專(zhuān)利名稱(chēng)：促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化的程序誘導(dǎo)方法
專(zhuān)利說(shuō)明促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化的程序誘導(dǎo)方法 本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)定向分化方法，該方法能提高ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化的效率，并促進(jìn)ES來(lái)源造血干細(xì)胞的功能發(fā)育。造血干細(xì)胞移植目前已成為治療白血病、重型再生障礙性貧血及某些惡性腫瘤等難治性疾病的最有效手段。由于異體造血干細(xì)胞移植需進(jìn)行嚴(yán)格的組織配型，HLA相合供體來(lái)源極為有限，限制了造血干細(xì)胞移植在臨床上的廣泛應(yīng)用。具有發(fā)育全能性的ES細(xì)胞可在體外分化為造血干細(xì)胞，但ES細(xì)胞存在著分化效率低及造血功能發(fā)育不全等問(wèn)題，目前迫切需要發(fā)明一種安全有效的方法來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化，并促進(jìn)其有效擴(kuò)增和功能發(fā)育完善，為造血干細(xì)胞移植治療提供理想的細(xì)胞來(lái)源。為了提高ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化的效率并促進(jìn)ES來(lái)源造血干細(xì)胞的功能發(fā)育，本發(fā)明建立了一種程序誘導(dǎo)方法，該方法不僅能提高ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化的效率，而且也能促進(jìn)ES來(lái)源造血干細(xì)胞的功能發(fā)育。通過(guò)該方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的造血干細(xì)胞具有在成年受體重建造血的功能。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括組織取材、基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、無(wú)血清條件培養(yǎng)液收集、程序誘導(dǎo)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化、分選造血干細(xì)胞等步驟。取傳代培養(yǎng)的ES細(xì)胞采用半固體懸浮培養(yǎng)法形成胚胎體(embryoid body，EB)；從卵黃囊(胚齡小鼠8-11天/人4-6周)、胎肝(胚齡小鼠10-14天/人8-12周)和成年骨髓組織中分離培養(yǎng)處于造血發(fā)育不同階段的造血基質(zhì)細(xì)胞，形成亞融合狀態(tài)的細(xì)胞層，也可在卵黃囊、胎肝和成年骨髓組織中僅選擇其中的兩種進(jìn)行分離培養(yǎng)，例如卵黃囊和胎肝組織，或者卵黃囊和成年骨髓組織，或者胎肝和成年骨髓組織；收集無(wú)血清基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液；聯(lián)合應(yīng)用不同階段的基質(zhì)細(xì)胞層、基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液及相應(yīng)造血生長(zhǎng)因子建立程序誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，動(dòng)態(tài)模擬胚胎造血發(fā)育微環(huán)境，程序誘導(dǎo)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化并促進(jìn)其造血功能發(fā)育完善。通過(guò)該方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的造血細(xì)胞表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志，體外具有形成原始造血細(xì)胞集落的功能，將其輸入受致死照射后的成年小鼠，具有造血重建的功能。
本發(fā)明的有益效果是，應(yīng)用程序誘導(dǎo)方法不僅能提高ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化的效率并使其有效擴(kuò)增，而且還能促進(jìn)ES來(lái)源造血干細(xì)胞的功能發(fā)育。通過(guò)該方法可誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量功能發(fā)育完善的造血干細(xì)胞，有望拓展造血干細(xì)胞移植的供體細(xì)胞來(lái)源，開(kāi)創(chuàng)造血干細(xì)胞移植的全新研究領(lǐng)域，從而突破造血干細(xì)胞移植供體來(lái)源極為受限的臨床應(yīng)用瓶頸，使眾多白血病、重型再生障礙性貧血、惡性腫瘤等難治性疾病得到及時(shí)有效的治療，挽救患者生命，提高患者生存質(zhì)量，減輕社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)，具有重大的社會(huì)效益，其潛在的經(jīng)濟(jì)效益亦十分巨大。

圖1是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
圖中A為模擬的卵黃囊造血微環(huán)境，B為模擬的胎肝造血微環(huán)境，C為模擬的骨髓造血微環(huán)境。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
從小鼠的胚胎或人的流產(chǎn)胚胎中分離卵黃囊(胚齡小鼠8～11天/人4～6周)和胎肝(胚齡小鼠10～14天/人8～12周)組織，取成年小鼠雙側(cè)股骨或抽取成人骨髓組織，采用酶消化法或物理分離方法制備卵黃囊、胎肝和骨髓單細(xì)胞懸液，采用密度梯度離心分離方法分離單個(gè)核細(xì)胞用含15％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，3-5天換液一次，培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的基質(zhì)細(xì)胞用于制備滋養(yǎng)層和無(wú)血清條件培養(yǎng)液，同時(shí)對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的類(lèi)型及構(gòu)成比例進(jìn)行鑒定。
培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)的卵黃囊、胎肝和骨髓基質(zhì)細(xì)胞層經(jīng)γ射線照射(15Gy)滅活，用作支持ES來(lái)源造血細(xì)胞增殖和功能發(fā)育的滋養(yǎng)層，使用1周后需更換新制備的滋養(yǎng)層。
制備條件培養(yǎng)液前去除含血清的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞和培養(yǎng)瓶去除殘留血清，將培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)的卵黃囊、胎肝和骨髓基質(zhì)細(xì)胞層于置于無(wú)血清的培養(yǎng)基中在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)2天，收集上清液，離心、0.22μm濾膜過(guò)濾、制備無(wú)血清條件培養(yǎng)液。體外進(jìn)行三種基質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液的活性分析，確定用于程序誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的最適濃度，一般為10～30％。
取傳代培養(yǎng)的ES細(xì)胞采用懸浮培養(yǎng)法形成胚胎體(EB)，在胚胎體的培養(yǎng)體系中，順序應(yīng)用卵黃囊、胎肝和骨髓基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層(培養(yǎng)時(shí)間分別為3天、2天、2天)、聯(lián)合最適濃度的三種基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液及BMP-4、FL、TPO、SCF(20-100ng/ml)等造血生長(zhǎng)因子建立程序誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，動(dòng)態(tài)模擬胚胎造血發(fā)育微環(huán)境，于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行程序誘導(dǎo)培養(yǎng)，使ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化并促進(jìn)其造血功能發(fā)育完善，培養(yǎng)1周后，收集胚胎體經(jīng)0.25％胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)或免疫磁珠分離技術(shù)分選Sca-1+、CD34+、CD38-造血干細(xì)胞。
組織取材、進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，也可在卵黃囊、胎肝和成年骨髓組織中僅選擇其中的兩種進(jìn)行分離培養(yǎng)，例如卵黃囊和胎肝組織，或者卵黃囊和成年骨髓組織，或者胎肝和成年骨髓組織。
綜上所述，應(yīng)用程序誘導(dǎo)方法可以成功誘導(dǎo)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向分化，為造血干細(xì)胞移植提供充足的理想細(xì)胞來(lái)源，使眾多白血病、重型再生障礙性貧血和惡性腫瘤等難治性疾病得到及時(shí)有效的治療，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)向造血干細(xì)胞定向分化的程序誘導(dǎo)方法，包括組織取材、基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、無(wú)血清條件培養(yǎng)液收集、程序誘導(dǎo)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化、分選造血干細(xì)胞等步驟，其特征在于取ES細(xì)胞培養(yǎng)形成胚胎體，從卵黃囊、胎肝和成年骨髓組織中分離培養(yǎng)處于造血發(fā)育不同階段的造血基質(zhì)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的程序誘導(dǎo)方法，其特征在于基質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液的濃度為10～30％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的程序誘導(dǎo)方法，其特征在于取ES細(xì)胞培養(yǎng)形成胚胎體，從卵黃囊和胎肝組織中分離培養(yǎng)處于造血發(fā)育不同階段的造血基質(zhì)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的程序誘導(dǎo)方法，其特征在于取ES細(xì)胞培養(yǎng)形成胚胎體，從卵黃囊和成年骨髓組織中分離培養(yǎng)處于造血發(fā)育不同階段的造血基質(zhì)細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的程序誘導(dǎo)方法，其特征在于取ES細(xì)胞培養(yǎng)形成胚胎體，從胎肝和成年骨髓組織中分離培養(yǎng)處于造血發(fā)育不同階段的造血基質(zhì)細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的程序誘導(dǎo)方法，其特征在于卵黃囊胚齡小鼠8-11天或人4-6周，胎肝胚齡小鼠10-14天或人8-12周。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)向造血干細(xì)胞定向分化的程序誘導(dǎo)方法，它包括組織取材、基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、無(wú)血清條件培養(yǎng)液收集、程序誘導(dǎo)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化、分選造血干細(xì)胞等步驟，其特征在于取ES細(xì)胞培養(yǎng)形成胚胎體，從卵黃囊、胎肝和成年骨髓組織中分離培養(yǎng)處于造血發(fā)育不同階段的造血基質(zhì)細(xì)胞，形成亞融合狀態(tài)的細(xì)胞層。本發(fā)明可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量功能發(fā)育完善的造血干細(xì)胞，從而拓展造血干細(xì)胞移植的供體細(xì)胞來(lái)源，突破臨床應(yīng)用瓶頸，使眾多白血病、重型再生障礙性貧血、惡性腫瘤等患者受益，具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1673359SQ200510033710
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日
發(fā)明者那曉東, 李樹(shù)濃, 趙自平 申請(qǐng)人:中山大學(xué)