)有DNA處理相關(guān)的多種問(wèn)題。
發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容本發(fā)明涉及一種有效的、適用于許多不同分子生物學(xué)技術(shù)、并能夠獲得極大的核酸保留率的改進(jìn)的亞硫酸氫鹽處理核酸的方法，在此被稱為人類遺傳標(biāo)記(Human Genetic Signature)(HGS)亞硫酸氫鹽方法或本發(fā)明的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了處理核酸的方法。該方法可以包括下列步驟將核酸樣品變性；將核酸樣品與亞硫酸氫鹽試劑保溫，從而用磺酸基修飾甲基化的核苷酸；將修飾的核酸樣品稀釋；使修飾的核酸樣品沉淀；以及將修飾的核酸樣品反應(yīng)以除去磺酸基。核酸的變性可以通過(guò)例如堿處理來(lái)進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了處理核酸的方法，包括(a)為核酸樣品提供變性的環(huán)境；(b)將核酸樣品與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng)并將反應(yīng)保溫以形成被處理的核酸樣品，使核酸樣品中任何甲基化的核苷酸保持不變，而未甲基化的核苷酸被轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形式；(c)將被處理的核酸樣品稀釋以便使鹽濃度減少到基本上不干擾核酸沉淀步驟的水平；(d)將稀釋的被處理的核酸沉淀，以便從容器中基本上除去任何不想要的試劑或稀釋劑；以及(e)對(duì)沉淀的被處理的核酸進(jìn)行脫磺酸基，以便除去被處理的核酸中存在的磺酸基，從而獲得基本上不含磺酸基的核酸樣品，同時(shí)又不誘導(dǎo)大量的鏈斷裂。
該方法典型地可以保留大約50％以上樣品中的初始核酸，一般能保留大約75％以上，甚至保留大約95％以上。本發(fā)明的方法可以被實(shí)施而不引起核酸樣品任何實(shí)質(zhì)上的降解或損失。與此相反，目前使用或在現(xiàn)有技術(shù)中描述的亞硫酸氫鹽方法典型地導(dǎo)致核酸樣品多達(dá)大約96％的損失，以至于只有大約4％的核酸實(shí)際上可用于分析。
該方法還可以包括(f)進(jìn)一步加工或分析被處理的核酸樣品。
樣品可以包含DNA或RNA或DNA和RNA二者的組合。
與現(xiàn)有技術(shù)中的方法不同，不需要將被處理的核酸與亞硫酸氫鹽試劑完全分開(kāi)或分離。也不需要使用例如現(xiàn)有技術(shù)方法中所需要的層析分離方法。本發(fā)明的稀釋步驟有助于使樣品的損失最小化。
本發(fā)明還涉及含有用于實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑和說(shuō)明書(shū)的試劑盒。
在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中，除非上下文有另外的需要，單詞“包含”或其變形“包括”或“含有”，將被理解成包含了被陳述的要素、整數(shù)或步驟，或一組要素、整數(shù)或步驟，但是不排除任何其它的要素、整數(shù)或步驟，或一組要素、整數(shù)或步驟。
對(duì)包含在本說(shuō)明書(shū)中的任何文件、法案、材料、裝置、文章等的討論僅僅是出于為本發(fā)明提供背景的目的，并非承認(rèn)由于在本申請(qǐng)的每個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期已經(jīng)在澳大利亞存在了，任何或所有這些主題就構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的組成部分或?qū)儆诒景l(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的常識(shí)。
為了使本發(fā)明可以被更清楚地理解，將參考下面的附圖和實(shí)施例對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了HGS亞硫酸氫鹽方法和傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽方法(Clark等，(1994)Nucleic Acids Res.222990-2997)之間從不同的組織樣品得到的亞硫酸氫鹽處理的DNA回收率的比較。孔#1是從2個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#2是從20個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#3是從200個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#4是從2000個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#5是從20000個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA。HGS方法顯示在左邊(標(biāo)明為1-5的道分別對(duì)應(yīng)于上面的說(shuō)明)；傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽方法顯示在右邊(標(biāo)明為1-5的道分別對(duì)應(yīng)于上面的說(shuō)明)。
圖2顯示了用HGS亞硫酸氫鹽處理從前列腺癌細(xì)胞學(xué)Dul45提取的RNA所獲得的結(jié)果與使用常規(guī)的亞硫酸氫鹽方法處理獲得的結(jié)果的比較。道1是未處理的對(duì)照RNA，道2是用亞硫酸氫鹽在4℃處理過(guò)夜的RNA，道3是用亞硫酸氫鹽在室溫處理過(guò)夜的RNA，道4是用亞硫酸氫鹽在55℃處理過(guò)夜的RNA。道5是用亞硫酸氫鹽在室溫處理過(guò)夜的RNA平行樣#2，道6是用亞硫酸氫鹽在室溫處理過(guò)夜的RNA平行樣#3。道7是使用常規(guī)方法(Clark等1994)用亞硫酸氫鹽在室溫處理過(guò)夜的RNA。M是分子量標(biāo)記物。
圖3顯示了在不同的溫度下保溫時(shí)RNA穩(wěn)定性的時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)。從結(jié)果可以看出在保溫的第一個(gè)30分鐘發(fā)生了少量的降解，然后卻達(dá)到了幾乎穩(wěn)定的狀態(tài)，隨后損失很小，即使是在55℃保溫16小時(shí)以后。
圖4顯示了對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的RNA和野生型RNA所進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄酶PCR。可以看到，在亞硫酸氫鹽處理的RNA中有強(qiáng)烈的PCR擴(kuò)增信號(hào)，其大小與野生型RNA中的帶相同。道1是使用亞硫酸氫鹽引物擴(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的人β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的外顯子3和4的RT-PCR擴(kuò)增。道2是使用亞硫酸氫鹽引物擴(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的人β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的外顯子3的RT-PCR擴(kuò)增。道3是使用野生型引物擴(kuò)增人β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的外顯子3和4的RT-PCR擴(kuò)增。道4是使用野生型引物擴(kuò)增人β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的外顯子3的RT-PCR擴(kuò)增。M是分子量標(biāo)記物。NB表示當(dāng)亞硫酸氫鹽處理的擴(kuò)增引物用于野生型RNA時(shí)沒(méi)有觀察到PCR擴(kuò)增，此外當(dāng)野生型引物用于亞硫酸氫鹽處理的RNA時(shí)沒(méi)有觀察到PCR信號(hào)。
圖5確認(rèn)了對(duì)圖4中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物是來(lái)自亞硫酸氫鹽處理的基因組RNA。箭頭指示了人β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄本中外顯子3和4之間的剪接位點(diǎn)。
實(shí)施本發(fā)明的方式下面對(duì)處理核酸的實(shí)施方案進(jìn)行非限制性的詳細(xì)描述。
本發(fā)明提供了處理和分析核酸的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于它們提供了簡(jiǎn)單高效的修飾核酸的方法，并且可用于例如檢測(cè)基因組DNA或RNA的甲基化形式或甲基化的變化。相對(duì)于目前已知的方法，本發(fā)明的方法提供了簡(jiǎn)化的步驟，能獲得較高的產(chǎn)量和較高分子量的核酸分子，因此允許分析較少量的核酸，并易于應(yīng)用于大量的樣品。
本發(fā)明提供了處理核酸的方法，包括(a)將核酸樣品變性；(b)將核酸樣品與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng)并將反應(yīng)保溫，以便形成被處理的核酸樣品，其中核酸樣品中任何甲基化的核苷酸保持不變，而未甲基化的核苷酸被轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形式；(c)將被處理的核酸樣品稀釋以便使鹽濃度減少到基本上不干擾核酸沉淀步驟的水平；(d)將稀釋的被處理的核酸沉淀，以便從被處理的核酸樣品中基本上除去任何不想要的試劑或稀釋劑；以及(e)對(duì)沉淀的被處理的核酸進(jìn)行脫磺酸基，以便除去被處理的核酸中存在的磺酸基，從而獲得基本上不含磺酸基的核酸樣品。
可以通過(guò)例如給DNA樣品提供堿性環(huán)境來(lái)進(jìn)行核酸樣品的變性。該方法在分析DNA核酸樣品中特別有用。RNA樣品的變性可以通過(guò)將RNA加熱以解開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行。加熱一般高達(dá)約95℃，優(yōu)選在約50℃到70℃之間。但是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，溫度的選擇優(yōu)選使RNA變性以除去二級(jí)結(jié)構(gòu)，但不破壞或擾亂RNA分子。
脫磺酸基步驟一般在受控制的條件下進(jìn)行以除去被處理的核酸中存在的磺酸基。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以被實(shí)施，而核酸樣品例如DNA鏈不被打破或剪切到嚴(yán)重的程度。這樣的方法對(duì)于RNA樣品來(lái)說(shuō)特別具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橄蟪Ｒ?guī)亞硫酸氫鹽方法中所描述的加入堿的步驟將導(dǎo)致總RNA的降解。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了處理核酸的方法。該方法可以包括下列步驟將核酸樣品變性；將核酸樣品與亞硫酸氫鹽試劑保溫，從而用磺酸基團(tuán)修飾甲基化的核苷酸；將修飾的核酸樣品稀釋；將修飾的核酸樣品沉淀；以及對(duì)修飾的核酸樣品進(jìn)行反應(yīng)以除去磺酸基團(tuán)。核酸的變性可以通過(guò)例如用堿處理、加熱、或添加其它能夠?qū)е聠捂満怂嵝纬傻幕瘜W(xué)或蛋白試劑來(lái)進(jìn)行。
該方法典型地導(dǎo)致樣品中起始核酸被保留多于大約50％，一般多于大約75％，可以多于大約95％。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該方法可以被實(shí)施而不引起核酸樣品任何實(shí)質(zhì)性的降解或損失。與此相反，目前使用或在現(xiàn)有技術(shù)中描述的亞硫酸氫鹽方法典型地導(dǎo)致核酸樣品多達(dá)大約96％的損失。
該方法還可以包括(f)加工或分析被處理的核酸樣品。
樣品可以包含DNA或RNA或DNA和RNA二者的組合。
樣品可以從組織、細(xì)胞制備，或可以是任何生物樣品例如血液，尿液，糞便，精液，腦脊液，從來(lái)源例如腦、結(jié)腸、泌尿生殖器、肺臟、腎臟、造血組織、乳腺、胸腺、睪丸、卵巢、子宮獲得的洗出液、細(xì)胞或組織，來(lái)自胚胎或外胚層的組織，環(huán)境樣品，植物，微生物包括細(xì)菌、細(xì)胞內(nèi)寄生病毒、真菌、原生生物、類病毒等。描述得最詳盡的適合使用本發(fā)明處理的細(xì)胞類型被概述在B.Alberts等，1989，《The Molecular Biology of the cell<細(xì)胞的分子生物學(xué)>》第二版，Garland出版公司，紐約和倫敦，995-997頁(yè)中。
對(duì)來(lái)自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌和病毒的樣品的DNA或RNA中5-甲基胞嘧啶殘基的分析意味著覆蓋所有的生命周期階段，在所有的細(xì)胞、組織和器官中從受精直到死后48小時(shí)，以及可能來(lái)自組織學(xué)來(lái)源例如顯微鏡載玻片的樣品，包埋在塊中的樣品，體液或提取自合成的或天然的表面或液體的樣品。
分析意味著包括了健康個(gè)體(按照WHO定義的健康)的細(xì)胞、組織和器官之間天然發(fā)生的變化，以及來(lái)自患病個(gè)體的細(xì)胞、組織和器官。這種意義上的患病包括所有在《Harrison’s Principles of InternalMedicine》(第12版，Jean D Wilson等主編，McGrraw Hill Inc.)以及后續(xù)版本中描述或提到的人類的疾病、痛苦、失調(diào)和不正常的癥狀；以及在OMIM(在線人類孟德?tīng)柺竭z傳(Online Mendelian Inheritance inMan)，www.ncbi.gov)中所描述的所有疾病、痛苦、失調(diào)和不正常的癥狀，但是著重于死亡的主導(dǎo)原因，即惡性腫瘤(癌癥)、缺血性心臟病、腦血管病、慢性障礙性肺病、肺炎和流感、動(dòng)脈病(包括動(dòng)脈粥樣硬化和主動(dòng)脈瘤)、糖尿病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及社交衰弱癥狀例如與神經(jīng)精神狀況相關(guān)的焦慮、緊張，以及肥胖癥和所有由異常的染色體數(shù)量或染色體重排(包括常染色體和性染色體的異倍性、重復(fù)、缺陷、移位和插入)所引起的癥狀，以及線粒體基因組的類似畸變。
正?；蚧疾〉膫€(gè)體可以來(lái)自(i)不同種族和進(jìn)化譜系的種群；(ii)菌株和地理上分離株；(iii)亞種；(iv)孿生子或同樣或不同性別的較高級(jí)別的多胞子；(v)通過(guò)正常的接合方法、人工授精、胚胎干細(xì)胞方法克隆、或通過(guò)核轉(zhuǎn)移(來(lái)自體細(xì)胞系或生殖細(xì)胞系的核)、或通過(guò)線粒體或其它細(xì)胞器的輸入或修飾而產(chǎn)生的個(gè)體；(vi)從轉(zhuǎn)基因敲除、敲入、拆卸方法得到的個(gè)體(體內(nèi)、離體或基因活性被暫時(shí)或永久改變的任何方法，基因活性的改變通過(guò)例如RNAi、核酶、轉(zhuǎn)座子活化、藥物或小分子方法、肽核酸(PNA)、插入核酸(INA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、鎖核酸(LNA)、環(huán)己基核酸(CNA)等，或基于核酸的接合，包括但不限于Trojan肽)，或處于正常懷孕或?qū)m外孕任何階段的個(gè)體。
分析也包括來(lái)自與人類疾病的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)方式相關(guān)的原核和真核生物和病毒(或其組合)的DNA或RNA中的5-甲基胞嘧啶殘基，目的在于在正常變化和疾病系統(tǒng)中確定和治療性地改變下列情況的變化的參數(shù)和潛在的機(jī)制(I)遺傳疾??；(II)由環(huán)境誘導(dǎo)因素引起的非遺傳的或后成的疾病，不管它們是生物起源、還是非生物起源的、(這種意義上的環(huán)境也包括生物體本身內(nèi)部的環(huán)境、在懷孕的所有階段中的環(huán)境、或在生育或不育治療條件下的環(huán)境)；(III)遺傳或非遺傳疾病的誘因，包括由“朊病毒”類型的因子、暴露于壓力變化和失重、或輻射效應(yīng)所帶來(lái)的影響；(IV)在所有的細(xì)胞類型、組織、器官系統(tǒng)和生物網(wǎng)絡(luò)的衰老過(guò)程中，包括與衰老相關(guān)的壓抑、疼痛、神經(jīng)精神和神經(jīng)變性癥狀和絕經(jīng)前后的癥狀(包括在兩種性別中生育力的降低)中的5-甲基胞嘧啶的變化；(V)在癌癥中5-甲基胞嘧啶的變化(包括在具有由DNA擴(kuò)增、缺失、重排、移位和插入事件引起的異常核型的細(xì)胞中的變化)，以及它們?cè)诓煌募?xì)胞周期現(xiàn)象(包括細(xì)胞周期對(duì)晝夜節(jié)律、光周期、睡眠、記憶和時(shí)差綜合癥的影響)中的變化或改變；(VI)在最廣闊的意義上定義的代謝網(wǎng)絡(luò)中5-甲基胞嘧啶的變化，從受精卵開(kāi)始，經(jīng)過(guò)胚胎形成、胚胎發(fā)育、出生、青春期、成年期和老年期(包括由低氧、缺氧、任何類型的輻射(離子化的或非離子化的、或來(lái)自化學(xué)治療療法、高度暴露于附近天然來(lái)源的輻射例如巖石、或來(lái)自軍事或政府資助的活動(dòng)的放射性塵埃的輻射)、緊張或由線粒體、核或細(xì)胞器基因組之間不平衡所引起的代謝效應(yīng))；(VII)在分子、細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)生物體水平上由于對(duì)蛋白、多肽、肽、以及DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等、或肽適配子(aptamers)(包括任何帶有翻譯后添加物、翻譯后水解產(chǎn)物、翻譯后修飾(例如內(nèi)含肽(inteins)和外顯肽(exeins)、泛醌化和降解產(chǎn)物的肽適配子)，含有稀有天然氨基酸的蛋白、多肽和肽，以及單獨(dú)的稀有氨基酸例如參與學(xué)習(xí)、腦生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡的D-絲氨酸，藥物、生物藥物、化學(xué)實(shí)體(化學(xué)實(shí)體和生物藥物的定義見(jiàn)G.Ashton，2001，Nature Biotechnology 19，307-3111)、代謝物、新的鹽類、藥物前體、現(xiàn)有化合物的酯、疫苗、抗原、聚酮化合物、非核糖體肽、維生素和來(lái)自任何天然來(lái)源的分子(例如植物來(lái)源的環(huán)杷明(cyclopamine))做出反應(yīng)而引起的5-甲基胞嘧啶的變化；(VIII)在分子、細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)生物體水平上由于對(duì)DNA和RNA病毒做出反應(yīng)而引起的5-甲基胞嘧啶的變化，這些病毒無(wú)論是單鏈或雙鏈的、外部來(lái)源或內(nèi)部激活的，例如內(nèi)源轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子(SINES和LINES)；(IX)在分子、細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)生物體水平上由于對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄本的反轉(zhuǎn)錄拷貝做出反應(yīng)而引起的5-甲基胞嘧啶的變化，這些轉(zhuǎn)錄本無(wú)論是基因或非基因來(lái)源的(或者含有內(nèi)含子或者不含)；(X)在分子、細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)生物體水平上由于對(duì)下列物質(zhì)做出反應(yīng)而引起的5-甲基胞嘧啶的變化(a)DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等(或任何DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA、適配子的所有組合)；包括在所有的體液，包括血液、腦脊液以及懷孕以前、期間和以后的母體體液中循環(huán)的DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等分子；(b)結(jié)合的生物分子的組合，這些分子是肽和核酸的嵌合體，或天然的分子例如膽固醇基團(tuán)、激素和核酸的嵌合體；以及(XI)由于對(duì)干細(xì)胞做出反應(yīng)而引起的5-甲基胞嘧啶的變化(可以是體內(nèi)、離體，也可以是與新的環(huán)境或天然的和合成的基質(zhì)(或其組合)相關(guān)的)，干細(xì)胞是人和動(dòng)物來(lái)源的，受到了前面(i)到(x)中描述的任何微擾。
可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@得核酸材料。例子包括但不限于可購(gòu)買到的DNA/RNA試劑盒或試劑、工作站、含有蛋白酶試劑的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞裂解緩沖液以及本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員熟知的有機(jī)提取步驟。
本方法可以在反應(yīng)容器中進(jìn)行。反應(yīng)容器可以是任何適當(dāng)?shù)娜萜?，例如試管、平板、毛?xì)管、孔、離心管、微量離心管、載玻片、蓋玻片或任何適當(dāng)?shù)谋砻?。本方法一般在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行以便減少核酸樣品降解或損失的可能性。
一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)加入堿例如NaOH或通過(guò)對(duì)含有核酸的樣品加熱來(lái)為樣品提供變性環(huán)境。提供堿性的環(huán)境可以將雙鏈的DNA分子變性，成為分子容易與亞硫酸氫鹽試劑進(jìn)行反應(yīng)的狀態(tài)。但是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，任何其它的變性方法例如熱處理或其它適合的堿或變性試劑也可以加入或使用，例如KOH以及任何其它的堿，只要變性試劑的使用不顯著抑制后面的步驟就可以。這對(duì)于RNA的分析可能是重要的，因?yàn)閴A導(dǎo)致RNA分子的降解，因此另一種方法例如熱變性是合乎需要的。
一般來(lái)說(shuō)，亞硫酸氫鹽試劑是偏亞硫酸氫鈉。使用亞硫酸氫鹽試劑引起胞嘧啶堿基磺化形成胞嘧啶磺酸鹽，然后胞嘧啶磺酸鹽通過(guò)水解脫氨基成為尿嘧啶磺酸鹽。但是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，任何其它合適的亞硫酸氫鹽試劑也可以使用，例如亞硫酸鹽或乙酸離子(參見(jiàn)Shapiro，R.，DiFate，V.，和Welcher，M.，(1974)J.Am.Chem.Soc.96906-912)。
與磺化試劑保溫可以在pH低于7以及有助于尿嘧啶磺酸基形成的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選低于大約7的pH來(lái)進(jìn)行磺化反應(yīng)，該反應(yīng)將胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為胞嘧啶磺酸鹽，然后再轉(zhuǎn)化為尿嘧啶磺酸鹽。但是，如果需要，本發(fā)明的方法中的磺化反應(yīng)可以在pH高于7下進(jìn)行。
磺化反應(yīng)可以在存在能夠增強(qiáng)亞硫酸氫鹽反應(yīng)的添加劑的情況下進(jìn)行。合適添加劑的例子包括但不限于對(duì)苯二酚、尿素、甲氧胺。在這些試劑中，對(duì)苯二酚是還原試劑。尿素和甲氧胺試劑的加入可以改進(jìn)亞硫酸氫鹽反應(yīng)的效率。應(yīng)該意識(shí)到其它的添加劑或試劑也可以提供用來(lái)輔助亞硫酸氫鹽反應(yīng)。
磺化反應(yīng)導(dǎo)致核酸樣品中甲基化的胞嘧啶保持不變，而未甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。
工作良好的反應(yīng)條件如下。將要被處理的變性DNA或其它核酸補(bǔ)足到20μl的體積。然后加入208μl新鮮配制的2M偏亞硫酸氫鈉(BDHAnalaR#10356.4D)，pH為5.0(pH通過(guò)加入10M的氫氧化鈉(BDHAnalaR#10252.4X)來(lái)調(diào)整)的溶液，以及12μl 10mM的對(duì)苯二酚溶液(BDH AnalaR#103122E)。加入的對(duì)苯二酚的濃度可以是大約10到500mM范圍內(nèi)的任何濃度，由實(shí)驗(yàn)所確定。然后將溶液混合，并用208μl礦物油(Sigma分子生物學(xué)級(jí)M-5904)覆蓋。接著將樣品留在適當(dāng)?shù)臏囟认逻^(guò)夜，例如室溫或其它適當(dāng)?shù)臏囟龋员阌谐浞值臅r(shí)間完全進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)理解，上述的體積、濃度以及保溫時(shí)間和溫度僅僅是示例性的，它們可以被改變，只要反應(yīng)條件適合于核酸的磺化。此外也將會(huì)理解，本發(fā)明方法的步驟的次序可以被改變，只要磺化和脫磺酸基的步驟可以充分地實(shí)施。
稀釋步驟的實(shí)施是為了使抑制后面反應(yīng)的鹽類不與磺化的核酸共沉淀。鹽濃度被稀釋到低于大約1M。一般來(lái)說(shuō)，稀釋步驟的實(shí)施使用水或緩沖液，以便將鹽濃度減少到低于大約0.5M。例如，鹽濃度一般被稀釋到低于大約1mM到大約1M，具體來(lái)說(shuō)，如果需要，可以稀釋到低于大約0.5M，低于大約0.4M，低于大約0.3M，低于大約0.2M，低于大約0.1M，低于大約50mM，低于大約20mM，低于大約10mM，或甚至低于大約1mM。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可以容易地確定適合的稀釋度，以減小鹽與核酸的沉淀，以便后面的步驟可以在使核酸樣品進(jìn)一步的清理或操作最少化的情況下實(shí)施。稀釋一般在水中進(jìn)行，但是也可以在任何適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行，例如Tris/EDTA或其它生物緩沖液，只要緩沖液不顯著地沉淀或引起鹽與核酸顯著地沉淀以至于抑制后面的反應(yīng)。
與現(xiàn)有的技術(shù)方法不同，不需要將被處理的核酸與亞硫酸氫鹽試劑完全分開(kāi)或分離。也不需要使用例如現(xiàn)有技術(shù)方法中所需要的層析分離方法。本發(fā)明的稀釋步驟有助于使樣品的損失最小化。
一般來(lái)說(shuō)，沉淀是使用沉淀劑例如醇類來(lái)進(jìn)行的。用于沉淀核酸的示例性的醇類可以從異丙醇、乙醇或任何其它適合的醇類中選擇。
脫磺酸基步驟可以通過(guò)將沉淀的被處理的核酸的pH調(diào)整到高達(dá)大約12.5來(lái)進(jìn)行。暴露于堿性環(huán)境往往促進(jìn)鏈在核酸中被以前暴露到酸性pH所誘導(dǎo)的脫嘌呤位點(diǎn)斷裂。因此，如果要避免鏈斷裂，堿性pH處理應(yīng)該最小化。該步驟可以使用適當(dāng)?shù)木彌_液或堿性試劑在大約pH10.5有效地進(jìn)行。適當(dāng)?shù)木彌_液或堿性試劑的例子包括pH7.0-12.5的緩沖液。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，適當(dāng)?shù)木彌_液或堿性試劑可以從廣范圍的可以獲得的已知緩沖液和堿性試劑中選擇。
脫磺酸基步驟的溫度范圍是室溫到大約96℃，時(shí)間可以從2分鐘到96小時(shí)或以上的范圍內(nèi)根據(jù)所用的條件而改變。本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以容易地確定實(shí)施脫磺酸基反應(yīng)的適合時(shí)間和溫度。低于室溫的溫度也可以使用，只要將保溫時(shí)間增加使脫磺酸基充分。因此，保溫步驟可以在大約10℃、大約20℃、大約22℃、大約25℃、大約30℃、大約35℃、大約37℃、大約40℃、大約45℃、大約50℃、大約55℃、大約60℃、大約65℃、大約70℃、大約75℃、大約80℃、大約85℃、大約90℃、大約95℃、大約96℃下進(jìn)行。實(shí)施脫磺酸基反應(yīng)的特別有用的溫度是大約55℃。這些以及其它的保溫和/或反應(yīng)步驟可以同樣地在上述的各種溫度下實(shí)施，只要反應(yīng)步驟充分地進(jìn)行。
本發(fā)明提供了對(duì)甲基化核酸進(jìn)行有效表征的方法。該方法允許對(duì)核酸樣品實(shí)施有效的磺化和脫磺酸基步驟。但是，應(yīng)該理解磺化和脫磺酸基步驟都不需要實(shí)施到反應(yīng)完成，只要實(shí)施到足以如本文公開(kāi)的隨后對(duì)甲基化核酸的表征。本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以容易地確定這些步驟是否應(yīng)該實(shí)施到接近完成，或者未完成的反應(yīng)是否足以進(jìn)行所需的分析。例如，當(dāng)使用小量的細(xì)胞或小量的核酸樣品時(shí)，一般需要進(jìn)行更完全的反應(yīng)。當(dāng)要表征較大量的核酸樣品時(shí)，可以進(jìn)行較不完全的反應(yīng)，而仍然能夠提供足夠的反應(yīng)產(chǎn)物用于后面核酸樣品的甲基化狀態(tài)分析。
正如本文所公開(kāi)的，本發(fā)明提供了方便地處理核酸的方法。正如本文所公開(kāi)的，該方法可以用于分析核酸種群的甲基化狀態(tài)，作為對(duì)細(xì)胞、組織或生物體的狀態(tài)的度量。本發(fā)明的方法與以前使用的處理核酸的方法相比提供了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的方法允許省略了傳統(tǒng)上在磺化反應(yīng)后用于核酸樣品脫鹽的層析步驟(Clark等，1994Nucleic Acids Res.222990-2997)。層析步驟導(dǎo)致磺化的核酸樣品的損失，這在用小量的起始材料進(jìn)行工作時(shí)可能是特別嚴(yán)重的問(wèn)題。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是脫鹽步驟以高效的方式通過(guò)稀釋鹽濃度和沉淀核酸來(lái)進(jìn)行。稀釋步驟將鹽濃度減少到一定量以下，使得當(dāng)核酸被沉淀時(shí)，該鹽濃度不會(huì)干擾后面的步驟例如脫磺酸基步驟。沉淀步驟是高效的，還任選包含增加核酸沉淀效率的載體。本發(fā)明的方法使核酸樣品的損失最小并增加了核酸樣品的回收率。因此，本發(fā)明的方法還提供了其它的優(yōu)點(diǎn)，允許使用甚至更少量的起始材料并且對(duì)甲基化進(jìn)行有效的表征。本發(fā)明提供的方法，通過(guò)用簡(jiǎn)單的稀釋和沉淀方法代替煩瑣和低效的層析分離方法在從核酸中除去任何不想要的試劑或稀釋劑的步驟中，對(duì)Clark等，1994 Nucleic Acids Res.222990-2997的方法進(jìn)行了改進(jìn)。
此外，微堿性pH的緩沖溶液的使用可以減少目的核酸變得基本上被片段化的可能性。將緩沖溶液的pH增加到遠(yuǎn)高于pH12.5以上，已經(jīng)被證實(shí)導(dǎo)致了非常顯著的高分子量核酸的片段化。因此，當(dāng)希望最小化這樣的片段化時(shí)，一般使用低于大約pH11的堿性pH。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于每個(gè)樣品來(lái)說(shuō)反應(yīng)可以在單一的管或容器中進(jìn)行，因此最小化了樣品的損失，并允許進(jìn)行大量樣品的處理。與以前的方法相比，本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是核酸一旦被磺化，就可以重新懸浮在具有堿性pH的緩沖液中進(jìn)行脫磺酸基步驟，而不需要象在Clark等1994所描述的方法中那樣加入強(qiáng)堿，然后除去鹽類。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的方法允許在處理前用限制性內(nèi)切酶任選消化。為了進(jìn)行成功的處理和擴(kuò)增，傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理方法一般包含了用限制性內(nèi)切酶消化的起始步驟，因此不適用于長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。但是本發(fā)明的方法在磺化反應(yīng)前不需要用限制性內(nèi)切酶預(yù)先消化，這既省略了操作步驟，同時(shí)又保留了對(duì)較長(zhǎng)片段進(jìn)行PCR的選擇。
本發(fā)明的方法可以用于表征細(xì)胞、組織或生物體甲基化狀態(tài)。本發(fā)明的方法也可以與基因組測(cè)序方法結(jié)合使用，例如Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891827-1831(1992)所描述的那些方法，在此引為參考。
本發(fā)明還提供了確定樣品的甲基化狀態(tài)的方法。對(duì)樣品來(lái)說(shuō)，該方法的實(shí)施可以使用本發(fā)明的處理核酸的方法，即HGS方法。確定樣品的甲基化狀態(tài)的方法可以用測(cè)試樣品和對(duì)照樣品平行地進(jìn)行，以便樣品的甲基化狀態(tài)可以相對(duì)于參比樣品進(jìn)行比較和確定。例如，可以對(duì)樣品進(jìn)行比較，以確定普遍來(lái)說(shuō)或在特定位點(diǎn)上甲基化是增加還是減少了。這種確定可以用于診斷和/或確定本文討論的疾病的預(yù)后。本方法還可以包含例如在診斷應(yīng)用中報(bào)告樣品的甲基化狀態(tài)。
本發(fā)明的方法特別適合于使用在試劑盒中。這樣的試劑盒一般來(lái)說(shuō)包含了實(shí)施本發(fā)明所需的試劑和說(shuō)明書(shū)。通過(guò)提供適當(dāng)?shù)脑噭┖?，有可能允許終端用戶進(jìn)行關(guān)于甲基化核酸的工作，并獲得可重復(fù)的一致的結(jié)果。
可以理解，本發(fā)明方法的成分可以以試劑盒的形式提供。試劑盒可以含有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑、反應(yīng)管和說(shuō)明書(shū)以實(shí)施本發(fā)明的方法。
實(shí)施例方法和試劑化學(xué)藥品如下獲得瓊脂糖來(lái)自BioRad(Hercules CA；被證實(shí)為分子生物學(xué)級(jí)，#161-3101)；冰乙酸來(lái)自BDH(Kylsyth，Australia；AnalaR 100015N)；乙二胺四乙酸(EDTA)來(lái)自BDH(AnalaR10093.5V)；乙醇來(lái)自Aldrich(St.Louis MO；200 proof E702-3)；異丙醇來(lái)自Sigma(St.Louis MO；99％+Sigma I-9516)；礦物油來(lái)自Sigma(M-5904)；3M的乙酸鈉溶液來(lái)自Sigma(S-7899)；氯化鈉來(lái)自Sigma(ACS試劑S9888)；以及氫氧化鈉來(lái)自BDH(AnalaR #10252.4X)。
酶/試劑如下獲得EcoRI來(lái)自Roche(Indianapolis IN；#87930626，10單位/μl)；HindIII來(lái)自Biolabs(Beverly MA；#R01045，10單位/μl)；PCR master混合物來(lái)自Promega(Madison WI；#M7505)；以及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)自Sigma(直接上樣的PCR低分子量標(biāo)準(zhǔn)100-1000bp，Sigma D-3687和100-10Kb，Sigma D-7058)。
溶液如下(1)10mM Tris/0.1M EDTA，pH7.0-12.5；(2)3M NaOH(6克溶于50ml水中，BDH AnalaR #10252.4X)；(3)2M偏亞硫酸氫鹽(7.6克溶于20ml水中，加入416μl 10N NaOH(BDH AnalaR#10356.4D))；(4)10mM對(duì)苯二酚(0.055克溶于50ml水中；BDH AnalaR#103122E)；(5)50X TAE凝膠電泳緩沖液(242克Tris堿，57.1ml冰乙酸，37.2克EDTA，加水到1升)；以及(6)5X瓊脂糖凝膠載樣緩沖液(1ml 1％的溴酚藍(lán)(Sigma B6131)，1ml二甲苯藍(lán)(Sigma X-4126)，3.2ml甘油(Sigma G6279)，8μl 0.5M EDTA pH8.0，200μl 50XTAE緩沖液，加水到10ml)。
組織和細(xì)胞學(xué)組織和細(xì)胞學(xué)如下獲得HeLa(宮頸癌細(xì)胞學(xué)，ATCC CCL-2)；LNCaP(前列腺癌細(xì)胞學(xué)，ATCC#CRL-10995)；HepG2(肝癌細(xì)胞學(xué)；ATCC#HB-8065)；以及MCF-7(乳腺癌細(xì)胞學(xué)，ATCC#HTB-22)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。
為了制備用于LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的T培養(yǎng)基，如下的試劑除了特別指明外，從Gibco/BRL或Invitrogen獲得DMEM干粉10X小袋(10×1L；#31600-034)；F-12K Kaighn氏修改的營(yíng)養(yǎng)混合物(500ml；#21127-022)；L-谷氨酰胺，200mM(100ml；#25030-081)；青/鏈霉素5000U/ml，5000μg/ml(100ml#15070-063，痕量熱源)；胎牛血清(500ml；#15-010-0500V Sigma)；胰島素(牛胰)(100mg；#1882)；轉(zhuǎn)鐵蛋白(人)(10mg；#T5391)；α-生物素(500mg；#B4639)；腺嘌呤(5g；#A3159)；T3(#T6397或#T5516)。
T培養(yǎng)基(500ml)如下配制DMEM儲(chǔ)存溶液通過(guò)每升加入3.7克碳酸氫鈉并將pH調(diào)整到7.2-7.4之間而制備。在400ml DMEM儲(chǔ)存溶液中加入下列試劑100ml F-12K、250μl胰島素(10mg/ml)、1.0mlT3(500x；三碘甲腺原氨酸；6.825ng/ml)、1.0ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(500x；2.5mg/ml)、1.0ml生物素(500x；0.122mg/ml)、4.0ml腺嘌呤(125x；3.125mg/ml)、5.5ml青/鏈霉素(100x；5000μg/ml)、以及5.5ml谷氨酰胺(100x；200mM)。過(guò)濾除菌后，加入50ml胎牛血清，使?jié)舛冗_(dá)到10％。
表1列出了在下面的實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞學(xué)及生長(zhǎng)條件。

從全血中純化T細(xì)胞和CD34+細(xì)胞樣品從悉尼皇家北岸醫(yī)院(Royal North Shore Hospital)一個(gè)經(jīng)歷了白細(xì)胞除去術(shù)的病人獲得。樣品的獲得預(yù)先得到了倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。使用Ficoll Paque plus(Amersham Biosciences # 17-1440-03；PiscataWay NJ)按照制造商的說(shuō)明將白細(xì)胞濃縮。T細(xì)胞和CD34+細(xì)胞分別使用CELLection CD2 Dynabeads(Dynal#116.03；Lake SuccessNY)和Dynal CD34始祖細(xì)胞選擇系統(tǒng)(Dynal # 113.01)按照制造商的說(shuō)明從白細(xì)胞中分離。
使用了下列設(shè)備PCR儀是ThermalHybaid PX2(Sydney，Australia)，凝膠記錄系統(tǒng)是Kodak UVltec EDAS 290(Rochester NY)，微量離心機(jī)是Eppendorf 5415-D(Brinkman Instruments；WestburyNY)。
DNA擴(kuò)增PCR擴(kuò)增在含有2μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，使用Promega PCR master混合物，每種引物6ng/μl。用于從亞硫酸氫鹽處理的DNA擴(kuò)增GSTP1的鏈特異性的嵌套引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQ ID NO1)(F)，GST-10(1307-1332)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT(SEQ ID NO2)(R)，GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(SEQ ID NO3)(F)，GST-12(1281-1306)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(SEQ IDNO4)(R)。引物的位置按照GSTP1序列(GenBank登記號(hào)M24485；Morrow等，Gene 753-11(1989))標(biāo)明。
RNA純化Du145細(xì)胞在T75組織培養(yǎng)瓶中在上述的條件下生長(zhǎng)至90％匯合。將培養(yǎng)基丟棄，加入3ml Trizol(Invitrogen Cat#15596-026)，樣品如下處理I、樣品完全混合，室溫放置5分鐘使核蛋白復(fù)合物解離。
II、然后將樣品在4℃下12000Xg離心10分鐘以除去高分子量DNA和其它污染物。
III、將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，加入100μl 100％的氯仿，用手將樣品劇烈混合15秒，然后在室溫保溫2-3分鐘。
IV、然后將樣品在4℃下12000Xg離心10分鐘使相分離。
V、將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈的管中，確保吸管頭不接觸到界面，加入1μl 20mg/ml的糖原，將樣品震蕩混合。
VI、加入等體積(0.25ml)的100％，震蕩管子，然后在室溫放置10分鐘。
VII、然后將樣品在4℃下12000Xg離心10分鐘使RNA沉淀。
VIII、取出上清液，用0.75ml 80％的乙醇清洗沉淀以除去cDNA合成反應(yīng)的抑制劑，簡(jiǎn)單震蕩，然后在4℃下7500Xg離心5分鐘使RNA沉淀。
IX、重復(fù)步驟VIII一次。
X、然后將沉淀在微量離心機(jī)中離心10秒，除去殘留的乙醇，將沉淀立即重新懸浮在25μl無(wú)RNase的水中。注意如果沉淀干透將很難重新懸浮RNA，260/280比率將低于1.6。
XI、然后記錄OD 260/280/310。
XII、然后將純化的RNA儲(chǔ)存在-70℃，備用。
cDNA合成cDNA合成使用superscript III(Invitrogen Cat# 18080-044)和100ng隨機(jī)heamers(Invitrogen Cat# 48910-011)按照制造商說(shuō)明書(shū)的推薦進(jìn)行。
RNA擴(kuò)增PCR擴(kuò)增在含有2μl亞硫酸氫鹽處理的反轉(zhuǎn)錄的基因組RNA的25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，使用Promega PCR master混合物，每種引物6ng/μl。用于從亞硫酸氫鹽處理的RNA擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白的鏈特異性的引物是ActinBS-3A(2076-2097)TTAATATTTTAGTTATGTATGTTGT(SEQID NO5)；ActinBS-4(2720-2744)CTTCATTATACTAAATACCAAA(SEQ ID NO6)。
用于野生型肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的對(duì)照引物也被包括，以確保擴(kuò)增的RNA是源自亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的RNA而不是源自野生型RNA。合成了下面的野生型引物肌動(dòng)蛋白野生型3A(2076-2097)TCAACACCCCAGCCATGTACGTTGC(SEQ ID NO7)，肌動(dòng)蛋白野生型4(2720-2744)GATCTTCATTGTGCTGGGTGCC(SEQ IDNO8)。引物的位置按照人類β-肌動(dòng)蛋白基因序列(登記號(hào)M10277)標(biāo)明。
核酸分離在1％TAE中制備1％或2％的瓊脂糖凝膠，每50ml瓊脂糖中含有1滴溴化乙錠(CLP#5450)。目的(基因組的或PCR衍生的)DNA或RNA樣品與五分之一體積5X的瓊脂糖載樣緩沖液混合，在X1 TAE中使用水下水平電泳槽在125mA電泳。
DNA的傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽處理(Clark等，(1994)Nucleic Acids Res.222990-2997，在此引為參考)(現(xiàn)有技術(shù)方法導(dǎo)致極低的DNA產(chǎn)量)基因組DNA(2μg)在20μl終體積中用EcoRI消化至少60分鐘。在消化液中加入2.2μl 3M NaOH(50ml水中含6克NaOH，新鮮配制)，37℃保溫15分鐘。然后加入208μl 2M偏亞硫酸氫鹽(7.6克偏亞硫酸氫鹽溶于20ml水中，加入416μl 10M NaOH到pH5.0)，再加入12μl10mM對(duì)苯二酚(0.55克對(duì)苯二酚得到100mM，稀釋10倍)。反應(yīng)混合物用200μl礦物油覆蓋，在50-55℃保溫過(guò)夜。在保溫結(jié)束時(shí)，除去礦物油，加入1μg酵母tRNA(Sigma R-8508)。
使用Wizard DNA清理系統(tǒng)(Promega #7280)按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA脫鹽。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在樣品中加入1ml樹(shù)脂，震蕩樣品。將樣品通過(guò)2.5ml注射器緩慢壓到柱子中。柱子用2ml 80％的異丙醇清洗，然后在微量離心機(jī)中14000rpm離心20秒。在柱子中加入50μl水，，將樣品在室溫放置1分鐘。將柱子中的物質(zhì)放入干凈的1.5ml離心管，在微量離心機(jī)中14000rpm離心20秒。DNA被回收在洗脫液中，準(zhǔn)備用于脫磺酸基反應(yīng)。
為了從尿嘧啶中除去磺酸基，在洗脫的DNA中加入5.5μl 3MNaOH，將混合物在37℃保溫15分鐘。加入33.5μl NH4OAC(pH7.0)中和堿。加入330μl 100％的乙醇，反應(yīng)混合物在-20℃保溫60分鐘。樣品在14000rpm離心15分鐘，將乙醇丟棄。將沉淀空氣干燥，重新懸浮在10μl T/E(pH8.0)中。
核酸的HGS亞硫酸氫鹽處理下面給出了一個(gè)示例性的方案以證實(shí)本發(fā)明的亞硫酸氫鹽處理方法的有效性。該方案導(dǎo)致成功地保留了幾乎所有被處理的核酸。本發(fā)明的這種方法在此也被稱為HGS亞硫酸氫鹽方法。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到樣品或試劑的體積或量可以改變。
DNA變性向如果需要預(yù)先用合適的限制酶消化的2μg DNA中，加入2μl(1/10體積)3M NaOH(50ml水中含6克NaOH，新鮮配制)到終體積為20μl。這個(gè)步驟將雙鏈DNA分子變性成單鏈的形式，因?yàn)閬喠蛩釟潲}試劑優(yōu)選與單鏈分子反應(yīng)?；旌衔镌?7℃保溫15分鐘?？梢栽诟哂谑覝氐臏囟缺匾蕴岣咦冃缘男省?br> RNA變性2μg RNA重新懸浮在總體積20μl中，其中含有1μl RNase抑制劑(RNaseOUT Invitrogen Cat# 10777-019 40U/μl)。然后將溶液在50℃加熱2分鐘，接著在冰上驟冷(可選)。該步驟將RNA分子變性成基本上不含二級(jí)結(jié)構(gòu)的形式，因?yàn)閬喠蛩釟潲}試劑優(yōu)選與單鏈分子反應(yīng)。
DNA的亞硫酸氫鹽處理保溫后，連續(xù)加入208μl 2M偏亞硫酸氫鈉(7.6克偏亞硫酸氫鈉溶于20ml水中，加入416ml 10N NaOH；BDH AnalaR #10356.4D；新鮮配制)和12μl 10mM對(duì)苯二酚(0.055克對(duì)苯二酚到50ml水中，BDH AnalaR #103122E；新鮮配制)。對(duì)苯二酚是還原試劑，幫助減少試劑的氧化。其它的還原試劑也可以使用，例如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、醌(甲代二氫醌)，或其它適當(dāng)?shù)倪€原試劑。樣品用200μl礦物油覆蓋。礦物油覆蓋是為了防止試劑的蒸發(fā)和氧化，但不是必需的。然后將樣品在55℃保溫過(guò)夜。此外，樣品可以在熱循環(huán)儀中進(jìn)行如下的循環(huán)如下保溫約4小時(shí)或過(guò)夜第一步，在PCR儀中55℃循環(huán)2小時(shí)；第二步，95℃2分鐘。第一步可以在任何溫度下進(jìn)行，從大約37℃到大約90℃，時(shí)間長(zhǎng)度可以從5分鐘到8小時(shí)之間變化。第二步可以在任何溫度下進(jìn)行，從大約70℃到大約99℃，時(shí)間長(zhǎng)度可以從1秒到60分鐘或更長(zhǎng)之間變化。
在用偏亞硫酸氫鈉處理后，將油除去，如果DNA濃度低的話加入1μg tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。這些添加劑是可選的，可以用來(lái)增加與靶DNA共沉淀所獲得的DNA的產(chǎn)量，特別是當(dāng)DNA以低濃度出現(xiàn)時(shí)。當(dāng)核酸量低于0.5μg時(shí)，一般希望使用添加劑作為載體以更有效地沉淀核酸。
異丙醇清理處理如下進(jìn)行在樣品中加入800μl水，混合，然后加入1ml異丙醇。水或緩沖液將反應(yīng)容器中的亞硫酸氫鹽的濃度減少到鹽不隨著目的靶核酸沉淀的水平。稀釋度一般為大約4倍或1000倍，只要鹽濃度被稀釋到低于本文公開(kāi)的希望的范圍。
樣品再次混合，在4℃放置最少5分鐘。樣品在微量離心機(jī)中離心10-15分鐘，沉淀用80％乙醇清洗2次，每次渦旋振蕩。清洗處理除去了任何隨著核酸沉淀下來(lái)的殘留的鹽。
將沉淀干燥，然后重新懸浮在適當(dāng)體積例如50μl的T/E中(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5。pH10.5的緩沖液被發(fā)現(xiàn)特別有效。樣品在37-95℃保溫1分鐘到96小時(shí)，視懸浮核酸的需要而定。
上述的方法之前可以用一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶消化。如下所述對(duì)同樣的DNA樣品進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶消化。消化選擇的酶依賴于被擴(kuò)增的序列。例如，用EcoRI在20μl體積中于37℃將2μg基因組DNA消化1小時(shí)。這個(gè)步驟用于將基因組DNA消化為較小的片段，它們比基因組DNA更易于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。也可以使用超聲或物理力將DNA剪切成較小的片段。超聲的強(qiáng)度和超聲的時(shí)間長(zhǎng)度根據(jù)所希望的DNA片段的大小來(lái)選擇。進(jìn)行另一個(gè)消化反應(yīng)，例如用HindIII如前所述消化2μg基因組DNA。對(duì)于預(yù)處理消化來(lái)說(shuō)，可以選擇這些酶或其它適合的限制性酶。被消化的DNA如前所述用偏亞硫酸氫鹽進(jìn)行處理。
RNA的亞硫酸氫鹽處理保溫后，加入208μl 2M偏亞硫酸氫鈉(7.6克偏亞硫酸氫鈉溶于20ml水中，加入416ml 10N NaOH；BDH AnalaR #10356.4D；新鮮配制)。樣品用200μl礦物油覆蓋。礦物油覆蓋是為了防止試劑的蒸發(fā)和氧化，但不是必需的。然后將樣品在37-55℃保溫3小時(shí)到過(guò)夜。此外，樣品可以在熱循環(huán)儀中進(jìn)行如下的循環(huán)如下保溫4小時(shí)或過(guò)夜第一步，在PCR儀中55℃循環(huán)2小時(shí)；第二步，70℃30秒。第一步可以在任何溫度下進(jìn)行，從大約37℃到大約90℃，時(shí)間長(zhǎng)度可以從5分鐘到8小時(shí)之間變化。第二步可以在任何溫度下進(jìn)行，從大約60℃到大約99℃，時(shí)間長(zhǎng)度可以從1秒到60分鐘或更長(zhǎng)之間變化。
在用偏亞硫酸氫鈉處理后，將油除去，如果RNA濃度低的話加入1μl糖原。該添加劑是可選的，可以用來(lái)增加與靶RNA共沉淀所獲得的RNA的產(chǎn)量，特別是當(dāng)RNA以低濃度出現(xiàn)時(shí)。當(dāng)核酸量低于0.5μg時(shí)，一般希望使用添加劑作為載體以更有效地沉淀核酸。
異丙醇清理處理如下進(jìn)行在樣品中加入800μl水，混合，然后加入1ml異丙醇。水或緩沖液將反應(yīng)容器中的亞硫酸氫鹽的濃度減少到鹽不隨著目的靶核酸沉淀的水平。稀釋度一般為大約4倍或1000倍，只要鹽濃度被稀釋到低于本文公開(kāi)的希望的范圍。
樣品再次混合，在室溫放置15分鐘。樣品在微量離心機(jī)中離心10-15分鐘，沉淀用80％乙醇清洗2次，在清洗之間進(jìn)行渦旋振蕩。清洗處理除去了任何隨著核酸沉淀下來(lái)的殘留的鹽。
將沉淀干燥，然后重新懸浮在適當(dāng)體積例如50μl的T/E中(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5。pH10.5的緩沖液被發(fā)現(xiàn)特別有效。樣品在37-95℃保溫1分鐘到96小時(shí)，視懸浮核酸的需要而定。
也可以使用超聲或物理力將RNA剪切成較小的片段。超聲的強(qiáng)度和超聲的時(shí)間長(zhǎng)度根據(jù)所希望的RNA片段的大小來(lái)選擇。
結(jié)果LNCaP細(xì)胞的DNA分析和PCR擴(kuò)增的靈敏度LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)物在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)到90％匯合。細(xì)胞用胰蛋白酶處理，清洗，然后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。然后將細(xì)胞稀釋到含有表2中所示的大概細(xì)胞數(shù)量。然后使用MasterPure DNA純化試劑盒(Epicentre #MCD85201；Madison WI)按照制造商說(shuō)明書(shū)的描述將細(xì)胞裂解，使用上述的兩種磺化方法對(duì)DNA進(jìn)行修飾。
在精確地測(cè)定了細(xì)胞數(shù)量之后，培養(yǎng)物被分成2份放入1.5mleppendorf離心管中，在25μl T/E pH8.0中各含有100、1000、10000和100000個(gè)細(xì)胞。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，使用MasterPure DNA純化試劑盒(Epicentre #MCD85201)按照制造商說(shuō)明書(shū)的描述進(jìn)行。
將DNA重新懸浮在10μl T/E pH8.0中。然后用1單位EcoRI(Roche#87930626 10單位/μl)按照制造商說(shuō)明書(shū)在終體積20μl中于37℃消化DNA 1小時(shí)。
一組平行樣用傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽方法(Clark等1994)處理DNA，另一組用HGS亞硫酸氫鹽方法處理DNA。處理后將DNA重新懸浮在5μl T/E pH8.0中。
對(duì)1μl，即1/5最終重新懸浮樣品體積的被處理的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法如下。PCR擴(kuò)增在25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，含有1μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA，使用Promega master混合物，每種引物6ng/μl。用于從亞硫酸氫鹽處理的DNA擴(kuò)增GSTP1的鏈特異性嵌套引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQID NO1)(F)和GST-10(1307-1332)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT(SEQ ID NO2)(R)，使用第一輪擴(kuò)增條件。
1μl第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到含有下列引物的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)混合物中GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(SEQ ID NO3)(F)和GST-12(1281-1306)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(SEQID NO4)(R)。引物的位置按照GSTP1序列(GenBank登記號(hào)M24485)標(biāo)明。PCR產(chǎn)物樣品在ThermoHybaid PX2熱循環(huán)儀中擴(kuò)增，使用Clark等描述的條件。
在1％TAE中制備2％的瓊脂糖凝膠，每50ml瓊脂糖中含有1滴溴化乙錠(CLP #5450)。5μl PCR產(chǎn)物與1μl 5X的瓊脂糖載樣緩沖液混合，在X1 TAE中使用水下水平電泳槽在125mA電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)是低分子量的100-1000bp類型。凝膠在UV照射下觀察，使用KodakUVIdoc EDAS 290系統(tǒng)。
表2顯示了本發(fā)明的方法和Clark等的傳統(tǒng)方法之間PCR擴(kuò)增靈敏度的比較。
表2、使用HGS方法和傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽擴(kuò)增步驟(Clark等，1994)對(duì)GSTP1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的靈敏度比較

pH對(duì)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的降解的影響用2單位EcoRI(Roche #87930626 10單位/μl)按照制造商的說(shuō)明將2μg LNCaP DNA在終體積20μl中于37℃消化1小時(shí)。共進(jìn)行8個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)。
對(duì)每個(gè)消化產(chǎn)物進(jìn)行DNA的HGS亞硫酸氫鹽處理。處理后，每個(gè)單獨(dú)的處理得到的DNA被重新懸浮在20μl T/E中，pH為7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和12.5。
然后使用下面的方法將DNA保溫。
處理方法1HGS亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA被重新懸浮在pH10.5的緩沖溶液中，在37℃放置30分鐘，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
處理方法2HGS亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA被重新懸浮在pH10.5的緩沖溶液中，在37℃放置120分鐘，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
處理方法3HGS亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA被重新懸浮在pH10.5的緩沖溶液中，在55℃放置30分鐘，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在1％TAE中制備1％的瓊脂糖凝膠，每50ml瓊脂糖中含有1滴溴化乙錠(CLP#5450)。10μl基因組DNA樣品與1/5體積(2μl)5X的瓊脂糖載樣緩沖液混合，在X1 TAE中使用水下水平電泳槽在125mA電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)是100-10000bp范圍的。凝膠在UV照射下觀察并照相，使用Kodak UVIdoc EDAS 290系統(tǒng)。
樣品的PCR分析對(duì)1μl亞硫酸氫鹽處理的DNA重懸浮樣品如下描述進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增在25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，含有1μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA，使用Promega master混合物，每種引物6ng/μl。用于從亞硫酸氫鹽處理的DNA擴(kuò)增GSTP1的鏈特異性嵌套引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQ ID NO1)(F)和GST-10(1307-1332)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT(SEQ ID NO2)(R)，使用第一輪擴(kuò)增條件。
1μl第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到含有下列引物的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)混合物中GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(SEQ ID NO3)(F)和GST-12(1281-1306)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(SEQID NO4)(R)。引物的位置按照GSTP1序列(GenBank登記號(hào)M24485)標(biāo)明。PCR產(chǎn)物樣品在ThermoHybaid PX2熱循環(huán)儀中擴(kuò)增，使用Clark等1994中描述的條件。
在1％TAE中制備2％的瓊脂糖凝膠，每50ml瓊脂糖中含有1滴溴化乙錠(CLP #5450)。5μl PCR產(chǎn)物與1μl 5X的瓊脂糖載樣緩沖液混合，在X1 TAE中使用水下水平電泳槽在125mA電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)是低分子量的100-1000bp類型。凝膠在UV照射下觀察，使用KodakUVIdoc EDAS 290系統(tǒng)。
結(jié)果概述在表3中。表3結(jié)果的第一點(diǎn)證實(shí)當(dāng)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA溶液的pH低時(shí)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法不能檢測(cè)到明顯的擴(kuò)增信號(hào)。這可能是由于亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA脫磺酸基反應(yīng)不完全。
表3的結(jié)果表明在pH和溫度之間針對(duì)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的脫磺酸基反應(yīng)的速度存在動(dòng)態(tài)平衡。如果亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA保留在低pH的溶液中，那么脫磺酸基反應(yīng)的速度非常慢，但是可以通過(guò)提高溶液的溫度而加快。例如，有可能使亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA在pH7.0下于72℃加熱并保留48小時(shí)，從而達(dá)到完全的脫磺酸基作用。同樣地，在pH10.5下于72℃反應(yīng)可以在5分鐘內(nèi)完成。因此，從室溫到大約95℃的溫度范圍對(duì)本發(fā)明是適合的。pH范圍從7.0到12.5以及保溫時(shí)間從大約1分鐘到大約96小時(shí)將是適合的。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到各種可能的pH、時(shí)間和溫度的組合將是適合的。
此外，如果樣品用常規(guī)的方法處理，當(dāng)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA通過(guò)分子量排阻層析柱進(jìn)行溶液脫鹽時(shí)將有DNA的大量損失。非?？赡軐⒂兄辽?0％亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA損失，如果不是更多的話，因?yàn)樵诂F(xiàn)有工藝中使用的常規(guī)柱不是為了單鏈DNA材料設(shè)計(jì)的，有較大的損失。使用不含柱純化步驟的HGS方法，損失將是很小的。
表3、pH對(duì)使用HGS方法進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的降解的影響

處理方法1HGS亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA被重新懸浮在pH10.5的緩沖溶液中，在37℃放置30分鐘，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
處理方法2HGS亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA被重新懸浮在pH10.5的緩沖溶液中，在37℃放置120分鐘，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
處理方法3HGS亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA被重新懸浮在pH10.5的緩沖溶液中，在55℃放置30分鐘，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
各種不同細(xì)胞學(xué)和組織的亞硫酸氫鹽處理1μg來(lái)自下列細(xì)胞學(xué)和組織樣品的DNA用2單位EcoRI(Roche#87930626 10單位/μl)按照制造商的說(shuō)明在終體積20μl中于37℃消化1小時(shí)，一式二份LNCaP前列腺癌細(xì)胞學(xué)DNA、MCF-7乳腺癌細(xì)胞學(xué)DNA、BL-13膀胱癌細(xì)胞學(xué)DNA、HepG2肝癌細(xì)胞學(xué)DNA、HeLa宮頸癌細(xì)胞學(xué)DNA、從病人#1純化的T細(xì)胞以及從病人#1純化的CD34+細(xì)胞。
一組消化樣品進(jìn)行DNA的HGS亞硫酸氫鹽處理。處理后，從每個(gè)單獨(dú)樣品獲得的DNA被重新懸浮在20μl T/E pH10.5中，在55℃保溫2小時(shí)。對(duì)另一組消化樣品進(jìn)行DNA的傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽處理，在DNA被修飾后重新懸浮在20μl T/E pH8.0中。
樣品的PCR分析對(duì)1μl傳統(tǒng)和HGS亞硫酸氫鹽處理的DNA都進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)于每個(gè)樣品分析了6個(gè)單獨(dú)的基因組位點(diǎn)，以確定HGS和傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽修飾方法所描繪的基因組覆蓋范圍。
PCR擴(kuò)增在25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，含有1μl亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA，使用Promega master混合物，每種第一輪基因特異性引物引物6ng/μl。1μl第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到第二輪擴(kuò)增反應(yīng)混合物中，其中含有第二輪基因特異性引物。PCR產(chǎn)物在ThermoHybaid PX2熱循環(huán)儀中擴(kuò)增，使用Clark等1994中描述的條件。
在1％TAE中制備2％的瓊脂糖凝膠，每50ml瓊脂糖中含有1滴溴化乙錠(CLP#5450)。5μl PCR產(chǎn)物樣品與1μl 5X的瓊脂糖載樣緩沖液混合，在X1 TAE中使用水下水平電泳槽在125mA電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)是低分子量的100-1000bp類型。凝膠在UV照射下觀察，使用Kodak UVIdoc EDAS 290系統(tǒng)。
用HGS亞硫酸氫鹽方法處理的基因組DNA使用常規(guī)的PCR技術(shù)和設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)GSTP1基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增?，F(xiàn)有技術(shù)方法與本發(fā)明的方法之間比較的結(jié)果顯示在表4中。
表4中的組織樣品如下a)LNCaP前列腺癌細(xì)胞學(xué)DNAb)MCF-7乳腺癌細(xì)胞學(xué)DNAc)HepG2肝癌細(xì)胞學(xué)DNAd)HeLa宮頸癌細(xì)胞學(xué)DNAe)從病人#1純化的T細(xì)胞f)從病人#1純化的CD34+細(xì)胞圖1顯示了HGS亞硫酸氫鹽方法和傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽方法(Clark等1994)之間從不同的組織樣品得到的亞硫酸氫鹽處理的DNA回收率的比較?？?1是從2個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#2是從20個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#3是從200個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#4是從2000個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA；孔#5是從20000個(gè)LNCaP細(xì)胞提取并用亞硫酸氫鹽處理的DNA。
從圖1中可以看到，使用本發(fā)明的方法得到的DNA回收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)方法的回收率。
表4、HGS方法與傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽方法擴(kuò)增步驟(Clark等1994)的全基因組擴(kuò)增效率的比較

RNA結(jié)果圖2顯示了用HGS亞硫酸氫鹽處理從前列腺癌細(xì)胞學(xué)Dul45提取的RNA所獲得的結(jié)果與使用常規(guī)的亞硫酸氫鹽方法處理獲得的結(jié)果的比較。
可以看到，在所有用HGS方法于4℃、室溫和55℃處理的樣品中都觀察到了高分子量RNA。23S、18S和5S核糖體RNA帶清晰可見(jiàn)，也可以看見(jiàn)與對(duì)照相比，幾乎沒(méi)有RNA的降解。相反，用常規(guī)方法處理的RNA已經(jīng)被完全降解了。
圖3顯示了在不同的溫度下保溫時(shí)RNA穩(wěn)定性的時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)。從結(jié)果可以看出在保溫的第一個(gè)30分鐘發(fā)生了小量的降解，然后卻達(dá)到了幾乎穩(wěn)定的狀態(tài)，隨后損失很少，即使是在55℃保溫16小時(shí)以后。
圖4顯示了對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的RNA和野生型RNA所進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄酶PCR。可以看到，在亞硫酸氫鹽處理的RNA中看到了強(qiáng)烈的PCR擴(kuò)增信號(hào)，其大小與野生型RNA中的帶相同。
當(dāng)亞硫酸氫鹽處理的RNA作為模板使用野生型引物進(jìn)行RT-PCR或野生型RNA作為模板使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的引物進(jìn)行RT-PCR時(shí)沒(méi)有觀察到帶。這表明亞硫酸氫鹽反應(yīng)以接近100％的效率將野生型RNA轉(zhuǎn)化為被轉(zhuǎn)化的RNA。
圖5證明了對(duì)圖4中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物是來(lái)自亞硫酸氫鹽處理的基因組RNA。箭頭指示了人β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄本中外顯子3和4之間的剪接位點(diǎn)。
本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)于本發(fā)明在特定實(shí)施方案中顯示的方法可以進(jìn)行大量的變動(dòng)和/或修改，而不偏離被廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍。因此，本實(shí)施方案將在所有的方面被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。
序列表<110>人類遺傳標(biāo)記控股有限公司(Human Genetic Signatures)<120>核酸的處理(Treatment of methylated nucleic acid)<130>SCT054695-47<150>US 10/428310<151>2003-02-05<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>27<212>DNA<213>human<400>1tttgttgttt gtttattttt taggttt 27<210>2<211>26<212>DNA<213>Human
<400>2aacctaatac taccaattaa ccccat 26<210>3<211>29<212>DNA<213>Human<400>3gggatttggg aaagagggaa aggtttttt 29<210>4<211>26<212>DNA<213>Human<400>4actaaaaact ctaaaaaccc catccc 26<210>5<211>25<212>DNA<213>Human<400>5ttaatatttt agttatgtat gttgt 25
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1.處理核酸的方法，包括(a)為核酸樣品提供變性環(huán)境；(b)將核酸樣品與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng)并將反應(yīng)保溫以形成被處理的核酸樣品，使核酸樣品中甲基化的核苷酸保持不變，而未甲基化的核苷酸被轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形式；(c)將被處理的核酸樣品稀釋以便使鹽濃度減少到基本上不干擾核酸沉淀步驟的水平；(d)將稀釋的被處理的核酸沉淀，以便從被處理的核酸樣品中基本上除去任何不想要的試劑或稀釋劑；以及(e)對(duì)沉淀的被處理的核酸進(jìn)行脫磺酸基，以便除去被處理的核酸中存在的磺酸基，從而獲得基本上不含磺酸基的核酸樣品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中樣品中超過(guò)大約50％的起始核酸被保留了。
3.權(quán)利要求2的方法，其中樣品中超過(guò)大約75％的起始核酸被保留了。
4.權(quán)利要求3的方法，其中樣品中超過(guò)大約95％的起始核酸被保留了。
5.權(quán)利要求1-4任何一個(gè)的方法，還包括(f)加工和分析被處理的核酸樣品。
6.權(quán)利要求1-5任何一個(gè)的方法，其中的樣品含有DNA，樣品含有RNA，或樣品含有DNA和RNA的組合。
7.權(quán)利要求1-6任何一個(gè)的方法，其中的樣品從組織、器官、細(xì)胞、微生物、生物樣品或環(huán)境樣品中制備。
8.權(quán)利要求1-7任何一個(gè)的方法，在反應(yīng)容器中進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的反應(yīng)容器從試管、平板、毛細(xì)管、孔、離心管、微量離心管、載玻片、蓋玻片和表面中選擇。
10.權(quán)利要求1-9任何一個(gè)的方法，其中的亞硫酸氫鹽試劑是偏亞硫酸氫鈉。
11.權(quán)利要求1-10任何一個(gè)的方法，其中通過(guò)加入堿為樣品提供變性環(huán)境。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的堿是NaOH、KOH或任何提供羥基基團(tuán)的化合物或試劑。
13.權(quán)利要求1-10任何一個(gè)的方法，其中通過(guò)加熱為樣品提供變性環(huán)境。
14.權(quán)利要求13的方法，其中加熱高達(dá)大約95℃。
15.權(quán)利要求14的方法，其中加熱是從50℃到70℃。
16.權(quán)利要求1-15任何一個(gè)的方法，其中的提供步驟(a)是在存在能夠增強(qiáng)亞硫酸氫鹽反應(yīng)的添加劑的情況下進(jìn)行的。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的添加劑從對(duì)苯二酚、尿素、甲氧胺和其混合物中選擇。
18.權(quán)利要求1-17任何一個(gè)的方法，其中的反應(yīng)步驟(b)導(dǎo)致核酸樣品中甲基化的胞嘧啶保持不變，而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。
19.權(quán)利要求1-18任何一個(gè)的方法，其中的稀釋步驟(c)用水來(lái)進(jìn)行，以使鹽濃度減少到低于大約0.5M。
20.權(quán)利要求1-19任何一個(gè)的方法，其中的沉淀使用醇類沉淀劑來(lái)進(jìn)行。
21.權(quán)利要求20的方法，其中的醇類沉淀試劑從異丙醇、乙醇、丁醇、甲醇及其混合物中選擇。
22.權(quán)利要求21的方法，其中的醇類是異丙醇。
23.權(quán)利要求1-22任何一個(gè)的方法，其中脫磺酸基步驟(d)是通過(guò)用緩沖液或堿性試劑將沉淀的被處理核酸調(diào)整到高達(dá)大約pH12.5來(lái)進(jìn)行的。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的pH被調(diào)整到大約10.5。
25.實(shí)施權(quán)利要求1-24任何一個(gè)的方法的試劑盒，包括含有試劑的容器和使用試劑的說(shuō)明書(shū)。
26.權(quán)利要求25的試劑盒，其中的試劑含有稀釋劑、亞硫酸氫鹽試劑和堿。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其中的亞硫酸氫鹽試劑是偏亞硫酸氫鈉。
全文摘要
本發(fā)明提供了處理核酸、特別是被甲基化的核酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟(a)為核酸樣品提供變性的環(huán)境；(b)將核酸樣品與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng)并將反應(yīng)保溫以形成被處理的核酸樣品，使核酸樣品中甲基化的核苷酸保持不變，而未甲基化的核苷酸被轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形式；(c)將被處理的核酸樣品稀釋以便使鹽濃度減少到基本上不干擾核酸沉淀步驟的水平；(d)將稀釋的被處理的核酸沉淀，以便從被處理的核酸中基本上除去任何不想要的試劑或稀釋劑；以及(e)對(duì)沉淀的被處理的核酸進(jìn)行脫磺酸基，以便除去被處理的核酸中存在的磺酸基，從而獲得基本上不含磺酸基的核酸樣品。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1784417SQ200480011970
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月2日
發(fā)明者道格拉斯·斯潘塞·米勒, 卡珊德拉·吉恩·弗克勒, 克拉利·安·庫(kù)爾斯頓 申請(qǐng)人:人類遺傳標(biāo)記控股有限公司