專利名稱：用于核酸測試的對照的制作方法
用于核酸測試的對照發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及如下檢測試樣中的目標生物分子的方法向試樣、陰 性對照樣品、陽性對照樣品和試劑對照樣品加入內(nèi)部對照(internal control)生物分子，或向試樣、陰性對照樣品、包含目標生物分子的陽 性對照樣品加入內(nèi)部對照生物分子，提供含目標生物分子的試劑對照 樣品，測定每個樣品中的信號，并驗證該信號，由此檢測目標生物分 子。本發(fā)明還涉及驗證指示存在目標生物分子之信號的測定結(jié)果的方 法。本發(fā)明還涉及檢測樣品中是否存在目標核酸群成員的方法，以及 馬IS正指示存在目標核酸群成員之信號的測定結(jié)果的方法。還考慮了用 途和試劑盒。發(fā)明背景核酸測定已成為分析化學(xué)中的重要工具，尤其是在衛(wèi)生保健中。 例如，感染性疾病和遺傳狀態(tài)可基于得自個體的樣品中指示所述疾病 或狀態(tài)的核酸的存在情況或量容易地確定。為此，建立了使用核酸、 優(yōu)選寡核苷酸與指示該疾病或遺傳狀態(tài)的目標核酸的序列特異性雜 交的方法。許多目標核酸在生物體中以如此低濃度存在，以至于不可 能在來源于該生物體的樣品中直接檢測。這些目標需要在檢測前擴 增。適宜的擴增方法為例如LCR(美國專利第5,185,243、 5,679,524和 5,573,907號;EP 0 320 308; WO 90/01069; WO 89/12696;和WO 89/09835)、循環(huán)探針技術(shù)(美國專利第5,011,769、 5,403,711、 5,660,988 和4,876，187號，以及PCT公布申請WO 95/05480、 WO 95/14106和 WO 95/00667)、 InvaderTM技術(shù)(美國專利第5,846,717、 5,614,402、 5,719,028、 5,541,311和5,843,669號)、Q-P復(fù)制酶技術(shù)(美國專利第4,786,600號)、NASBA (美國專利笫5,409,818號；EP-0 329 822)、 TMA (美國專利第5,399,491、 5,888,779、 5,705,365、 5,710,029號)、SDA (美 國專利第5,455,166和5,130,238號)和PCR (US-A-4,683，202)。為了使核酸測定中的假陽性結(jié)果最小化，幾個國家的管理機構(gòu)要 求使用對照核酸。尤其是在使用擴增方法時，這樣的對照核酸非常重 要，因為擴增過程可受到反應(yīng)條件的強烈影響，可產(chǎn)生令人誤解的結(jié) 果。有時在樣品中包含抑制性物質(zhì)，可產(chǎn)生假陰性結(jié)果。有關(guān)對照構(gòu) 思的綜述由Valentine-Thon， E., J. Clinical Virol. 25 (2002) S13-S21提 供。一4殳來說，人們可區(qū)分外部對照(externalcontrol)和內(nèi)部對照。夕卜 部對照如經(jīng)典的陽性對照和陰性對照，模擬陽性和陰性樣品， 一般用 于檢查測定是否正確運行或者是否包含污染物。內(nèi)部對照例如可用于 識別樣品中可能包含的抑制性物質(zhì)，或者可以用作定量測定中的定量 標準。與一般在單獨的反應(yīng)室中測試的外部對照相反，內(nèi)部對照優(yōu)選 與待測分析物一起在同一反應(yīng)室中溫育。因此，對照或該對照的擴增 產(chǎn)物必須能與分析物或該分析物的擴增產(chǎn)物區(qū)分開來。在使用擴增方 法時，內(nèi)部對照核酸基本上將在與目標核酸相同的反應(yīng)條件下被共同 擴增。這些條件包括試劑濃度、溫度、抑制劑濃度或酶活性。經(jīng)常使 用的對照序列來源于管家基因(參見Chelly, J.等,Eur. J. Biochem. 187 (1990) 691-698; Mallet, F.等，J. Clin. Microbiol. 33 (1995) 3201-3208), 但也可使用非天然序列(參見例如EP 1 236 805)。來源于內(nèi)部對照的擴增核酸可通過它們的不同長度或與不同探 針的雜交能力而和來源于目標核酸的擴增核酸區(qū)分開來(有關(guān)綜述參 見Clementi， M.等，PCR Methods Applic. 2 (1993) 191-196; Clementi, M.等，Arch. Virol. 140(1995) 1523-1539)。在所有情況下，內(nèi)部對照的 核苷酸序列與目標核酸序列部分不同或完全不同(另參見 Haentjens-Herwegh, S.等,Recent Res. Devel. Microbiology 4 (2000) 547-556)。在擴增反應(yīng)中其中一個最關(guān)鍵的方面就是引物與目標核酸的結(jié) 合。因此，使用與目標核酸具有相同引物結(jié)合位點的內(nèi)部對照(參見例如Gilliland, G.等，Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87 (1990) 2725-2729)。WO 02/18635和WO 99/06594公開了模擬包入病毒衣殼中之核酸的殼體化內(nèi)部對照序列的應(yīng)用。EP 1 319 716公開了用幾種可辨別的內(nèi)部對照核酸來測試核酸分離和擴增。WO 2004/055205公開了向經(jīng)歷樣品制備的樣品加入內(nèi)部對照序 列。然后，將來自該IC(內(nèi)部對照)的信號與未經(jīng)歷樣品制備的外部對 照比較，以便驗證細胞裂解和樣品制備的效率以及核酸擴增和/或檢測 的性能。US 6,277,560公開了使用外源微生物的DNA作為定量的外部標 準以及使用內(nèi)部對照評價核酸擴增的效率。Gilliland， G.等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2725-2729公 開了應(yīng)用陰性對照和內(nèi)部對照進行定量。Brakenhoff， R.等,Clin. Cancer Res. 5 (1999) 725-732公開了采用 用于RNA質(zhì)量控制的內(nèi)部標準、用于靈敏度控制的外部標準和陰性 對照的PCR測定。WO 2005/061737 ^Hf了采用內(nèi)部對照、陽性對照 和陰性對照的試劑盒。Leushner和Kelly, Qiagennews,第4期，2000, 21頁公開了通過使 用內(nèi)部對照和陽性對照的多重PCR 4企測病原性腸細菌的方法。由Roche, Mannheim, Germany制造的"LightCycler⑧foodproof大 腸桿菌0157檢測試劑盒"在其說明書中公開了使用內(nèi)部對照和對照模 板定量檢測大腸桿菌血清型0157的PCR方法。US2003/077622涉及在信號擴增反應(yīng)中提供陽性對照以鑒別抑制 的方法和組合物。由Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA制造的"用于沙 眼衣原體的CT/NG測試"在其手冊中公開了使用內(nèi)部對照和沙眼衣原體(C7z/a，Aa frac/iomato)曰不下UNA木粒觀'由TaKaRa, Japan制造的CycleavePCRTM@類菌種(meat species) 鑒定試劑盒的手冊公開了區(qū)分不同肉類菌種的方法，該方法包含對照 構(gòu)思。發(fā)明概述本發(fā)明的目標是提供生物分子檢測用的對照方法(controlling methods)的新構(gòu)思。在本發(fā)明的實施方案中，提供用于檢測在懷疑含有目標生物分子 的樣品中是否存在目標生物分子的方法，其包括以下步驟a) 其中該步驟由步驟al)或a2)組成 al)將內(nèi)部對照生物分子加至-懷疑含有目標生物分子的樣品， -不含目標生物分子的陰性對照樣品， -含有目標生物分子的陽性對照樣品，和 -含有目標生物分子的試劑對照樣品， a2)將內(nèi)部對照生物分子加至 -懷疑含有目標生物分子的樣品， -不含目標生物分子的陰性對照樣品，和 -含有目標生物分子的陽性對照樣品， 并提供含有目標生物分子的試劑對照樣品，b) 任選地由步驟a)的樣品純化所述生物分子，以獲得包含所純 化的生物分子的樣品，c) 測定在步驟a)或b)中獲得的每種樣品中是否存在內(nèi)部對照生 物分子信號和目標生物分子信號，d) 如下驗-〖正在懷疑含有目標生物分子的樣品中目標生物分子信 號的存在與否-獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況檢查懷疑含有目標生物分子之樣品的目標生物分子信號存在情況，或在沒有目標生物分 子信號存在的情況下檢查內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照生物分子信號和是否不 存在目標生物分子信號，-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照生物分子信號，和-檢查試劑對照樣品在本方法步驟d)中是否存在目標生物分子 信號，或檢查試劑對照樣品是否存在目標生物分子信號以及任選地檢 查是否存在內(nèi)部對照生物分子信號，e)檢測目標生物分子的存在與否，由此在步驟c)中測定并在步驟 d)中驗證的目標生物分子信號和內(nèi)部對照生物分子信號的存在與否表 明了試樣中目標生物分子的存在與否。在本發(fā)明的另 一個實施方案中，用于驗證表明存在目標生物分子 的信號測定結(jié)果的方法包括以下步驟a) 提供-含有內(nèi)部對照生物分子并懷疑含有目標生物分子的樣品，和 -含有內(nèi)部對照生物分子但不含目標生物分子的陰性對照樣品，和-含有目標生物分子并含有內(nèi)部對照生物分子的陽性對照樣品， -含有目標生物分子并任選地含有內(nèi)部對照生物分子的試劑對 照樣品，b) 測定每個樣品中的內(nèi)部對照生物分子信號和目標生物分子信c) 如下驗證試樣中指示試樣中存在目標生物分子的目標生物分 子信號的存在情況-獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況檢查懷疑含有目標 生物分子之樣品的目標生物分子信號存在情況，或在沒有目標生物分 子信號的情況下檢查內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照生物分子信號和是否不 存在目標生物分子信號，-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照生物分子信號，和_檢查試劑對照樣品是否存在目標生物分子信號和任選地檢查 是否存在內(nèi)部對照生物分子信號。在本發(fā)明的又一個實施方案中，用于檢測在懷疑含有目標核酸群(group of target nucleic acids)成員的樣品中目標核酸群成員(或目標核 酸)的存在與否的方法如下a) 將內(nèi)部對照核酸加至-懷疑含有目標核酸群成員(或目標核酸)的樣品，和-不含目標核酸群成員(或目標核酸)的陰性對照樣品，和-含有目標核酸群成員(或目標核酸)的陽性對照樣品，b) 提供含有目標核酸群并任選地含有內(nèi)部對照核酸的試劑對照樣品,c) 任選地由步驟a)和/或b)的樣品純化所述核酸，以獲得包含所 純化的核酸的樣品，d) 測定在步驟a)和b)或步驟b)和c)中獲得的每個樣品中的內(nèi)部 對照核酸信號和目標核酸群成員(或目標核酸)信號的存在與否，e) 如下驗證在懷疑含有目標核酸群成員(或目標核酸)的樣品中 目標核酸群成員(或目標核酸)信號的存在與否-獨立于內(nèi)部對照核酸信號的存在情況檢查懷疑含有目標核酸 群成員(或目標核酸)之樣品的目標核酸群成員(或目標核酸)信號存在 情況，或在沒有目標核酸群成員(或目標核酸)信號的情況下檢查內(nèi)部 對照核酸信號的存在'清況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照核酸信號和是否不存在 目標核酸信號，-檢查試劑對照樣品是否存在每個目標核酸群成員(或目標核酸)信號和任選地檢查是否存在內(nèi)部對照核酸信號，和-檢查陽性對照樣品是否存在目標核酸群成員(或目標核酸)信號 和是否存在內(nèi)部對照核酸信號，或f)檢測目標核酸群成員(或目標核酸)是否存在，由此在步驟d)中 測定并在步驟e)中驗證的目標核酸群成員(或目標核酸)信號和內(nèi)部對 照核酸信號的存在和/或不存在，表明了懷疑含有目標核酸群成員(或 目標核酸)的樣品中目標核酸群成員(或目標核酸)的存在或不存在。在整個申請中，術(shù)語目標核酸群成員或目標核酸群的目標核酸或 選自目標核酸群的目標核酸可互換使用。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供驗證指示存在目標核酸群成員的信號測定結(jié)果的方法，其包括以下步驟a) 提供-含有內(nèi)部對照核酸并懷疑含有目標核酸群成員的樣品， -含有目標核酸群并任選地含有內(nèi)部對照核酸的試劑對照樣品， -不含目標核酸群成員但含有內(nèi)部對照核酸的陰性對照樣品，和 -含有目標核酸群成員并含有內(nèi)部對照核酸的陽性對照樣品，b) 測定每個樣品中的內(nèi)部對照核酸信號和目標核酸群成員信—弓—c) 如下驗證懷疑含有目標核酸群成員的樣品中目標核酸群成員 信號的存在情況-獨立于內(nèi)部對照核酸信號的存在情況檢查懷疑含有目標核酸 群成員之樣品的目標核酸成員信號存在情況，或在沒有目標核酸群成 員信號的情況下檢查內(nèi)部對照核酸信號的存在情況，-檢查試劑對照樣品是否存在每種目標核酸群成員信號，-檢查陰性對照樣品是否不存在目標核酸群成員信號和是否存 在內(nèi)部對照核酸信號，和-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照核酸信號。在本發(fā)明的另 一個實施方案中，使用任選地含有內(nèi)部對照生物分 子的試劑對照樣品和含有內(nèi)部對照生物分子的陽性對照樣品(兩種樣 品均含有目標生物分子)，檢測在懷疑含有目標生物分子的樣品中目標 生物分子是否存在，或驗證指示存在目標生物分子之信號的測定結(jié) 果。在另 一個優(yōu)選實施方案中，提供用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑盒，其含有a) 含有目標核酸或目標核酸群成員的試劑對照樣品，b) 不含目標核酸或目標核酸群成員的陰性對照樣品，c) 含有目標核酸或目標核酸群成員的陽性對照樣品，d) 內(nèi)部對照核酸，和e) 用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑。 正如本領(lǐng)域所知，"核芬"是堿基-糖組合。核苷的減基部分一般是雜環(huán)堿基。這些雜環(huán)堿基的兩個最常見類型是噪呤和嘧啶，更詳細地 說是腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)堿基。尿嘧啶 堿基天然包含在核糖核酸中。另 一個天然堿基是5-曱基-胞嘧啶或甲基 -胞嘧啶，其為在堿基芳環(huán)的5-位被曱基取代的胞嘧啶。"核苷酸"為還包含與核苷的糖部分共價連接的磷酸酯基團的"核 苷"。對于那些包含呋喃戊糖基糖的"核苷"，磷酸酯基團可與該糖的 2'、 3'或5'羥基部分連接。"核苦酸"是"寡核苦酸，，的"單體單元"，更一 般地在本文被稱為"寡聚化合物"或"多核苷酸"，更一般地稱為"多聚化 合物"。其另 一種一般表述是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸 (RNA)。"核酸，，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的"核苷酸"的多聚化合物。其在本 文用于表示要分析的樣品中的"核酸"，即要測定其在樣品中存在、不 存在或量的核酸。因此，換句話說，"核酸"是目標，因此也可稱為"目 標核酸"。例如，如果必須測定血液是否含有人免疫缺陷病毒，貝'j"目 標核酸，，是所測定的人免疫缺陷病毒的核酸，或者更具體地說是核S^列，即堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嗜啶或胸腺嘧啶的順序。更具體地說， 在本發(fā)明范圍內(nèi)，"目標核酸"優(yōu)選為如本文進一步指明的微生物、細 胞或病毒("目標微生物"、"目標細胞"或"目標病毒")中包含的核酸，或 者更精確地il或更優(yōu)選為該核酸的一部分。"目標核酸"具有對該微生 物、細胞或病毒特異性的核酸序列，為在該微生物、細胞或病毒中所 含(總)核酸的一部分。按照本發(fā)明，"寡聚化合物"是由"單體單元"組成的化合物，"單體 單元，，可為單獨的"核香酸"或"非天然化合物"，更具體地說為單獨的 "修飾型核普酸"(或"核香酸類似物")或"非核苷酸化合物"或其組合。 "寡核苷酸"和"修飾型寡核苷酸"(或"寡核苷酸類似物")在本發(fā)明范圍 內(nèi)為"寡聚化合物"的亞組。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語"寡核苷酸"指由多個作為"單體單元"的"核 苷酸"形成的"多核苷酸"，即"寡核苷酸，，屬于具有"單體單元"的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的"寡聚化合物"或"多聚化合物"的 特定亞組。磷酸酯基團通常被稱為形成"寡核苷酸"的核苷間主鏈。 RNA和DNA的正常鍵合或主鏈為3'至5'磷酸二酯鍵。本發(fā)明的"寡核苷酸"和"修飾型寡核苷酸，，可大體上如本領(lǐng)域所述 和本領(lǐng)域技術(shù)人員所知來合成。用于制備特定序列的寡聚化合物的方 法是本領(lǐng)域已知的，包括例如適宜序列的克隆和限制以及直接化學(xué)合 成?；瘜W(xué)合成方法可包括例如Narang, S.A.等，Methods Enzymol. 68 (1979) 90-98所述的磷酸三酯法、Brown, E.L.等，Methods Enzymol. 68 (1979) 109-151 乂〉開的磷酸二酯法、Beaucage， S丄.和Caruthers, MH" Tetrahedron Lett. 22(1981) 1859-1862中公開的亞磷酰胺法、在Garegg, P丄等，Chem. Scr. 25 (1985) 280-282中公開的H-膦酸酯法以及在US 4,458,066中公開的固體支持體法。如上所述，"核酸，，以及"目標核酸"是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的"核苷 酸，，的多聚化合物。其在本文用于表示要分析的樣品中的"核酸"，即要 測定其在樣品中存在、不存在或量的核酸。本文使用的術(shù)語"引物"是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，指"寡聚化合 物"，其主要指"寡核苷酸"，但也可以指"修飾型寡核苷酸"，其能夠通過模板依賴性DNA聚合酶"引發(fā)"DNA合成，即例如寡核苷酸的3'末 端提供游離的3'-OH基，才莫板依賴性DNA聚合酶可在該游離的3'-OH 基連接上其它的"核苷酸"，建立3'至5'磷酸二酯鍵，由此使用脫氧核 香酸三磷酸酯并由此釋放焦磷酸。因此，除了預(yù)期的功能以外，在本 發(fā)明的"引物"、"寡核苷酸"或"探針"之間沒有根本的差異。術(shù)語"探針，，指合成或經(jīng)生物學(xué)方法生產(chǎn)的核酸(DNA或RNA), 此核酸通過設(shè)計或選擇而包含特定的核脊酸序列，所述核苦酸序列允 許所述核酸在限定的預(yù)定嚴格性下特異性地(即優(yōu)先地)與"目標核酸" 雜交。"探針"可被鑒別為"捕獲探針"，意指其"捕獲"目標核酸，使得 其可與可能模糊其檢測結(jié)果的不想要的物質(zhì)分離。 一完成分離，就可 使用適宜的程序?qū)崿F(xiàn)所捕獲的"目標核酸"的檢測。"捕獲探針"經(jīng)常已 經(jīng)連接至固相。因此，其具體實例為微陣列情況，其中大量"捕獲探針" 連接至"固相"，它們可"捕獲"標記的cRNA或cDNA。"標記，，經(jīng)常被稱為"報告基團"，其一般為使本發(fā)明的核酸、尤其 是"寡聚化合物"或"修飾型寡核苷酸"以及與其結(jié)合的任何核酸可與液 體(即樣品)的余下部分區(qū)分開來的基團(已連接"標記"的核酸還可以被 稱為標記的核酸結(jié)合化合物、標記探針或僅稱為探針)。其中，"半抗 原，，(例如生物素或地高辛配基)、酶(例如堿性磷酸酶或過氧化物酶)或 熒光染料(例如熒光素或羅丹明)大體上已被證實適合作為非放射性指 示劑分子，或者換句話說適合作為非放射性"標記"。這些"信號基團，， 或"標記"可通過多種方法連接至核酸或摻入到核酸中。優(yōu)選的本發(fā)明 "標記"為例如熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料和香豆素染料的染 料，或者為例如生物素的半抗原。根據(jù)一般性定義，"半抗原"是自身 不是免疫原(可引起免疫應(yīng)答)但具有至少一個抗原元件并可與抗體或另一個較大載體分子結(jié)合而變成免疫原性的小分子D本文使用的"熒光共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系"和類似的術(shù)語指用"供體熒光標記"標記的"寡聚化合物"和另一種用"受體熒光標記，，標記的"寡聚 化合物"與"目標核酸，，的鄰近雜交，使得"供體焚光標記"可將共振能量 轉(zhuǎn)移至"受體熒光標記"，從而使"受體熒光標記"產(chǎn)生可檢測的熒光發(fā) 射。如果"供體熒光標記"和"受體熒光標記，，間隔太大的距離，則"供體 熒光標記"不能將共振能量轉(zhuǎn)移至"受體熒光標記，，，以至于"受體熒光 標記"不能發(fā)射可檢測的焚光，因此"供體熒光標記"和"受體熒光標記" 沒有共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系。在本發(fā)明范圍內(nèi)，"雜交"應(yīng)指互補核苷酸之間形成氫鍵，其可為Watson-Crick、 Hoogsteen或反向Hoogsteen氬4建。例如，1^嘌^令和胸 腺嘧啶是互補核石咸基(nucleobase),其通過形成氫鍵而配對。本文使用 的"互補"也指兩個核苷酸之間的序列互補性。例如，如果在寡核芬酸 某些位置的核苦酸能夠與DNA或RNA分子的相同位置上的核芬酸形 成氬鍵，則該寡核苷酸和所述DNA或RNA被認為是在該位置彼此互 補。如果每個分子中有足夠數(shù)目的對應(yīng)位置被彼此可形成氫鍵的核苷 酸占據(jù)，則該寡核苦酸和所述DNA或RNA彼此互補。因此，"可特 異性雜交的，，和"互補的，，是用于表示足夠的互補程度以至于在寡核苷 酸和DNA或RNA目標之間產(chǎn)生穩(wěn)定且特異性的結(jié)合的術(shù)語。要理解 的是，寡核苷酸與其可特異性雜交的目標DNA序列不必100%互補。的正常功能，并且存在足夠程度的互補性以避免寡核苷酸與非目標序 列在需要特異性結(jié)合的條件下(即就體內(nèi)測定或治療性治療而言在生 理條件下，或就體外測定而言在其中進行測定的條件下)非特異性結(jié) 合，則該寡核苷酸是可特異性雜交的。術(shù)語"生物分子"指可存在于生物樣品中的任何分子。這些分子優(yōu) 選為肽、蛋白、糖如寡糖、脂質(zhì)、類固醇、前列腺素、前列腺環(huán)素和 核酸(包括DNA和RNA)。術(shù)語"生物樣品"指得自微生物、病毒和多 細胞生物(如植物、動物和人，尤其是患有疾病的人類患者)的任何固 體或液體樣品。實例是生物液體，例如血液、血漿、血清、尿、膽汁、23物。"生物樣品"還可為得自器官或組織的樣 品，優(yōu)選為活檢品，并包括細胞。術(shù)語"目標生物分子，，應(yīng)表示要分析 的樣品中的"生物分子"，是(分析的)目標，即要測定其在樣品中的存 在、不存在或量。例如，如果必須確定血液是否含有人免疫缺陷病毒， 則"目標生物分子，，可為人免疫缺陷病毒的生物分子，或者更具體地說 為該病毒的蛋白，其可在免疫學(xué)測試中由抗體識別，并具有對所述病 毒特異性的氨基酸序列。復(fù)數(shù)縮寫"spp."用于指一個屬內(nèi)的所有個體物種，例如山茱萸屬 (Corm^^; .)指山茱萸屬中的所有植物。種是分類學(xué)鑒別的基本類目， 排在屬之下和亞種之上，亞種是其個體具有彼此自由交配潛力的種群 或系列種群，其與其它種群或系列種群之間的變異是不連續(xù)的。發(fā)明詳述在文獻中闡述了分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域 技術(shù)范圍之內(nèi)。參見例如Sambrook, J.等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Gait， MJ.， Oligonucleotide Synthesis, a practical approach, 1984年編，IRL Press, Oxford, England; Hames， B.D,和Higgins: S. J.， Nucleic acid Hybridisation, a practial approach, 1985年編，IRL Press, Oxford, England;和叢書Methods in Enzymology, Academic Press: Inc.,所有這些文獻都在此引入作為參考。本文在上下文提及的所有專 利、專利申請和出版物都在此引入作為參考。在本發(fā)明的實施方案中，提供用于檢測在懷疑含有目標生物分子 的樣品中目標生物分子是否存在的方法，其包括以下步驟a)其中該步驟由步驟al)或a2)組成al)將內(nèi)部對照生物分子加至-懷疑含有目標生物分子的樣品，-不含目標生物分子的陰性對照樣品，-含有目標生物分子的陽性對照樣品，和 -含有目標生物分子的試劑對照樣品，a2)將內(nèi)部對照生物分子加至-懷疑含有目標生物分子的樣品，-不含目標生物分子的陰性對照樣品，和-含有目標生物分子的陽性對照樣品，并提供包含目標生物分子的試劑對照樣品，b) 任選地由步驟a)的樣品純化生物分子，以獲得包含所純化的 生物分子的樣品，c) 測定在步驟a)或b)中獲得的每種樣品中是否存在內(nèi)部對照生 物分子信號和目標生物分子信號，d) 如下驗證在懷疑含有目標生物分子的樣品中目標生物分子信 號的存在與否-獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況檢查懷疑含有目標 生物分子之樣品的目標生物分子信號存在情況，或在沒有目標生物分 子信號存在的情況下檢查內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照生物分子信號和是否不 存在目標生物分子信號，-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照生物分子信號，和-檢查試劑對照樣品在該方法步驟d)中是否存在目標生物分子 信號，或檢查試劑對照樣品是否存在目標生物分子信號和任選地檢查 是否存在內(nèi)部對照生物分子信號，e) 檢測目標生物分子的存在與否，由此在步驟c)中測定并在步驟 d)中驗證的目標生物分子信號和內(nèi)部對照生物分子信號的存在與否表 明了試樣中目標生物分子的存在與否。本發(fā)明的方法利用多種對照，其允許驗證反應(yīng)的所有步驟是否都 正確實施以及所獲信號是否可信并可以可靠地用于4企測樣品中目標生物分子的存在與否。例如，優(yōu)選在過程的不同步驟中(優(yōu)選在生物分 子純化之前和之后)引入的兩種陽性對照(即本發(fā)明的陽性對照和試劑 對照)的使用，使得可以檢查所述方法(尤其是生物分子純化)的哪些步 驟可能不正確實施，以及錯誤的來源可能是什么。通過在陰性對照樣 品中使用內(nèi)部對照，可檢驗陰性對照樣品中目標生物分子信號的不存 在，無論其因目標生物分子確實不存在而產(chǎn)生，還是因抑制性物質(zhì)無 意地導(dǎo)入陰性對照樣品中而產(chǎn)生。通過在陽性對照樣品和試劑對照樣 品中使用內(nèi)部對照，可檢驗這些樣品中目標生物分子信號的潛在的和 無意的不存在，無論其是否因抑制性物質(zhì)無意導(dǎo)入到這些樣品中而產(chǎn)物分子的樣品中目標生物分子是否存在的方法中的多個步驟。這對多 重測定特別有利，尤其是對在核酸的情況下連同解鏈曲線分析的多重 測定特別有利，其中所述解鏈曲線分析允許額外分離由不同目標核酸 產(chǎn)生的信號。內(nèi)部對照生物分子(或?qū)φ丈锓肿踊蛏锓肿?是用作;f僉測目標 生物分子的對照的內(nèi)標。內(nèi)部對照的使用允許控制純化、信號測定和 檢測，由此允許監(jiān)測測定的性能乃至目標生物分子的定量。其被加入 到試樣和其它樣品中，以控制與其進行的反應(yīng)，并應(yīng)允許檢測反應(yīng)之 抑制劑的存在情況。由于內(nèi)部對照生物分子也存在于含有目標生物分 子的樣品中，并預(yù)期提供信號，所以內(nèi)部對照生物分子或其信號必須 與目標生物分子和/或其信號區(qū)分開來。為此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，內(nèi)部對照生物分子含有目標 生物分子的一部分。內(nèi)部對照生物分子還可以含有目標生物分子的一 部分和并非目標生物分子之部分的部分。內(nèi)部對照生物分子或內(nèi)部對生物分子，即應(yīng)當具有和目標生物分子類似的生物分子特性。這意味 著如果目標生物分子是蛋白質(zhì)，則內(nèi)部對照生物分子應(yīng)為與目標蛋白 具有相似氨基酸序列的蛋白，即應(yīng)當優(yōu)選具有與目標蛋白的氨基酸序列有60%或80%相同的氨基酸序列，并因此應(yīng)當具有類似的分子特性， 即應(yīng)當表現(xiàn)得類似目標生物分子或蛋白，但仍應(yīng)產(chǎn)生不同于目標生物 分子的信號。然后，不同的抗原性位點應(yīng)允許產(chǎn)生與目標蛋白相比不 同的信號。優(yōu)選地，按照本發(fā)明，內(nèi)部對照生物分子為內(nèi)部對照生物分子的混合物或內(nèi)部只于照生物分子群(a group of internal control biomolecules)，即不止一種內(nèi)部對照生物分子。內(nèi)部對照生物分子或 其混合物一般在含有緩沖液或鹽的溶液中提供，即為樣品的形式。因 此，將含有內(nèi)部對照核酸的樣品加至各自的本發(fā)明的其它樣品中。就作為目標生物分子的核酸而言，內(nèi)部對照核酸包含與目標核酸 序列不同但優(yōu)選與其類似的核酸序列，該核酸序列能夠與序列特異性 探針雜交，并能夠擴增。因此，來源于內(nèi)部對照核酸的擴增子具有和 目標核酸類似的長度以及G和C堿基含量，并可以含有獨特的探針結(jié) 合位點。因此，內(nèi)部對照核酸應(yīng)為與目標核酸具有類似核酸序列的核 酸，即應(yīng)當優(yōu)選具有與目標核酸的核酸序列有60%或80%相同的核酸 序列，并因此應(yīng)當具有類似的分子特性。內(nèi)部對照核酸通常為克隆入 質(zhì)粒中的核酸，包含目標核酸的 一部分和并非目標核酸之部分的部 分，后者即用于檢測目標核酸并可用于區(qū)分內(nèi)部對照核酸信號和目標 核酸信號的部分。優(yōu)選地，按照本發(fā)明，內(nèi)部對照核酸包含與目標核 酸相同的引物結(jié)合位點，即使用相同引物來擴增目標核酸和內(nèi)部對照 核酸，內(nèi)部對照核酸具有的探針結(jié)合位點具有與目標核酸的探針結(jié)合 位點不同的核酸序列，由此允許區(qū)分。優(yōu)選地。按照本發(fā)明，內(nèi)部對 照核酸為內(nèi)部對照核酸的混合物或內(nèi)部對照核酸群(a group of internal control nucleic acids),即不止一種以上的內(nèi)部對照核酸。內(nèi)部對照核 酸或其混合物一般在含有緩沖液和鹽的溶液中提供。因此，將含有內(nèi) 部對照核酸的樣品加入到另 一個樣品中。含有內(nèi)部對照核酸的溶液不 含有污染的目標核酸，并提供低濃度的內(nèi)部對照核酸，以允許監(jiān)測對 PCR擴增的抑制。關(guān)于構(gòu)建和使用內(nèi)部對照核酸的一般方法的詳述可27見于例如EP 1 236 805、 WO 02/18635、 Gilliland， G.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2725-2729以及其中和上文描述的參考文獻。懷疑含有目標生物分子的樣品還可以叫做試樣，為要測試的樣 品。除了目標生物分子以外，其還可以含有目標生物分子之外的其它 生物分子。這些其它生物分子為通常存在于生物樣品中的那些生物分 子，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如肽、蛋白質(zhì)、糖如寡糖、脂質(zhì)、 類固醇、前列腺素、前列腺環(huán)素和核酸(包括DNA和RNA)。生物樣 品指得自微生物、病毒和多細胞生物、尤其是患有疾病的人類患者的 任何固體和液體樣品。實例是生物液體，例如血液、血漿、血清、尿、 膽汁、腦脊髓液或任何機體分泌物。生物樣品還可以為得自器官或組 織的樣品，優(yōu)選為活4企品，并包括細胞。陰性對照樣品為不含目標生物分子的樣品。但是，其可以包含非 目標生物分子的其它生物分子。這些其它生物分子是上述的那些。在 優(yōu)選的實施方案中，陰性對照樣品為含有鹽和緩沖物質(zhì)的溶液(且不含 有目標生物分子)。陽性對照樣品為含有目標生物分子的樣品，即其應(yīng)用作陽性對 照，陽性對照意指如果其含有目標生物分子則其應(yīng)當提供和試樣相同 的信號。優(yōu)選地，陽性對照樣品為含有目標生物分子或其部分的溶液。 優(yōu)選地，樣品為以和試樣相同的方式(即用于獲得其中包含的目標生物 分子的純化步驟)處理的樣品。就作為目標生物分子的核酸而言，陽性 對照樣品通過完整的工作流程處理，包括作為純化步驟的裂解和核酸分離以及(PCR)擴增和;險測。因此，陽性對照樣品為在與試樣相同的 環(huán)境中含有目標生物分子的樣品。通常目標生物分子為在病毒、細胞 或微生物中含有的生物分子，優(yōu)選為核酸。然后，試樣以及陽性對照 樣品優(yōu)選含有包含目標生物分子的病毒、細胞或微生物。優(yōu)選地，陽 性對照樣品含有被摻入陰性人血液基質(zhì)中、得自陽性血液培養(yǎng)物的微生物。因此，優(yōu)選地，陽性對照樣品為包含含有目標生物分子的病毒、 細胞或微生物，更優(yōu)選為含有該微生物的樣品，由此樣品還含有懷疑含有目標生物分子的樣品所包含的相同或幾乎相同的其它生物分子 (即環(huán)境)。如果目標生物分子是目標生物分子群，則每種目標生物分 子都包含在對應(yīng)的病毒、細胞或微生物中。然后，陽性對照樣品可包 含目標生物分子群的一個或多個或所有成員，因為足以觀察到樣品處 理至少對它們中的一種起作用。這在所述病毒、細胞或微生物為致病 性的情況下特別重要，因為不必將含有不同的、致病性的并可為具有 引起不同疾病的潛力的病毒、細胞或微生物的完整混合物的陽性對照 樣品出售和遞送給客戶。因此，在要測試目標生物分子群的情況下， 陽性對照樣品可僅含有一種目標生物分子。試劑對照樣品也是一種陽性對照樣品，即其應(yīng)用作陽性對照，陽 性對照意指如果其含有目標生物分子則其應(yīng)當提供和試樣相同的信 號。優(yōu)選地，試劑對照樣品為含有目標生物分子或其部分的溶液。j旦 是，其為不是以和試樣、陽性對照樣品完全相同的方式處理的陽性對 照，即沒有例如用于獲得其中包含的目標生物分子的純化步驟。就作 為目標生物分子的核酸而言，陽性對照樣品通過完整的工作流程處 理，包括作為純化步驟的裂解和核酸分離以及(PCR)擴增和檢測，但 試劑對照樣品僅經(jīng)歷(PCR)擴增和檢測。因此，盡管陽性對照樣品可 為在與試樣相同的環(huán)境中含有目標生物分子的樣品，但經(jīng)常不是這樣 的。通常目標生物分子為在病毒、細胞或微生物中包含的生物分子， 優(yōu)選為核酸。那么，試樣以及陽性對照樣品優(yōu)選包含含有目標生物分 子的病毒、細胞或微生物，但試劑對照樣品僅含有目標生物分子。因 此，優(yōu)選地，試劑對照樣品為含有并不包含在病毒、細胞或微生物中 的目標生物分子的樣品，由此該樣品可以還含有或不含有其它生物分 子。就作為目標生物分子的核酸而言，目標核酸可連接至或接合至其 它核酸，例如在質(zhì)粒中就是這種情況，其中要擴增的核酸一擴增子， -故克隆入允許該目標核酸增殖的質(zhì)粒中。如果目標生物分子為目標生 物分子群，則每種目標生物分子都包含在試劑對照樣品中，即對于目 標核酸群，例如為檢測多種病毒或微生物的目標核酸群而言，試劑對照樣品優(yōu)選包含所述目標核酸群，即優(yōu)選包含含有該目標核酸群的質(zhì)粒群(a group of plasmids)。優(yōu)選地，就目標核酸群而言，試劑對照樣 品含有各個被克隆的目標核酸序列的混合物，該混合物涵蓋了所使用 的每個雜交探針對的擴增區(qū)。按照本發(fā)明，內(nèi)部對照生物分子可被加入或包含在試劑對照樣品 中。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢驗樣品中對應(yīng)信號的存在情 況。獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，檢驗懷疑含有目標生 物分子的樣品中目標生物分子信號存在情況，或在沒有目標生物分子 信號的情況下檢驗內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況。對于核酸和目 標核酸信號的存在情況而言，在使用相同引物進行擴增以及目標核酸 可以不允許擴增和檢測內(nèi)部對照核酸的較高量存在時，不一定存在內(nèi) 部對照核酸信號。在本發(fā)明的任選的實施方案中，生物分子或核酸使用例如固相和 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法由樣品純化。樣品可含有多細胞生物的細 胞，例如人和動物細胞，例如白細胞，以及免疫活性低和高的分子化 合物，例如半抗原、抗原、抗體和核酸，血漿、腦液、唾液、糞便、 活檢標本、骨髓、口腔漱液、血漿、組織、尿或其混合物。在本發(fā)明 的優(yōu)選實施方案中，樣品是來自人體或動物體的液體。優(yōu)選地，樣品 為血液、血漿、血清或尿。血漿優(yōu)選為經(jīng)EDTA、肝素或檸檬酸鹽處 理的血漿。裂解含有核酸的生物樣品，以產(chǎn)生含核酸的生物化合物和 其它組分的混合物。用于裂解樣品的程序是技術(shù)人員已知的，性質(zhì)上 可為化學(xué)的、酶的或物理的。這些程序的組合同樣適用。例如，裂解 可使用超聲波、高壓、剪切力、堿、變性劑或離液鹽溶液或蛋白酶或 脂酶進行。對于獲得核酸的裂解方法，特別要提到Sambrook等 Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY和Ausubel, F.等Current Protocols in Molecular Biology 1987， J. Wiley and Sons, NY。然后，葉吏 用本發(fā)明的方法和固相由裂解混合物分離核酸，接著可實施本發(fā)明的方法。離液劑也用于裂解細胞，以制備介于核酸和其它生物物質(zhì)之間的'混合物(參見例長口 Sambrook, J.等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989,或EP 0 389 063)。然后加入含有玻璃或珪石表面的物質(zhì)的行為而產(chǎn)生，所述條件即為存在一定濃度的離液劑、較 高濃度的有機溶劑或在酸性條件下。也可以使用如在WO 01/37291中 所述的磁性玻璃粒。在又一個優(yōu)選實施方案中，目標生物分子為目標生物分子群。在再一個優(yōu)選實施方案中，生物分子為核酸。在又一個實施方案中，目標核酸和內(nèi)部對照核酸在步驟c)之前擴 增。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，核酸用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR; EP0 201 184、 EP 0 200 362、 US 4,683，202)擴增。擴增方法還可以為連4妄 酶鏈式反應(yīng)(LCR， Wu， D. Y.和Wallace, R. B.， Genomics 4 (1989) 560-9 和Barany, F.， Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 189-93);聚合酶連接 酶鏈式反應(yīng)(Barany, F.， PCR Methods Appl 1 (1991) 5-16); Gap-LCR (PCT專利公布號WO 90/01069);修復(fù)鏈式反應(yīng)(歐洲專利公布號EP 0 439 182 A2)、 3SR (Kwoh， D.Y.等，Proc Natl Acad Sci USA 86 (1989) 1173-7; Guatelli, J. C等，Proc Natl Acad Sci USA 87 (1990) 1874-8; PCT 專利公布號WO 92觸08)和NASBA (美國專利號US 5,130,238)。此 外還有鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)和QP-擴增(有關(guān) 綜述參見例如Whelen, A. C和Persing, D. H.， Annu Rev Microbiol 50 (1996) 349-73; Abramson, R. D,和Myers, T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993)41-7)。在實施方案中，所述方法包括檢測所擴增核酸的步驟。所擴增的 核酸可通過本領(lǐng)域」技術(shù)人員已知的和描述于例如Sambrook等， Molecular Cloning, ■ Cold Spring Harbor University. Press (1989); Lottspeich和Zorbas, Bioanalytik (1998), L. a. Zorbas編輯，SpektrumAkademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany,或Ausubel, F.等, 載于"Current protocols in molecular biology，，(1994)， F. Ausubel, R. Brent 和K. R.E.編輯，Wiley & Sons Verlag, New York的標準分析方法來測 定或檢測。在檢測目標核酸之前還可以有純化步驟，例如沉淀步驟。 檢測方法可包括但不限于結(jié)合或嵌入特定染料，例如溴化乙錠，其嵌 入到雙鏈DNA中并在此后改變其焚光。經(jīng)純化的核酸還可以通過電 泳法分離，任選地在限制性消化之后，此后使其顯現(xiàn)。還有基于探針 的測定，該測定利用與特定序列的寡核苷酸雜交，隨后檢測雜交體。 還有可能在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它步驟之后對目標核酸測序。其 它方法將不同的核酸序列施加至硅芯片，特異性探針與之結(jié)合，并在 互補序列結(jié)合時產(chǎn)生信號。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，通過^^測在擴增過程中作為 熒光信號的熒光強度而檢測核酸。該方法使得可以監(jiān)測實時熒光。因 此，在另一個優(yōu)選實施方案中，目標核酸信號或內(nèi)部對照核酸信號為 熒光信號。熒光信號優(yōu)選通過連接至探針的標記產(chǎn)生，其中所述探針 與目標核酸或內(nèi)部對照核酸雜交。特別優(yōu)選的方法使用同時的擴增和檢測，檢測通過檢測熒光強度 進行，該方法在COB AS TaqMan⑧設(shè)備中進行，如WO 92/02638和對 應(yīng)的美國專利US 5,210,015、 US5，804，375、 US 5,487,972所公開的。 該方法利用聚合酶的外切核酸酶活性產(chǎn)生信號。詳細地講，核酸通過 包括以下步驟的方法4企測使樣品與含有與目標核酸中一區(qū)域互補的 序列的寡核苷酸以及含有與同 一 目標核酸鏈中的第二個區(qū)域互補的 序列但不含由第 一種寡核苷酸限定的核酸序列的標記寡核苷酸接觸， 以在雜交條件下產(chǎn)生雙鏈體混合物，其中所述雙鏈體含有退火至第一 種寡核苷酸和標記的寡核苷酸的目標核酸，使得第一種寡核苷酸的3' 末端鄰接標記的寡核香酸的5'末端。然后，該混合物用具有5'至3'核 酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶在足以允許聚合酶的5'至3'核酸酶 活性切割退火的標記寡核苷酸并釋放標記片段的條件下處理。檢測和/或測量由標記的寡核苦酸水解產(chǎn)生的信號。用于TaqMan⑧設(shè)備的形 式消除了對形成固相結(jié)合的反應(yīng)復(fù)合物并使其可4皮檢測的需要。在更 一般的意義上而言，本發(fā)明方法的擴增和/或檢測反應(yīng)是均一溶液相測 定。其它優(yōu)選方法是用于LightCycler⑧設(shè)備的形式(參見例如US 6,174,670)。這些形式應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(參見例如美國專利 第4，996，143、 5，565，322、 5,849,489和6，162，603號)，并基于以下事實 當供體熒光標記和對應(yīng)的受體熒光標記彼此位于一定距離之內(nèi)時，在 這兩種熒光標記之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，這種能量轉(zhuǎn)移可被顯現(xiàn)或以其它 方法檢測和/或定量。本文使用的各自含有熒光標記的兩種探針可在特 定位置與擴增產(chǎn)物雜交，此雜交由探針與目標核酸的互補性決定。依 據(jù)本發(fā)明的探針的熒光標記可為供體熒光標記或受體熒光標記。在探 針與擴增產(chǎn)物于合適位置雜交時，產(chǎn)生FRET信號。可使用例如光子 計數(shù)落射熒光顯微鏡系統(tǒng)(含有適宜的分色鏡和用于監(jiān)測特定范圍的 熒光發(fā)射的濾光片)、光子計數(shù)光電倍增器系統(tǒng)或熒光計進行熒光分 析。啟動能量轉(zhuǎn)移的激發(fā)可用氬離子激光器、高強度汞(Hg)弧燈、光 纖光源或其它被適宜地濾光以在所需范圍內(nèi)激發(fā)的高強度光源進行。就供體熒光標記和對應(yīng)的受體熒光標記而言，本文使用的"對應(yīng)的"指 具有與供體焚光標記的發(fā)射光譜重疊的激發(fā)光譜的受體熒光標記。因此，可在它們之間產(chǎn)生有效的非放射性能量轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的熒光標記例 如為作為供體熒光標記的熒光素，由此受體熒光標記為羅丹明。其它 優(yōu)選標記為花菁染料或標記，優(yōu)選為如在US 6,174,670中描述的Cy5。 因此，更優(yōu)選地，熒光信號通過與相應(yīng)核酸雜交的探針對產(chǎn)生，其中 所述探針對的成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與相應(yīng)的核酸 雜交，其中所述探針對的第一個探針用供體熒光標記來標記，其中所 述探針對的第二個探針用對應(yīng)的受體焚光標記來標記，其中第 一個探 針和笫二個探針與相應(yīng)核酸的雜交使它們獲得共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法的步驟c)包括以下分步驟c 1)將以下物質(zhì)加至在步驟a)或b)中獲得的樣品 -與內(nèi)部對照核酸和目標核酸雜交的引物對，或兩個引物對，其中第一個引物對與內(nèi)部對照核酸雜交，第二個引物對與目標核酸雜交，-與內(nèi)部對照核酸雜交的第一個探針對，其中所述第一個探針對 的成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與內(nèi)部對照核酸雜交，其 中所述第一個探針對的第 一個探針用第 一供體焚光標記來標記，其中 所述第 一個探針對的第二個探針用對應(yīng)的第 一受體焚光標記來標記， 其中第 一個探針和第二個探針與內(nèi)部對照核酸的雜交使它們獲得共 振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；-與目標核酸雜交的第二個探針對，其中所述第二個探針對的成 員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與目標核酸雜交，其中所述第 二個〗笨針對的第一個探針用第二供體焚光標記來標記，其中所述第二 個探針對的第二個探針用對應(yīng)的第二受體熒光標記來標記，其中第一 個探針和第二個探針與目標核酸的雜交使它們獲得共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；和-擴增內(nèi)部對照核酸和目標核酸所必需的熱穩(wěn)定性核酸聚合酶c2)如果在樣品中存在內(nèi)部對照核酸和目標核酸，則擴增對應(yīng)樣品中的內(nèi)部對照核酸和目標核酸，c3)獨立地測定每個樣品中隨對應(yīng)樣品溫度變化的內(nèi)部對照核酸 和目標核酸的熒光信號是否存在，-由此通過所述第一個探針對之第一個探針的第一供體熒光標 記和第 一個探針對之第二個探針的第 一受體熒光標記之間的熒光共 振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對內(nèi)部對照核酸特異性的熒光信號，和-由此通過所述第二個探針對之第一個探針的第一供體熒光標 記和第二個探針對之第二個探針的第 一受體熒光標記之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對目標核酸特異性的焚光信號。可測定隨對應(yīng)樣品溫度變化的內(nèi)部對照核酸和目標核酸的焚光 信號是否存在("解鏈曲線分析")。對于該分析，持續(xù)增加樣品的溫度， 并測定先前在(擴增的)目標核酸和雜交探針之間產(chǎn)生的雜交復(fù)合體于 此分解的解鏈溫度。甚至可使用此方法以便檢測彼此之間僅相差一個 核苷酸多態(tài)性的目標分子解鏈溫度的差異。換句話說，分析甚至可用于檢測或鑒別點突變。這些技術(shù)的實例詳細公開于WO97/46707、 WO 97/46712和WO 97/46714，這些文獻的/^開內(nèi)容在此卩1入作為參考。業(yè)已公開了幾種基于目標依賴性熒光信號的檢測形式，其能夠連 續(xù)監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生或在隨后的解鏈曲線分析中鑒別突變(綜 述于Wittwer, Carl T.等，BioTechniques 22 (1997) 130-138)。這些檢測 形式包括但不限于 -在雜交時增加的熒光共振能量轉(zhuǎn)移對于該;險測形式，使用各自均用熒光部分標記的兩種寡核苷酸雜 交探針，其能夠與擴增產(chǎn)物中 一條鏈上的鄰接但不重疊的區(qū)域雜交。 優(yōu)選地， 一種寡核苷酸在5'末端被標記，第二種寡核苷酸在3'末端被 標記。當與目標DNA雜交時，兩種熒光標記變得緊密接觸，使得兩 種焚光部分之間可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。結(jié)果，可通過激發(fā)供體部 分和隨后檢測第二受體部分的熒光發(fā)射來監(jiān)測雜交(WO 97/46714)。在類似的實施方案中，僅使用一種熒光標記的探針，其連同一種 適宜標記的引物一起還可以用作特異性FRET對(Bernard， P.S.等， Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107)。 —分子信標分子信標寡核苷酸用熒光化合物和猝滅化合物標記，這兩種化合 物由于分子的二級結(jié)構(gòu)而彼此緊鄰。在結(jié)合至目標DNA時，分子內(nèi) 氬鍵被打破，連接在探針的一個末端的熒光化合物與連接在探針的相 反末端的猝滅化合物分離(Lizardi等，美國專利第5，118,801號)。解鏈溫度通常通過對樣品實施不斷的(constitutive)溫度增加并連35續(xù)檢測雜交復(fù)合物解離為單鏈而以實驗加以確定。解離可通過多種不 同方法檢測，例如通過UV吸光度漂移、通過表面等離子體共振或優(yōu) 選通過熒光方法。在后一種情況下，雜交探針通常用熒光標記來標記， 熒光信號的產(chǎn)生由于某種原因取決于雜交復(fù)合物的形成。在優(yōu)選的實施方案中，測定以均一^f企測形式進行例如，目標核 酸可在解鏈溫度測定之前以采用適宜擴增引物的典型PCR反應(yīng)來擴 增。在擴增反應(yīng)當中已存在適宜的雜交探針。雜交探針優(yōu)選具有在適 宜的激發(fā)后可檢測的熒光標記。例如，雜交探針可為分子信標(Lizardi 等，美國專利第5,118,801號)或一起能夠按照所謂的FRET-Hybprobe 形式起作用的熒光標記的寡核苷酸對(WO 97/46714)。在完成PCR反 應(yīng)后，不斷地增加樣品溫度。只要雜交探針與目標DNA結(jié)合，就可 以檢測到熒光。但是，在解鏈溫度，雜交探針由其靶釋放，熒光信號 立即下降至背景水平。這種下降可用適宜的溫度-時間圖監(jiān)測，使得可 以確定觀察到溫度下降的確切溫度值。優(yōu)選地，目標核酸是目標核酸群，纟笨針對是探針對群(a group of a pair of probes),由此每個探針對均與目標核酸群的成員雜交。優(yōu)選地，標記為熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料或香豆素染 料。更優(yōu)選地，標記為熒光素、LC-Red610、 LC-Red640、 LC-Red 670 或LC-Red 705。優(yōu)選地，目標核酸的核酸序列為對微生物、細胞或病毒特異性的 核酸序列。更優(yōu)選地，微生物為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性微生物或真 菌。再更優(yōu)選地，a)革蘭氏陽性微生物為奇異變形菌CPra&us w/raM/s)、粘質(zhì)沙雷 氏菌(Serraf/(3 ma/xescem1)、逢包氏不動^干菌(^4">7&06<^&/- 6<awwa""z7)、 克雷伯氏肺炎桿菌; "ewmow'ae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(A7e^/e〃a o;c_ytoca」、產(chǎn)氣腸4干菌(五"fero6a"er aeragewes)、 陰溝腸牙干菌 (五"&ra6ac&r c/oacae)、 大腸才干菌(五sc/zen'c/n'a co//)、 ^同纟錄有支單月包菌 (i^ewciomcwas aemg7'"osaj 或*"耆麥寡養(yǎng)單月包菌(&ewo rc p/7omowasb) 革蘭氏陰性微生物為葡萄球菌屬OSto/ /z;;/ococciw w;7.)、屎腸球 菌(五她racoccws ^ecz'應(yīng))或糞腸球菌(五她racoccws y^ecafc)或鏈球菌 屬(》epfococcz^ ^sp/ .), 或c) 真菌為白色念^朱菌(Caw^ia a/Z^c朋力、煙曲霉C^/ e^g77/w /w柳.gaft^)、 克柔念J朱菌(G3"t&fa; ^rww/)、 光滑念5朱菌(Ca"cfe/a g7"Z rato」、近平滑念珠菌(Qm(i油para戸7cm'jO或熱帶念珠菌(Ca"(i油在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法是自動化的，即所述方法 如在W099/16781中所述執(zhí)行自動化過程。自動化過程指該過程的步 驟適于用能夠在基本沒有或沒有外部控制或人類影響的情況下操作 的裝置或設(shè)備來實施。自動化方法指可自動化的方法的步驟用能夠在 基本沒有或沒有外部控制或人類影響的情況下操作的裝置或設(shè)備來 實施。只有該方法的制備步驟才有可能必須手工進行，例如儲存容器 必需裝填和就位，樣品的選擇必須由人以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它步驟，例如控制計算機的操作來進行。所述裝置或設(shè)備例如可以自 動添加液體、混合樣品或于特定溫度實施溫育步驟。典型地，這樣的 設(shè)備或裝置為由計算機控制的機器人，其帶有其中指定單個步驟和指 令的程序。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法為高通量形式，即 自動化方法以高通量形式進行，高通量形式意指所述方法和所使用的 機器或裝置在短時間內(nèi)對高通量的樣品最佳化。在本發(fā)明的另 一個實施方案中， 一種用于驗證指示存在目標生物 分子的信號測定結(jié)果的方法包括以下步驟a)提供-含有內(nèi)部對照生物分子并懷疑含有目標生物分子的樣品，和 -含有內(nèi)部對照生物分子但不含目標生物分子的陰性對照樣品，和-含有目標生物分子并含有內(nèi)部對照生物分子的陽性對照樣-含有目標生物分子并任選地含有內(nèi)部對照生物分子的試劑 對照樣品，b) 測定每個樣品中的內(nèi)部對照生物分子信號和目標生物分子信c) 如下驗證指示試樣中存在目標生物分子的試樣中目標生物分 子信號的存在情況-獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況檢查懷疑含有目標 生物分子之樣品的目標生物分子信號存在情況，或在沒有目標生物分 子信號的情況下檢查內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照生物分子信號和是否不 存在目標生物分子信號，-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照生物分子信號，和-檢查試劑對照樣品是否存在目標生物分子信號和任選地檢查 是否存在內(nèi)部對照生物分子信號。在本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實施方案中，內(nèi)部對照生物分子包含目標 生物分子的一部分，陽性對照樣品包含含有目標生物分子的病毒、微 生物或細胞，或者其中陽性對照樣品為含有目標生物分子或其部分的 溶液，或者其中試劑對照樣品為含有目標生物分子或其部分的溶液。優(yōu)選地，目標生物分子為目標生物分子群。更優(yōu)選地，生物分子為核酸。在優(yōu)選的實施方案中，目標核酸和內(nèi)部對照核酸在步驟b)之前擴 增。優(yōu)選的擴增步驟如上所述。優(yōu)選的擴增和檢測方法如上文所述。在又一個優(yōu)選實施方案中， 目標核酸信號或內(nèi)部對照核酸信號為焚光信號。更優(yōu)選地，熒光信號 通過連接至探針的標記產(chǎn)生，而所述探針與目標核酸或內(nèi)部對照核酸 雜交。用于驗證指示存在目標生物分子的信號測定結(jié)果的方法的所有 其它優(yōu)選實施方案和實施方案的具體描述為關(guān)于本發(fā)明方法所提及 的那些，即用于檢測在懷疑含有目標生物分子的樣品中是否存在目標 生物分子的方法(見上文)、用于檢測在懷疑含有目標核酸群成員的樣 品中是否存在目標核酸群成員的方法(見下文)和/或用于驗證指示存在 核酸群成員的信號測定結(jié)果的方法(見下文)。在本發(fā)明的再一個實施方案中，提供用于檢測在懷疑含有目標核 酸群成員的樣品中是否存在目標核酸群成員的方法，其包括以下步驟或^口下進4亍a) 將內(nèi)部對照核酸加至-懷疑含有目標核酸群成員的樣品，和 -不含有目標核酸群成員的陰性對照樣品，和-含有目標核酸群成員的陽性對照樣品，b) 提供含有目標核酸群并任選地含有內(nèi)部對照核酸的試劑對照樣品，c) 任選地由步驟a)和/或b)的樣品純化所述核酸，以獲得包含所 純化的核酸的樣品，d) 在步驟a)和b)中或步驟b)和c)中獲得的每個樣品中測定是否存 在內(nèi)部對照核酸信號和目標核酸群成員信號，e) 如下驗證在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中目標核酸群成 員信號的存在與否-獨立于內(nèi)部對照核酸信號的存在情況檢查懷疑含有目標核酸 群成員的樣品中目標核酸群成員信號的存在情況，或在沒有目標核酸 群成員信號的情況下檢查內(nèi)部對照核酸信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照核酸信號和是否不存在 目標核酸信號，-檢查試劑對照樣品是否存在每個目標核酸群成員信號和任選 地檢查是否存在內(nèi)部對照核酸信號，和-檢查陽性對照樣品是否存在目標核酸群成員信號和是否存在 內(nèi)部對照核酸信號，或f)檢測目標核酸群成員的存在與否，由此在步驟d)中測定并在步 驟e)中驗證的目標核酸群成員信號和內(nèi)部對照核酸信號的存在和/或 不存在表明了懷疑含有目標核酸群成員的樣品中目標核酸群成員的 存在與否。該方法具有以下優(yōu)勢含目標核酸群和任選的內(nèi)部對照核酸的試 劑對照樣品的使用，允許在以內(nèi)部對照核酸為對照之外確定用于4企測 目標核酸群的所有相應(yīng)成員的試劑(即尤其是引物和探針)是否正確地 起作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，內(nèi)部對照生物分子包含目標生物分 子的一部分，陽性對照樣品包含含有目標生物分子的病毒、微生物或 細胞，或者其中陽性對照樣品為含有目標生物分子或其部分的溶液， 或者試劑對照樣品為含有目標生物分子或其部分的溶液。在本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實施方案中，目標核酸群成員和內(nèi)部對照 核酸在步驟d)之前擴增。優(yōu)選的擴增步驟在上文描述。優(yōu)選的擴增和檢測方法在上文描述。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施 方案中，目標核酸群成員或內(nèi)部對照核酸的信號為焚光信號。優(yōu)選地， 熒光信號由連接至探針的標記產(chǎn)生，而所述探針與目標核S交群成員或 內(nèi)部對照核酸雜交。更優(yōu)選地，熒光信號由與目標核酸群成員雜交的 探針對群的成員產(chǎn)生，或由與內(nèi)部對照核酸雜交的探針對成員產(chǎn)生， 其中與目標核酸群成員雜交的每個探針對群成員或與內(nèi)部對照核酸 雜交的4笨針對成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與相應(yīng)的核酸 雜交，其中探針對的第一個探針用供體熒光標記來標記，其中探針對 的第二個探針用對應(yīng)的受體熒光標記來標記，其中第一個探針和第二 個探針與目標核酸群成員或內(nèi)部對照核酸成員的雜交使它們獲得共 振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系。優(yōu)選地，本發(fā)明方法的步驟d)包含以下分步驟dl)將以下物質(zhì)加至在步驟a)和b)中或步驟b)和c)中獲得的樣口卩 -與內(nèi)部對照核酸和目標核酸群成員雜交的引物對，或與內(nèi)部對物對群(a group of a pair of primers),-與內(nèi)部對照核酸雜交的第一個探針對，其中所述第一個探針對 的成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與內(nèi)部對照核酸雜交，其 中所述第 一個探針對的第 一個探針用第 一供體熒光標記來標記，其中 所述第 一個探針對的第二個探針用對應(yīng)的第 一受體熒光標記來標記， 其中第 一個探針和第二個探針與內(nèi)部對照核酸的雜交使它們獲得共 振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；-每個成員均與目標核酸群成員雜交的探針對群，其中探針對群 成員以彼此相距不超過5個核苦酸的距離與相應(yīng)目標核酸群成員雜 交，其中探針對群成員的第一個探針用第二供體熒光標記來標記，其中探針對群成員的第二個探針用對應(yīng)的第二受體熒光標記來標記，其 中第一個探針和第二個探針與目標核酸群成員的雜交使它們獲得共 振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；和-擴增內(nèi)部對照核酸和目標核酸群所必需的熱穩(wěn)定性核酸聚合 酶和試齊'J ，d2)如果在對應(yīng)樣品中存在內(nèi)部對照核酸和目標核酸群，則擴增 樣品中的內(nèi)部對照核酸和目標核酸群，d3)獨立地測定每個樣品中隨對應(yīng)樣品溫度變化的內(nèi)部對照核 酸和/或目標核酸群成員的熒光信號是否存在，-由此通過所述第一個探針對之第一個探針的第 一供體熒光標 記和第 一個探針對之第二個探針的第 一受體熒光標記之間的熒光共 振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對內(nèi)部對照核酸特異性的熒光信號，和-由此通過所述探針對群成員的第 一個探針的第一供體熒光標 記和探針對群成員的第二個探針的第 一受體熒光標記之間的熒光共^^能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對目標核酸群成員特異性的熒光。測定隨溫度變化的內(nèi)部對照核酸和/或目標核酸群成員的焚光信 號是否存在("解鏈曲線分析")。解鏈曲線分析的確切描述可見于上文。優(yōu)選地，標記為熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料或香豆素染料。更優(yōu)選地，標記為熒光素、LC-Red610、 LC-Red640、 LC-Red 670 或LC-Red 705。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，目標核酸群成員包含對微生 物、細胞或病毒特異性的核酸序列。優(yōu)選地，微生物為革蘭氏陽性或 革蘭氏陰性微生物或真菌。更優(yōu)選地，a) 革蘭氏陽性微生物為奇異變形菌(尸ra/ei^w/ra&fe)、粘質(zhì)沙雷 氏菌(Se^r"打'a wa/rescem)、金包氏不動才干菌(y4c/"eto6acfer 6awmaw7z7)、 克雷伯氏肺炎桿菌(尺/eZwW/a / "ewmom'ae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(A7e&zW/a o;c少toca」、產(chǎn)氣腸 一干菌(五"fera^cfer (3erage"es)、 陰溝腸4干菌 (五"&ra6ac/er c/o"cae)、 大腸桿菌(Esc/zen'c/2/a co//)、銅綠假單月包菌 (尸^i^/owo"os aerwg/"o一 或嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(&e"ofro/^謂o"os wa/啤/n'/z'^ ，b) 革蘭氏陰性微生物為葡萄球菌屬OStop /ococcus wp.)、屎腸球 菌(五w/eracoccus y^ec/讓)或糞腸球菌(jE"feracoccws々ecafe)或鏈球菌 屬(*SVre/ tococcws 5pp.)，c) 所述真菌為白色念i朱菌(Qw(ii'(ia a/6/cam)、煙曲霉04s/ erg77/us /畫/gcrto)、 克柔念珠菌(C朋(i/(ia Arw"/)、 光滑念珠菌(Ca"(i,(ia g勵rato」、近平滑念珠菌(Ca"c^;7ara戸7osz》或熱帶念珠菌(Ca"(i油用于檢測在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中是否存在目標核 酸群成員的方法的所有其它優(yōu)選實施方案和實施方案的具體描述為 關(guān)于本發(fā)明方法所提及的那些，即用于檢測在懷疑含有目標生物分子 的樣品中是否存在目標生物分子的方法(見上文)、用于驗證指示存在 目標生物分子的信號測定結(jié)果的方法(見上文)和用于驗證指示存在目標核酸群成員的信號測定結(jié)果的方法(見下文)。在本發(fā)明的另 一個實施方案中，提供用于驗證指示存在目標核酸 群成員的信號測定結(jié)果的方法，其包括以下步驟a) 提供-含有內(nèi)部對照核酸并懷疑含有目標核酸群成員的樣品，-含有目標核酸群并任選地含有內(nèi)部對照核酸的試劑對照樣口卩-不含目標核酸群成員而含有內(nèi)部對照核酸的陰性對照樣品，和-含有目標核酸群成員和內(nèi)部對照核酸的陽性對照樣品b) 測定每個樣品中的內(nèi)部對照核酸和目標核酸群成員的信號，c) 如下驗證懷疑含有目標核酸群成員的樣品中目標核酸群成員 信號的存在情況-獨立于內(nèi)部對照核酸信號的存在情況檢查懷疑含有目標核酸 群成員的樣品的目標核酸成員信號存在情況，或在沒有目標核酸群成 員信號的情況下檢查內(nèi)部對照核酸信號的存在情況，-檢查試劑對照樣品是否存在每個目標核酸群成員的信號，-檢查陰性對照樣品是否不存在目標核酸群成員信號和是否存 在內(nèi)部對照核酸信號，和-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照核酸信號。在優(yōu)選的實施方案中，內(nèi)部對照核酸包含目標核酸群成員的一部 分，陽性對照樣品包含含有目標核酸的病毒、微生物或細胞，或者其 中陽性對照樣品為含有目標核酸群成員或其部分的溶液，或者試劑對 照樣品為含有目標核酸群成員或其部分的溶液。優(yōu)選地，目標核酸和內(nèi)部對照核酸在步驟c)之前擴增。優(yōu)選的擴 增步驟在上文描述。優(yōu)選的擴增和沖企測方法在上文描述。優(yōu)選地，目標核酸成員或內(nèi)43部對照核酸的信號為熒光信號。更優(yōu)選地，熒光信號通過連接至探針 的標記產(chǎn)生，而所述^笨4十與目標核酸群成員或內(nèi)部對照核酸雜交。用于驗證指示存在目標核酸群成員的信號測定結(jié)果的方法的所 有其它優(yōu)選實施方案和實施方案的具體描述為關(guān)于本發(fā)明方法所提 及的那些，即用于檢測在懷疑含有目標生物分子的樣品中目標生物分 子是否存在的方法(見上文)、用于驗證指示存在目標生物分子的信號品中是否存在目標核酸群成員的方法(見下文)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，任選地含有內(nèi)部對照生物分子的 試劑對照樣品和含有內(nèi)部對照生物分子的陽性對照樣品(兩種樣品均 含有目標生物分子)，用于檢測在懷疑含有目標生物分子的樣品中是否 存在目標生物分子，或用于馬企證指示存在目標生物分子的信號測定結(jié) 果。本發(fā)明方法的所有優(yōu)選實施方案也是本發(fā)明用途的優(yōu)選實施方 案。在另 一個優(yōu)選實施方案中，提供用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑盒，其含有a) 含有目標核酸或目標核酸群成員的試劑對照樣，b) 不含目標核酸或目標核酸群成員的陰性對照樣'c) 含有目標核酸或目標核酸群成員的陽性對照樣，d) 內(nèi)部對照核酸，和e) 用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑。優(yōu)選地，在本發(fā)明的試劑盒中，用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑含有-探針對和引物對-熱穩(wěn)定性核酸聚合酶，以及-用于擴增目標核酸或目標核酸群成員的試劑。本領(lǐng)域已知的這樣的試劑盒還包含可在樣品制備程序當中使用的塑料器皿，例如為96孔或384孔形式的微量滴定板或就是例如由_口口-品, Germany制造的普通反應(yīng)管，以及用于實施本發(fā) 明方法的所有其它試劑。因此，所述試劑盒可另外包含對核酸具有親 和力的物質(zhì)，優(yōu)選地，對核酸具有親和力的物質(zhì)包括具有二氧化硅表 面的物質(zhì)。優(yōu)選地，具有二氧化硅表面的物質(zhì)為玻璃。最優(yōu)選地，對 核酸具有親和力的物質(zhì)為含有磁性玻璃粒的組合物。所述試劑盒可以 進一步或另外地包含允許裂解細胞的裂解緩沖液，其含有例如離液 劑、變性劑或醇類或它們的混合物。本發(fā)明試劑盒的這些組分可單獨 地在管或儲存容器中提供。根據(jù)組分的性質(zhì)，這些組分甚至可在一個 管或儲存容器中提供。所述試劑盒可以進一步或另外地包含洗滌溶 液，其適于DNA或RNA與f茲性玻璃粒結(jié)合時的-茲性玻璃粒的洗滌步 驟。該洗滌溶液可含有乙醇和/或離液劑的緩沖溶液或具有酸性pH、 無上述乙醇和/或離液劑的溶液。洗滌溶液或其它溶液經(jīng)常作為在使用 前必須稀釋的貯液提供。所述試劑盒可進一步或另外地包含洗脫劑或洗脫緩沖液，即溶液 或緩沖液(例如10 mM Tris、 1 mM EDTA， pH 8.0)或純水，以洗脫與 磁性玻璃粒結(jié)合的DNA或RNA。此外，可存在額外的試劑或緩沖溶 液，其可用于核酸(即DNA或RNA)的純化過程。本發(fā)明的用途和試劑盒的所有其它優(yōu)選實施方案和實施方案的 具體描述為關(guān)于本發(fā)明方法所提及的那些，即用于檢測在懷疑含有目 標生物分子的樣品中目標生物分子是否存在的方法(見上文)、用于驗 證指示存在目標生物分子的信號測定結(jié)果的方法(見上文)、用于;f全測 在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中是否存在目標核酸群成員的方 法(見上文)和用于驗證指示存在目標核酸群成員的信號測定結(jié)果的方 法(見上文)。提供以下的實施例和附圖是為了幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正 范圍在隨附的權(quán)利要求中闡明。要理解的是，在不偏離本發(fā)明精神的 情況下，可對所陳述的步附圖描述所有附圖都在x軸上顯示溫度，在y軸上顯示焚光強度圖的負一 階導(dǎo)數(shù)(-dF/dT熒光)。

圖1:在圖1中顯示了對RC G+ (反應(yīng)對照G+)的解鏈曲線分析 的結(jié)果。對于在RCG+試劑中所代表的不同目標生物的每一種，個體 解鏈曲線峰(dF/dT; F-熒光；T =溫度)可在不同的檢測通道和于不同 的解鏈峰溫度檢測到。圖2:在圖2中顯示了對RC G-(反應(yīng)對照G-)的解鏈曲線分析的 結(jié)果。對于在RCG-試劑中所代表的不同目標生物的每一種，個體解 鏈曲線峰(dF/dT; F =熒光；T =溫度)可在不同的檢測通道和于不同的 解鏈峰溫度檢測到。圖3:在圖3中顯示了對RCF(反應(yīng)對照F)的解鏈曲線分析的結(jié) 果。對于在RC F試劑中所代表的不同目標生物的每一種，個體解鏈 曲線峰(dF/dT; F =熒光；T =溫度)可在不同的檢測通道和于不同的解 鏈峰溫度檢測到。圖4:在圖4中顯示了對在3個不同的多重試驗中獲得的RC G-(反應(yīng)對照G-;檢測通道610)的解鏈曲線分析。在第一個試驗中，獲 得了在RC G-中所代表的全部3種目標生物的解鏈峰(dF/dT; F =熒光； T-溫度)，而在第二個和第三個試驗中，分別失去目標2和目標1的 解鏈峰。失去的解鏈曲線峰清楚表明，在試驗2和3中所使用的試劑 和/或反應(yīng)條件分別不能用于和/或不適于目標2和目標1的檢測。圖5:圖5顯示了含有糞腸球菌(五./oecofe)和白色念珠菌(C. "/Wca"力的血液樣品的解鏈曲線分析結(jié)果。在樣品制備前將IC摻入到 血液樣品中，并與目標核酸一起共純化。在G+測定和F測定中獲得 了 2種目標生物(糞腸球菌(E /aerafe)、白色念珠菌(C. "/Wca"力)的個 體解鏈曲線信號，但在G-測定中沒有獲得。然而，對于全部3種測定 (G+、 G-、 F),于預(yù)期的解鏈峰溫度都檢測到對應(yīng)的IC信號(ICG+、 ICG-、 ICF)。觀察到的IC信號表明了所使用的適宜反應(yīng)條件，由此證實了全部3種測定所獲得的結(jié)果的有效性。實施例 一般說明所有試劑都需要檢查是否被所檢測生物污染。只有沒有那些生物 和源自其的核酸的試劑才可以產(chǎn)生最佳靈敏度。對照使用含有介于16s rRNA (核糖體核糖核酸)和23sRNA基因(細菌 目標)之間以及介于18s rRNA和28sRNA基因(真菌目標)之間的ITS 區(qū)(ITS:內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))的質(zhì)粒DNA (約104個拷貝的質(zhì)粒DNA)的 混合物制備RC G-、 RC G+、 RC F和IC對照試劑(RC:試劑對照， G-:革蘭氏陰性，G+:革蘭氏陽性，F(xiàn):真菌，IC:內(nèi)部對照)a) RC G誦pTE-Smar-1: 基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有粘質(zhì)沙雷氏菌(S.warcesce"力16S/23S-rRNA-間隔區(qū) pTE-Abau-1: 基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有鮑氏不動桿菌(Ak 簡畫/z〕 16S/23S-rRNA-間隔區(qū) pTE-Koxy-1: 基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Kox_ytoca) 16S/23 S-rRNA-間隔區(qū) pTE-Eclo-1:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有陰溝腸桿菌(五.c/oacae)16S/23S-rRNA畫間隔區(qū) pTE-Ecol-1 :基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有大腸桿菌(五.co//)16S/23S-rRNA-間隔區(qū) pTE-Pmir-1:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有奇異變形菌(尸.wz'ra&7/力16S/23S-rRNA-間隔區(qū) pTE-Paer-2:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有銅綠假單胞菌(尸.aerag&o;ya) 16S/23 S-rRNA-間隔區(qū)pTE-Smal-l: 基于的質(zhì)粒pT3T7BM ，含有嗜麥寡養(yǎng)單胞菌OS. wa/top/n7/a) 16S/23S-rRNA-間隔區(qū)b) RC G+:p Staph—wt:pEntero_l: pEntero—2: pStrep一wt:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有金黃色葡萄球菌(S.孤rn^) 16S/23S-rRNA-間隔區(qū)基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有糞腸球菌(五./aeca//" 16S/23S-rRNA-間隔區(qū)基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有屎腸球菌(E /^c/wm) 16S/23S隱rRNA匿間隔區(qū) 基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有肺炎鏈球菌(S. ;wewnom'ae) 16S/23S-rRNA-間隔區(qū)RCF:pAftim-PC-PFl:pCgla-PC-PFl:pCalb-PC-PFl:pCkru-PC-PFl:pCtrop-PC-PFl:pCpara-PC-PFl:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有煙曲霉(A /ww/ga^s) 18S/28S-rRNA-間隔區(qū)基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有光滑念珠菌(C. g/Wrato) 18S/28S-rRNA-間隔區(qū)基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有白色念珠菌(C a/Wc^w) 18S/28S畫rRNA-間隔區(qū)基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有克柔念珠菌(C. 18S/28S-rRNA-間隔區(qū)基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有熱帶念珠菌(C. 化c^cafc) 18S/28S-rRNA畫間隔區(qū) 基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有近平滑念珠菌(C. ; ara; w7ow》18S/28S-rRNA-間隔區(qū)c) IC:pTE-Paer-IC/2:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有銅綠假單胞菌(尸.aen^z'"osa) 16S/23S-rRNA-間隔區(qū)和IC G-特異性探 針結(jié)合位點pICG+: 基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有屎腸球菌(五.々ec/ww)16S/23S-rRNA-間隔區(qū)和IC G+特異性探針結(jié)合位點 pAflim(FP 10/21 )-ICv2-PF 1:基于pT3T7BM的質(zhì)粒，含有白色念珠菌(C. a仏/cara) 18S/28S-rRNA-間隔區(qū)和IC F特異性:探針結(jié)合位點 如果適宜的載體是pT3T7BM，則在實施例中使用的對照帶有多 個克隆位點連同T3和T7 RNA聚合酶的啟動子，可得自Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 。 參見載體凄史才居庫的序歹'j (http:〃seq.yeastgenome.org 或 http:〃seq.yeastgenome.org/vectordb/vector_descrip/PT3T7BM.html)。硬件/軟件使用LightCyclerTM 2.0 "i殳備(Roche Diagnostics GmbH, Germany) 和100 |al毛細管轉(zhuǎn)子于610 nm、 640 nm、 670 nm和705 nm進行雜交 探針的熒光檢測。原始數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和數(shù)據(jù)分析使用LightCycler軟件 4.05 (Roche Diagnostics GmbH， Germany)進行。試劑本文提及的所有寡核苷酸都通過化學(xué)合成制備。用于連接標記的 ^式劑可購自Roche Diagnostics GmbH (LightCycler Red 640 NHS酯，目 錄號2015161; LightCycler Red 705亞磷酰胺，目錄號2157594; LightCycler焚光素(在以下縮寫為'F，)CPG,目錄號3113906)。那些試 劑的使用描述于Biochemica第1期(2001), 8-13頁。Cy5-NHS酯可經(jīng) 要求得自Amersham。 LC-Red 610-NHS酯于610 nm具有最大發(fā)射， 使用公開于US 5,750,409的焚光染料按照標準方法合成。FastStart DNA聚合酶和FastStart Master —般如在LightCycler FastStart DNA Master雜交探針試劑盒(Roche Diagnostics GmbH ，目 錄號2239272)中推薦的方法^f吏用。按照試劑盒生產(chǎn)商的說明，引物以 各自0.3-1 (iM的終濃度使用，雜交探針以各自約0.2 |aM的濃度使用。 所使用的MgCl2濃度為3.5 mM。i式劑禾口 i式劑盒可3尋自 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany 。方法對樣品(尤其是臨床樣品)進行樣品制備，其中核酸由樣品的其它 組分釋放和純化。這使用MagNA Pure LC和MagNA PureTM LC DNA分離試劑盒III (細菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH， Germany, 目錄號3 264 785)進行。樣品制備物以在洗脫緩沖液中含有核酸的標 本獲得。IC在樣品制備當中(例如在MagNA Pure⑧設(shè)備中)處理，或者加入 到完整的主混合物(mastermix)中(參見下文)，這取決于其是要作為樣 品制備程序的過程中對照還是用于LightCycler⑧設(shè)備的每個毛細管中 的測定性能的過程中對照。以在經(jīng)純化的核酸制備物和對應(yīng)的對照試 劑(RCG+、 RCG-、 RCF)作為樣品，在LightCycler⑧設(shè)備中的運行以 100 |ul反應(yīng)體積使用以下的熱循環(huán)和解鏈溫度模式進行循環(huán)時間(秒)溫度(。c)斜率(。C/s)獲得方式變性160095 °C20無擴增1515953無505820無40723無擴增3015953無505020單一的40723無解鏈曲線1609520無604020無0800.1連續(xù)的冷卻1304020無5權(quán)利要求
1.一種用于檢測在懷疑含有目標生物分子的樣品中是否存在目標生物分子的方法，所述方法包括以下步驟a)其中該步驟由步驟a1)或a2)組成a1)將內(nèi)部對照生物分子加至-懷疑含有目標生物分子的樣品，和-不含目標生物分子的陰性對照樣品，-含有目標生物分子的陽性對照樣品，和-含有目標生物分子的試劑對照樣品a2)將內(nèi)部對照生物分子加至-懷疑含有目標生物分子的樣品，和-不含目標生物分子的陰性對照樣品，和-含有目標生物分子的陽性對照樣品，并提供包含目標生物分子的試劑對照樣品，b)任選地由步驟a)的樣品純化所述生物分子，以獲得包含所純化的生物分子的樣品，c)測定在步驟a)或b)中獲得的每個樣品中內(nèi)部對照生物分子信號和目標生物分子信號的存在與否，d)如下驗證在懷疑含有目標生物分子的樣品中存在或不存在目標生物分子信號-獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況檢查懷疑含有目標生物分子之樣品的目標生物分子信號的存在情況，或在沒有目標生物分子信號的情況下檢查內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照生物分子信號和是否不存在目標生物分子信號，-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi)部對照生物分子信號，和-檢查所述方法的步驟d)中的試劑對照樣品的目標生物分子信號存在情況，或檢查試劑對照樣品是否存在目標生物分子信號以及任選地檢查是否存在內(nèi)部對照生物分子信號，e)檢測目標生物分子的存在與否，由此在步驟c)中測定并在步驟d)中驗證的目標生物分子信號和內(nèi)部對照生物分子信號的存在或不存在指示試樣中存在或不存在目標生物分子。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述陰性對照樣品為包含鹽和緩沖物質(zhì)的溶液。
3. 權(quán)利要求1-2中任一項的方法，其中所述內(nèi)部對照生物分子包 含目標生物分子的一部分。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述試劑對照樣品和/或 陽性對照樣品為包含目標生物分子或其部分的溶液。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述陽性對照樣品包含含 有目標生物分子的病毒、微生物或細胞。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述目標生物分子為目標 生物分子群。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述生物分子為核酸。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述目標核酸和內(nèi)部對照核酸在步驟 c)之前纟皮擴增。
9. 權(quán)利要求7-8中任一項的方法，其中所述目標核酸或內(nèi)部對照 核酸的信號為熒光信號。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述熒光信號通過連接至探針的標 記產(chǎn)生，而所述探針與目標核酸或內(nèi)部對照核酸雜交。
11. 權(quán)利要求IO的方法，其中所述熒光信號由與相應(yīng)的核酸雜交 的探針對產(chǎn)生，其中所述探針對成員以彼此相距不超過5個核苷酸的 距離與相應(yīng)的核酸雜交，其中所述探針對的第 一個探針用供體熒光標 記來標記，其中所述探針對的第二個探針用對應(yīng)的受體熒光標記來標 記，其中第 一個探針和第二個探針與相應(yīng)核酸的雜交使它們獲得共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系。
12.權(quán)利要求11的方法，其中步驟C)包括以下分步驟cl)將以下物質(zhì)加至在步驟a)或b)中獲得的樣品 -與內(nèi)部對照核酸和目標核酸雜交的引物對，或兩個引物對，其 中第 一個引物對與內(nèi)部對照核酸雜交，第二個引物對與目標核酸雜 交，-與內(nèi)部對照核酸雜交的第一個探針對，其中所述第一個探針對 的成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與內(nèi)部對照核酸雜交，其 中所述第一個探針對的第一個探針用第一供體熒光標記來標記，其中 所述第 一個探針對的第二個探針用對應(yīng)的第 一受體熒光標記來標記， 其中第 一個探針和第二個探針與內(nèi)部對照核酸的雜交使它們獲得共 振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；-與目標核酸雜交的第二個^:針對，其中所述第二個探針對的成 員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與目標核酸雜交，其中所述第 二個探針對的第一個探針用第二供體熒光標記來標記，其中所述第二 個探針對的第二個探針用對應(yīng)的第二受體熒光標記來標記，其中第一 個探針和第二個探針與目標核酸的雜交使它們獲得共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；和-擴增內(nèi)部對照核酸和目標核酸所必需的熱穩(wěn)定性核酸聚合酶 和試劑，c2)如果在樣品中存在內(nèi)部對照核酸和目標核酸，則擴增對應(yīng)樣 品中的內(nèi)部對照核酸和目標核酸，c3)獨立地測定每個樣品中隨對應(yīng)樣品溫度變化的內(nèi)部對照核酸 和目標核酸的萸光信號是否存在，由此通過所述第 一個探針對之第 一個探針的第 一供體熒光標記 和第一個探針對之第二個探針的第一受體熒光標記之間的熒光共振 能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對內(nèi)部對照核酸特異性的熒光信號，和-由此通過所述第二個探針對之第一個探針的第一供體熒光標記和第二個探針對之第二個探針的第 一受體焚光標記之間的焚光共 振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對目標核酸特異性的焚光信號。
13. 權(quán)利要求7-12中任一項的方法，其中所述目標核酸是目標核酸群，所述探針對是探針對群，由此每個探針對都與目標核酸群的成員雜交。
14. 權(quán)利要求10-12中任一項的方法，其中所述標記是熒光素染 料、羅丹明染料、花菁染料或香豆素染料。
15. 權(quán)利要求7-14中任一項的方法，其中目標核酸的核S拼列是 微生物、細胞或病毒特異性的核酸序列。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述微生物是革蘭氏陽性微生物或 革蘭氏陰性微生物或真菌。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中a) 所述革蘭氏陽性微生物為奇異變形菌(iVotowm/raM&)、粘質(zhì) 沙雷氏菌(Serra^.a ^zarcescem) 、 #包氏不動4干菌04cz'""o6ac/er 6flwma""http://)、克雷4白氏肺炎牙干菌(^76^ /6//" / "ewmo"/ae)、 產(chǎn)酉臾克雷4白 氏菌(尺/efe/e〃a ox_ytoc")、產(chǎn)氣腸4干菌(五"fera6ac/er aeroge"es)、陰溝腸 桿菌CE"&rakjf"er c/oacae)、大腸桿菌(五sc/2en'c/n'a co")、銅綠,i單月包 菌(尸sew(iowo"ay 或嗜麥寡養(yǎng)單胞菌(5fe"o&o; /zcwo/iasb) 所述革蘭氏陰性微生物為葡萄球菌屬(&ap /ococa^ s/p.)、屎 腸球菌(E"terococcus ^e"'畫)或糞腸球菌(五"/erococcws々ec"fe)或鏈 球菌屬(5^e/ tococcus1 s/ / .), 或c) 所述真菌為白色念珠菌(Oz"A血"/Wca"力、煙曲霉(^^/ erg/〃wj /w柳'g(3加s)、 克柔念珠菌(Ca"&cfc！ Arw^O 、 光滑念J朱菌(Ca"(iWa g/a5rato)、近平滑念珠菌(Ca"(i油/ ara拜7o測或熱帶念珠菌(G3"^sb
18. —種驗證指示存在目標生物分子之信號的測定結(jié)果的方法， 所述方法包括以下步驟a) 提供-含有內(nèi)部對照生物分子并懷疑含有目標生物分子的^f羊品，和 -含有內(nèi)部對照生物分子但不含目標生物分子的陰性對照樣品，和-含有目標生物分子并含有內(nèi)部對照生物分子的陽性對照樣品， -含有目標生物分子并任選地含有內(nèi)部對照生物分子的試劑對 照樣品，b) 測定每個樣品中的內(nèi)部對照生物分子信號和目標生物分子，c) 如下驗證試樣中指示試樣中存在目標生物分子的目標生物分 子信號的存在情況-.,-獨立于內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況檢查懷疑含有目標 生物分子之樣品的目標生物分子信號的存在情況，或在沒有目標生物 分子信號的情況下檢查內(nèi)部對照生物分子信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照生物分子信號和是否不 存在目標生物分子信號，-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi) 部對照生物分子信號，和-檢查試劑對照樣品是否存在目標生物分子信號以及任選地檢 查是否存在內(nèi)部對照生物分子信號。
19. 權(quán)利要求18的方法，-其中所述內(nèi)部對照生物分子包含目標生物分子的一部分，-其中所述陽性對照樣品包含含有目標生物分子的病毒、微生物或細胞，或者其中所述陽性對照樣品為包含目標生物分子或其部分的溶液,或-其中所述試劑對照樣品為包含目標生物分子或其部分的溶液。
20. 權(quán)利要求18-19中任一項的方法，其中所述目標生物分子為 目標生物分子群。
21. 權(quán)利要求18-20中任一項的方法，其中所述生物分子為核酸。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述目標核酸和內(nèi)部對照核酸在步 驟b)之前被擴增。
23. 權(quán)利要求21-22中任一項的方法，其中所述目標核酸的信號 或內(nèi)部對照核酸的信號為熒光信號。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述焚光信號通過連接至探針的標 記產(chǎn)生，而所述#:針與目標核酸或內(nèi)部對照核酸雜交。
25. —種如下用于檢測在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中是否 存在目標核酸群成員的方法a) 將內(nèi)部對照核酸加至-懷疑含有目標核酸群成員的樣品，和-不包含目標核酸群成員的陰性對照樣品，和-含有目標核酸群成員的陽性對照樣品，b) 提供含有目標核酸群并任選地含有內(nèi)部對照核酸員的試劑對 照樣品，c) 任選地由步驟a)和/或b)的樣品純化所述核酸，以獲得包含所 純化的核酸的樣品，d) 測定在步驟a)和b)中或步驟b)和c)中獲得的每個樣品中是否 存在內(nèi)部對照核酸信號和目標核酸群成員信號，e) 如下驗證在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中目標核酸群成 員信號的存在與否-獨立于內(nèi)部對照核酸信號的存在情況檢查懷疑含有目標核酸 群成員的樣品的目標核酸群成員信號存在情況，或在沒有目標核酸群 成員信號的情況下檢查內(nèi)部對照核酸信號的存在情況，-檢查陰性對照樣品是否存在內(nèi)部對照核酸信號和是否不存在 目標核酸信號，-檢查試劑對照樣品是否存在每個目標核酸群成員信號和任選 地檢測是否存在內(nèi)部對照核酸信號，和-檢查陽性對照樣品否存在內(nèi)目標核酸群成員信號和是否存在內(nèi)部對照核酸信號，或f)檢測目標核酸群成員的存在與否，由此在步驟d)中測定并在步驟e)中驗證的目標核酸群成員信號和內(nèi)部對照核酸信號的存在和/或 不存在指示在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中存在或不存在目標 核酸群成員。
26. 權(quán)利要求25的方法，-其中所述內(nèi)部對照生物分子包含目標生物分子的 一部分，-其中所述陽性對照樣品包含含有目標生物分子的病毒、微生物或細胞，或者其中所述陽性對照樣品為包含目標生物分子或其部分的 溶液，或-其中所述試劑對照樣品為包含目標生物分子或其部分的溶液。
27. 權(quán)利要求25-26中任一項的方法，其中目標核酸群成員和內(nèi) 部對照核酸在步驟d)之前被擴增。
28. 權(quán)利要求25-27中任一項的方法，其中所述目標核酸群成員 信號或內(nèi)部對照核酸信號為熒光信號。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述熒光信號通過連接至探針的標 記產(chǎn)生，而所述4果針與目標核酸群成員或內(nèi)部對照核酸雜交。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述熒光信號由與目標核酸群成員 雜交的探針對群成員或與內(nèi)部對照核酸雜交的探針對成員產(chǎn)生，其中交的^笨針對成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與相應(yīng)的核酸雜交，其中探針對的第一個探針用供體熒光標記來標記，其中探針對的 第二個探針用對應(yīng)的受體焚光標記來標記，其中第一個探針和第二個 探針與目標核酸群成員或內(nèi)部對照核酸的雜交使它們獲得共振能量 轉(zhuǎn)移關(guān)系。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中步驟d)包含以下分步驟dl)將以下物質(zhì)加至在步驟a)和b)中或步驟b)和c)中獲得的樣-與內(nèi)部對照核酸和目標核酸群成員雜交的引物對，或與內(nèi)部對對群，-與內(nèi)部對照核酸雜交的第 一個探針對，其中所述第 一個^l罙針對 的成員以彼此相距不超過5個核苷酸的距離與內(nèi)部對照核酸雜交，_其中所述第 一個探針對的第 一個探針用第 一供體熒光標記來 標記，其中所述第 一個探針對的第二個探針用對應(yīng)的第 一受體焚光標 記來標記，其中第一個探針和第二個探針與內(nèi)部對照核酸的雜交使它們獲得共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；-每個成員均與目標核酸群成員雜交的探針對群，其中探針對群 成員以彼此相距不超過5個核普酸的距離與相應(yīng)目標核酸群成員雜 交，其中探針對群成員的第一個探針用第二供體熒光標記來標記，其 中探針對群成員的第二個探針用對應(yīng)的第二受體熒光標記來標記，其 中第一個探針和第二個探針與目標核酸群成員的雜交使它們獲得共振能量轉(zhuǎn)移關(guān)系；和-擴增內(nèi)部對照核酸和目標核酸群所必需的熱穩(wěn)定性核酸聚合酶和試劑，d2)如果在樣品中存在內(nèi)部對照核酸和目標核酸群，則擴增對應(yīng) 樣品中的內(nèi)部對照核酸和目標核酸群，d3)獨立地測定每個樣品中隨對應(yīng)樣品溫度變化的內(nèi)部對照核 酸和/或目標核酸群成員的熒光信號是否存在，-由此通過所述第一個探針對之第一個探針的第一供體熒光標 記和第一個探針對之第二個探針的第一受體熒光標記之間的熒光共 振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對內(nèi)部對照核酸特異性的熒光信號，和-由此通過所述探針對群成員的第一個探針的第一供體熒光標 記和探針對群成員的第二個探針的第 一受體熒光標記之間的熒光共 振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生對目標核酸群成員特異性的熒光。
32.權(quán)利要求25-31中任一項的方法，其中所述標記為熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料或香豆素染料。
33. 權(quán)利要求25-32中任一項的方法，其中目標核酸群成員包含 微生物、細胞或病毒特異性的核酸序列。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述微生物是革蘭氏陽性微生物或 革蘭氏陰性微生物或真菌。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中a) 所述革蘭氏陽性微生物為奇異變形菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、鮑氏不 動桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸 桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌或嗜麥寡養(yǎng)單胞菌，b) 所述革蘭氏陰性微生物為葡萄球菌屬、屎腸球菌或糞腸球菌 或鏈球菌屬，或c) 所述真菌為白色念珠菌、煙曲霉、克柔念珠菌、光滑念珠菌、 近平滑念珠菌或熱帶念珠菌。
36. —種用于驗證指示存在目標核酸群成員的信號測定結(jié)果的方 法，所述方法包括以下步驟a) 提供-含有內(nèi)部對照核酸并懷疑含有目標核酸群成員的樣品，和 -含有目標核酸群并任選地含有內(nèi)部對照核酸的試劑對照樣口P ，-不含目標核酸群成員而含有內(nèi)部對照核酸的陰性對照樣品，和-含有目標核酸群成員并含有內(nèi)部對照核酸的陽性對照樣品，b) 測定每個樣品中的內(nèi)部對照核酸信號和目標核酸群成員信c) 如下驗證在懷疑含有目標核酸群成員的樣品中目標核酸群成 員信號的存在情況-獨立于內(nèi)部對照核酸信號的存在情況檢查懷疑含有目標核酸 群成員的樣品中目標核酸成員的信號存在情況，或在沒有目標核酸群成員信號的情況下檢查內(nèi)部對照核酸信號的存在情況，-檢查試劑對照樣品是否存在每個目標核酸群成員之信號，-檢查陰性對照樣品是否不存在目標核酸群成員信號和是否存在內(nèi)部對照核酸信號，和-檢查陽性對照樣品是否存在目標生物分子信號和是否存在內(nèi)部對照核酸信號。
37. 權(quán)利要求36的方法，-其中所述內(nèi)部對照核酸包含目標核酸群成員的一部分，-其中所述陽性對照樣品包含含有目標生物分子的病毒、微生物或細胞，或者其中所述陽性對照樣品為包含目標核酸群成員或其部分 的溶液，或—其中所述試劑對照樣品為包含目標核酸群成員或其部分的溶液。
38. 權(quán)利要求36-37中任一項的方法，其中所述目標核酸和內(nèi)部 對照核酸在步驟c)之前被擴增。
39. 權(quán)利要求36-38中任一項的方法，其中所述目標核酸群成員 的信號或內(nèi)部對照核酸的信號為熒光信號。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述熒光信號通過連接至探針的標 記產(chǎn)生，而所述^:針與目標核酸群成員或內(nèi)部對照核酸雜交。
41. 任選地含有內(nèi)部對照生物分子的試劑對照樣品和含有內(nèi)部對 照生物分子的陽性對照樣品用于檢測在懷疑含有目標生物分子的樣 品中是否存在目標生物分子或驗證指示存在目標生物分子的信號測 定結(jié)果的用途，其中所述試劑對照樣品和陽性對照樣品均含有目標生 物分子。
42. 用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑盒，所述試劑盒 包含a) 含有目標核酸或目標核酸群成員的試劑對照樣品，b) 不含有目標核酸或目標核酸群成員的陰性對照樣品，C)含有目標核酸或目標核酸群成員的陽性對照樣品，d) 內(nèi)部對照核酸，和e) 用于檢測目標核酸或目標核酸群成員的試劑。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中用于檢測目標核酸或目標核酸群 成員的試劑包含-探針對和引物對，-熱穩(wěn)定性核酸聚合酶，和-用于擴增目標核酸或目標核酸群成員的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及如下檢測試樣中的目標生物分子的方法向試樣、陰性對照樣品、陽性對照樣品和試劑對照樣品加入內(nèi)部對照生物分子，或向試樣、陰性對照樣品、包含目標生物分子的陽性對照樣品加入內(nèi)部對照生物分子，并提供含目標生物分子的試劑對照樣品，測定每個樣品中的信號，并驗證信號，由此檢測目標生物分子。本發(fā)明還涉及驗證指示存在目標生物分子的信號測定結(jié)果的方法。本發(fā)明還涉及檢測樣品中是否存在目標核酸群成員的方法，以及驗證指示存在目標核酸群成員的信號檢測結(jié)果的方法。還考慮了用途和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101331237SQ200680047668
公開日2008年12月24日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者G·哈伯豪森, M·莫齊科, T·埃姆里克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司