專利名稱：檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原發(fā)性高血壓相關(guān)性基因及其檢測(cè)方法和用途。更具體地說，本發(fā)明涉及與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的檢測(cè)方法及用途，例如在制備診斷原發(fā)性高血壓的試劑或判斷患原發(fā)性高血壓病相對(duì)危險(xiǎn)性的試劑中的用途。本發(fā)明還涉及檢測(cè)原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒。
背景技術(shù)：
組織激肽釋放酶基因英文名稱為kallikrein 1，renal/pancreas/salivary(縮寫KLK1)，其蛋白產(chǎn)物組織激肽釋放酶。KLK1基因1988年克隆定位于人染色體19q13.3，長(zhǎng)約5kb，包括5個(gè)外顯子。
激肽釋放酶是一組存在于不同組織和體液中的絲氨酸蛋白酶，包括血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶。組織激肽釋放酶廣泛存在于腎、胰腺、胃腸道粘膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等許多組織中，它以激肽釋放酶原的形式在組織中合成，再經(jīng)胰蛋白酶激活形成組織激肽釋放酶，并可釋放至血液循環(huán)。組織激肽釋放酶作用于激肽原，使之釋放生成活性產(chǎn)物胰激肽，并可進(jìn)入血漿，經(jīng)氨基肽酶水解生成緩激肽。具有血管活性的緩激肽與靶器官上特定受體結(jié)合能升高一氧化氮(NO)、前列環(huán)素、EDHF(內(nèi)皮衍生超極化因子)和tPA，產(chǎn)生擴(kuò)張血管、降低血壓、抗增殖、抗氧化應(yīng)激等一系列生物效應(yīng)。激肽的產(chǎn)生主要取決于激肽釋放酶的活性和數(shù)量。
緩激肽和胰激肽是體內(nèi)最強(qiáng)的血管舒張物質(zhì)之一。靜脈注射緩激肽可引起全身小動(dòng)脈舒張，顯著降低外周血管循環(huán)阻力，血管通透性增強(qiáng)，從而引起血壓下降。緩激肽還具有強(qiáng)大的利尿鈉效應(yīng)，可使腎臟血流量增多，腎小管周圍毛細(xì)血管壓增高，抑制腎小管再吸收，并通過刺激入球小動(dòng)脈壓力感受器及致密斑而產(chǎn)生利尿鈉作用。另一方面，緩激肽可抑制遠(yuǎn)端腎小管對(duì)鈉和水重吸收及抑制抗利尿激素的作用，從而促進(jìn)水鈉排泄。
在部分原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠，尿中激肽釋放酶的水平都顯著降低。流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，黑人尿中激肽釋放酶水平較白人低，黑人高血壓的發(fā)病率也較白人高。在原發(fā)性高血壓和腎性高血壓患者，血管對(duì)緩激肽的降壓反應(yīng)明顯增強(qiáng)，從而提示缺乏內(nèi)源性激肽。另有研究報(bào)道，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的抗高血壓作用，與體內(nèi)激肽水平增高有關(guān)。因?yàn)橥瑫r(shí)應(yīng)用激肽抗體，其降壓作用便明顯削弱。在低腎素型原發(fā)性高血壓應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑后，腎臟激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)活性增加，同時(shí)腎臟血流量增加，有報(bào)道認(rèn)為其降壓作用主要是由于增加了血漿激肽水平。因此，原發(fā)性高血壓可能與組織激肽釋放酶系統(tǒng)性低下有關(guān)。
分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，單核苷酸多態(tài)(single nucleotidepolymorphism，SNP)可以修飾單個(gè)基因的功能，導(dǎo)致確定的高血壓表型。由此推測(cè)，DNA上的堿基突變可能改變特定基因的表達(dá)或其編碼蛋白的功能。研究顯示，在自發(fā)性高血壓大鼠模型中，KLK1基因多態(tài)與血壓調(diào)節(jié)有關(guān)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過表達(dá)人類KLK1基因產(chǎn)生低血壓表型。后來，一項(xiàng)以57個(gè)猶他大家系為基礎(chǔ)的研究表明，一個(gè)顯性等位基因與尿中組織激肽釋放酶活性增高和高血壓發(fā)病危險(xiǎn)降低有關(guān)，提示影響尿激肽釋放酶分泌的一個(gè)主基因效應(yīng)可以解釋該性狀總變異的51％。1991年Berge和Berg報(bào)道了在挪威人群發(fā)現(xiàn)的TaqI限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)和Arg53His錯(cuò)義突變，但是未發(fā)現(xiàn)TaqI多態(tài)與血壓存在關(guān)聯(lián)。在HYPERGENE計(jì)劃中Slim等人對(duì)Arg53His多態(tài)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該多態(tài)雜合個(gè)體的尿組織激肽釋放酶活性顯著高于其他個(gè)體。Richards等和Song等在高加索人，非裔美國(guó)人和亞洲人共計(jì)108個(gè)對(duì)象中發(fā)現(xiàn)，KLK1基因5’區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前-121到-133位核苷酸之間存在一個(gè)多態(tài)區(qū)域，后來的研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)區(qū)域與高血壓有關(guān)。
rs5517位于KLK1基因第4外顯子，為A/G多態(tài)，可以導(dǎo)致第186個(gè)氨基酸賴氨酸(Lys，AAA)到谷氨酸(Glu，GAA)的改變。目前KLK1基因rs5517位點(diǎn)變異與原發(fā)性高血壓間的關(guān)系，以及該變異的檢測(cè)方法、試劑盒及其在預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和新藥開發(fā)中的應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)外尚沒有專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括檢測(cè)KLK1基因編碼序列的3812位(第4個(gè)外顯子的第60位堿基)的A/G多態(tài)性，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)率呈正相關(guān)，即等位基因A的分布頻率越高，患原發(fā)性高血壓的風(fēng)險(xiǎn)率越高。
本發(fā)明所述的多態(tài)性位點(diǎn)已被世界權(quán)威的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)-美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)收錄，為A/G的變異，可以導(dǎo)致第186個(gè)氨基酸賴氨酸(Lys，AAA)到谷氨酸(Glu，GAA)的改變。該多態(tài)位于KLK1基因的第4個(gè)外顯子，外顯子序列如下，其中斜體字標(biāo)出的第60位為rs5517(參看圖2)。此多態(tài)性位點(diǎn)在人類基因組上能被唯一確定，定位于基因編碼的3812位。本發(fā)明所述的多態(tài)基因及其編碼的蛋白分別參見序列表中的SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
多態(tài)性是指一個(gè)基因座位上存在多個(gè)等位基因。在某一個(gè)基因座位上，一個(gè)個(gè)體可以有兩個(gè)等位基因。流行病學(xué)研究表明，原發(fā)性高血壓與遺傳因素有關(guān)，父母為正常血壓者其子女患高血壓的概率明顯低于父母均有高血壓者的概率。發(fā)明人通過選擇吉林、北京、山東、陜西、貴州、福建，湖北，四川，廣西等共9個(gè)省市的2411名獨(dú)立的高血壓個(gè)體和按年齡、性別、居住地匹配2348名獨(dú)立的對(duì)照個(gè)體，取樣后進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，并進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，其中基因型為GG者，病例組和對(duì)照組各有808和859例，基因型為AG者，病例組和對(duì)照組分別有1114例和1094例，而基因型為AA者，病例組和對(duì)照組分別有451例和364例，病例組的A等位基因頻率為42.48％，對(duì)照組的A等位基因頻率為39.32％，P值為0.0019，具有顯著性差別。AA基因型者患高血壓的概率最高，在相對(duì)于A等位基因的隱性模型下，與G等位基因攜帶者(AG和GG基因型者)相比，AA基因型攜帶者患高血壓的危險(xiǎn)為1.26倍，表明了KLK1基因rs5517多態(tài)(A/G)與原發(fā)性高血壓相關(guān)。由此判斷，KLK1基因rs5517多態(tài)A等位基因攜帶者發(fā)生原發(fā)性高血壓的相對(duì)危險(xiǎn)性顯著升高，本發(fā)明的與原發(fā)性高血壓相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于高血壓的診斷、預(yù)防和治療具有重要的意義。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因和利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法鑒定KLK1基因rs5517多態(tài)基因型，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。
在本發(fā)明中使用的引物包括足夠長(zhǎng)度和適當(dāng)序列的寡核苷酸，用于為靶核苷酸合成提供特異開始。該引物可以包括例如15-30個(gè)核苷酸，并且與所要擴(kuò)增的核苷酸序列的每條鏈大致地互補(bǔ)，例如是5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’。
限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是用某一種限制性內(nèi)切酶切割來自不同個(gè)體的基因組DNA或某一個(gè)基因，由于多態(tài)基因型，而得到不同長(zhǎng)度和數(shù)目的DNA片段，通過檢測(cè)酶切后的DNA長(zhǎng)度和數(shù)目的不同來確定不同多態(tài)基因型。
在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因和采用直接測(cè)序法測(cè)定KLK1基因rs5517多態(tài)，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。
在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因和采用標(biāo)記的核酸探針測(cè)定KLK1基因rs5517多態(tài)基因型，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。
核酸探針可以用放射性同位素、酶、發(fā)光材料(例如熒光和磷光材料)標(biāo)記。用于標(biāo)記的這些放射性同位素、酶、發(fā)光材料等是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的，例如、但不限于32P，125I，14C，辣根過氧化物酶、熒光素等。核酸探針可以與多態(tài)基因位點(diǎn)為G的基因序列互補(bǔ)，也可以與多態(tài)基因位點(diǎn)為A的基因序列互補(bǔ)?；蛘撸梢酝瑫r(shí)存在與多態(tài)基因位點(diǎn)為G的基因序列互補(bǔ)和與多態(tài)基因位點(diǎn)為A的基因序列互補(bǔ)的兩種核酸探針。探針的長(zhǎng)度例如可以是10-50個(gè)或更多堿基，或15-30個(gè)堿基。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，探針可以是與圖2的核酸序列互補(bǔ)的核酸片段。
除了以上方法以外，還可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)的方法。
本發(fā)明還提供了可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，該試劑盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法的內(nèi)切酶，例如Taq I內(nèi)切酶。
另外，本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，該試劑盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于檢測(cè)基因多態(tài)位點(diǎn)的標(biāo)記核酸探針。
另外，本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，該試劑盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于檢測(cè)基因多態(tài)位點(diǎn)的測(cè)序試劑盒。
例如，根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，試劑盒含有用于PCR的以下試劑引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶 0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板 1.0μl(10ng/μl)；另外含有用于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法的下列試劑Taq I buffer 1.5μl(10X)；和Taq I 0.1μl(10u/μl)。
本發(fā)明的用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒的使用方法包括下列步驟A、從活體獲取生物樣本，通過上述PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；B、純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶內(nèi)切PCR反應(yīng)產(chǎn)物；C、電泳鑒定酶切DNA片段。
本發(fā)明所提出的KLK1基因rs5517多態(tài)可在人體樣本比如血液、活組織中檢出。本發(fā)明的方法可用來在人群中進(jìn)行篩查，從而可以根據(jù)個(gè)體的KLK1基因rs5517多態(tài)基因型來判斷患原發(fā)性高血壓的風(fēng)險(xiǎn)率。同時(shí)，還可以采用該方法早期診斷遺傳性高血壓。通過檢測(cè)該基因多態(tài)，對(duì)于高血壓高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，可以及早采取預(yù)防措施，防止高血壓的發(fā)生。
原發(fā)性高血壓是一種一旦患病需終生服藥的頑固性疾病，目前尚無徹底的治療手段。高血壓是最常見的心血管疾病，不僅患病率高，而且可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是一種對(duì)人類健康危害極大的疾病。本發(fā)明的原發(fā)性高血壓基因多態(tài)位點(diǎn)的提出，為徹底治療原發(fā)性高血壓提供了一種新的途徑。通過矯正多態(tài)基因缺陷，或者通過減少或消除缺陷KLK1基因產(chǎn)物，有可能達(dá)到預(yù)防或治療高血壓的目的。因此，本發(fā)明的與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的提出為開發(fā)原發(fā)性高血壓基因治療藥物及基因治療方法提供了可能。而且，本發(fā)明的基因多態(tài)位點(diǎn)的提出，為原發(fā)性高血壓的病因提出了新的觀點(diǎn)，深化了對(duì)原發(fā)性高血壓疾病的認(rèn)識(shí)。


圖1示出了KLK1基因的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2示出了KLK1基因的第4個(gè)外顯子的基因序列，該多態(tài)位于KLK1基因的第4個(gè)外顯子，其中斜體字標(biāo)出的第60位為rs5517，為A/G的變異。
圖3示出了基因型電泳示意圖，右側(cè)條帶為Marker，即標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜。當(dāng)rs5517多態(tài)出現(xiàn)A等位基因時(shí)，電泳為194bp的條帶，出現(xiàn)G等位基因時(shí)，電泳為174bp和20bp的兩條帶。
具體實(shí)施例方式
1、檢測(cè)rs5517多態(tài)的試驗(yàn)樣本和方法通過PCR與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)rs5517多態(tài)。
1.1試驗(yàn)樣本的獲得所有的DNA樣本和臨床數(shù)據(jù)均來自亞洲國(guó)際心血管病協(xié)作研究(the International Collaborative Study of Cardiovascular Disease in Asia，InterASIA)。本計(jì)劃通過了當(dāng)?shù)氐膫惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)，并且每一位參與者都自愿簽署了知情同意書。共有15,838名有代表性的35到74歲的志愿者參加了此計(jì)劃，我們從中選擇了吉林、北京、山東、陜西、貴州、福建，湖北，四川，廣西等共9個(gè)省市的2411名獨(dú)立的高血壓個(gè)體和按性別、年齡、居住地匹配2348名獨(dú)立的對(duì)照個(gè)體。參加者均詳細(xì)填寫調(diào)查表，包括疾病個(gè)人史、家族史、吸煙與飲酒史和藥物使用情況，并測(cè)量身高、體重、腰圍及臀圍以及血漿脂質(zhì)等各項(xiàng)生化指標(biāo)。每位志愿者的血壓都由訓(xùn)練有素和通過認(rèn)證的調(diào)查人員測(cè)量三次。所有研究對(duì)象均為漢族且無血緣關(guān)系。本次研究所選擇的高血壓的定義為收縮壓≥150mmHg和或舒張壓≥95mmHg；服用降壓藥但是收縮壓＜150mmHg，舒張壓＜95mmHg?；加欣^發(fā)性型高血壓、冠心病和糖尿病的個(gè)體不在調(diào)查范圍之內(nèi)。
1.2rs5517多態(tài)擴(kuò)增片段的獲得通過設(shè)計(jì)的錯(cuò)配引物，使用ABI公司的9700PCR儀和大連寶生物工程有限公司Taq酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得rs5517多態(tài)擴(kuò)增片段(194bp)。擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件見表1和表2。
表1 rs5517多態(tài)的擴(kuò)增引物

表2 rs5517多態(tài)PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件

1.3限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法鑒定rs5517多態(tài)基因型含有rs5517多態(tài)的DNA片段擴(kuò)增成功后，用限制性內(nèi)切酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，從凝膠電泳圖譜即可分辨出此位點(diǎn)的基因型。
用大連寶生物工程有限公司的Taq I內(nèi)切酶使194bp的擴(kuò)增產(chǎn)物在65℃酶切10h。酶切體系見表3。
表3 rs5517多態(tài)酶切體系和酶切條件

1.4瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切產(chǎn)物在溴乙錠染色的濃度為3％的瓊脂糖凝膠中電泳酶切產(chǎn)物，電壓250伏，電泳時(shí)間為50分鐘。當(dāng)rs5517多態(tài)出現(xiàn)A等位基因時(shí)，電泳為194bp的條帶，出現(xiàn)G等位基因時(shí)，電泳為174bp和20bp的兩條帶。圖3示出了基因型電泳示意圖，右側(cè)條帶為Marker，即標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜。
2rs5517多態(tài)與人類原發(fā)性高血壓的相關(guān)性2.1病例對(duì)照樣本臨床特征描述病例組和對(duì)照組的性別，年齡，吸煙率和飲酒率均無顯著性差異。與對(duì)照組相比較，病例組的體重指數(shù)(BMI)，總膽固醇(CHO)，甘油三酯(TG)，血糖(Glu)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL_C)，肌酐水平(Cr)較高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL_C)水平較低，均具有顯著性差異。見表4。
表4 病例對(duì)照樣本臨床特征描述

數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差2.2rs5517多態(tài)在病例對(duì)照樣本中的頻率分布rs5517多態(tài)三種基因型在病例和對(duì)照中分布的差異具有顯著性。A等位基因在病例中的頻率明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性。見表5。
表5 rs5517多態(tài)在病例對(duì)照樣本中的頻率分布

2.3rs5517多態(tài)與高血壓的相對(duì)危險(xiǎn)性在相對(duì)于A等位基因的隱性遺傳模型(即合并GG和AG兩種基因型)下，AA基因型個(gè)體發(fā)生原發(fā)性高血壓的危險(xiǎn)比G等位基因攜帶者顯著升高。進(jìn)行多變量非條件Logistic回歸分析，調(diào)整年齡，性別，吸煙，飲酒，BMI，TG，CHO，Glu，Cr，HDL_C等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，rs5517隱性遺傳模型仍然與高血壓的發(fā)生保持顯著關(guān)聯(lián)。與G等位基因攜帶者相比，AA基因型攜帶者發(fā)生高血壓的風(fēng)險(xiǎn)增加了25％，見表6。
表6 rs5517多態(tài)相對(duì)于原發(fā)性高血壓的相對(duì)危險(xiǎn)性

#為調(diào)整傳統(tǒng)的環(huán)境危險(xiǎn)因素后
3用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒3.1引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶 0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板1.0μl(10ng/μl)；3.2另外含有用于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法的下列試劑Taq I buffer 1.5μl(10X)；和Taq I 0.1μl(10u/μl)。
3.3操作步驟3.3.1從活體獲取生物樣本，通過上述PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3.3.2純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
3.3.3電泳鑒定酶切DNA片段。
4用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒該試劑盒包括引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，
5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶 0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板 1.0μl(10ng/μl)；操作步驟A、從活體獲取生物樣本，通過上述PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
B、純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序。
SEQUENCE LISTING<110>北京諾賽基因組研究中心有限公司<120>檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4640<212>DNA<213>人<400>1agttcctcca cctgctggcc cctggacacc tctgtcacca tgtggttcct ggttctgtgc 60ctcgccctgt ccctgggggg gactggtgag acagtggggg gatgtgggag ggggaacggg 120ccctgattct cttgctggcc tcacatcccc ccccgataag accttcccct ccaacacccc 180accctcatcc ctctggccca cagtctatcc tagtccgggg tgccccggct cttatctatc 240ttgcgcggcc ccaccctaaa cttccacccc cgctcctcca tgttgtcata gtgctcactc 300ccacaccaga ttcctgctcc tcccaggaag cctcagtact ttctcctctt ccctagccaa 360cgccctgtcc caccgcttta ccaaaggggc agattctggg ccatctctgt ctctctctgg 420aggaccccaa ccctcccatg ggcttccccc accccacagg actctgatca tcccctcctg 480ccccctagtt ccctgcggcc acctatttgg ctcctgagtc tacaaatccc accacactcc 540agtgactttt tccatccagc tgtccgctct caactgtgtc ctccagaccc tgacatctgg 600tctccccagt ccttccaggg tcccccaaat ttcaccagaa aaccctgctt cccaaactgg 660catgtgggat cccccatctg gtatgggggg gggtctgcaa atgtcccttc ccacccagca 720cccccagctc tcccaggaaa aacaccacac cctcccacca catgctcctt tccttgggga 780agttccatcc cgccccaggc cccagccctt ctctgcctga attgttccta cacagctctg 840gttttctgga accccacccc aaggatcctg aatgccttct cagccagcgc ttctgccctg 900gcctccccca agtcagtatg tgattctaca acctcacgtc aagtgggtcc tgcattgcat 960tcccacagct gcttggcgcc tgttctcacc acttctccaa tcctcttcct aggattgcct 1020ccaagaggac cccatatcct tccagtaccc tcagaccatg aaccccatcc ccatgagaaa 1080cgaagatccc atccttcacc ctgtccgaga aggactgcca ctcacgcctc cctcctcctg 1140agccccgtcc cagtcctgac cgcaactgtg ttctcagggc cccaacctcc cctcagattg 1200ccattcctgg ttcacaggaa ggaccccaaa acctctcgga agcccacctc tagccttaac 1260catagccctt tcttttaccc tttaaccagg aagccctgaa atctaactgt cccagccaag 1320ctggcccctt ccaaccccaa tgtagggacc ccaagtcacc cccaaactct tcagtccaga 1380tgctcttctt tacctctcag acctggttcc ctaaagctgc atcctttcct gaacctcaaa 1440agcccaaccc aggtcctgtt tccctagcct aggagcccct tagccctcca gattcttcct 1500cagtgagcct ctgatcctgt cccacccttg gcgccttgat ccctggtttc cagaatccct 1560ttccactccc ctaacccacc acctcccatc ccccagcccc agaccccaaa tgacctgacg 1620cccagatgca gtgtctgctc cagacactgt ctcctgtctc ctaccctgat ccctggaggc 1680tgctctactg tcagagcaca aaatctcccc accaggtcca gccaccactc caaaagccca 1740
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Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr130 135 140Glu Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser145 150 155 160Ile Glu Pro Glu Asn Phe Ser Phe Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp165 170 175Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys180 185 190Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp195 200 205Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu210 215 220Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys225 230 235 240Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp245 250 255Thr Ile Ala Glu Asn Ser260<210>4<211>262<212>PRT<213>人<400>4Met Trp Phe Leu Val Leu Cys Leu Ala Leu Ser Leu Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Ala Ala Pro Pro Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu20 25 30Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe35 40 45Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala50 55 60His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu65 70 75 80Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln Phe Val His ValSer Glu Ser Phe85 90 95Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln100 105 110Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu115 120 125
Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr130 135 140Glu Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser145 150 155 160Ile Glu Pro Glu Asn Phe Ser Phe Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp165 170 175Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu Cys Glu Lys Ala His Val Gln Lys180 185 190Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp195 200 205Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu210 215 220Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys225 230 235 240Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp245 250 255Thr Ile Ala Glu Asn Ser260
權(quán)利要求
1.檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括檢測(cè)KLK1基因編碼序列的3812位的A/G多態(tài)性，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)率呈正相關(guān)。
2.檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因和利用限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性方法鑒定KLK1基因rs5517多態(tài)多態(tài)基因型，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，其中所述引物是5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’。
4.檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因和采用直接測(cè)序法測(cè)定KLK1基因rs5517多態(tài)，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。
5.檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)基因和采用標(biāo)記的核酸探針測(cè)定KLK1基因rs5517多態(tài)基因型，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。
6.可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，該試劑盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法的內(nèi)切酶，例如Taq I內(nèi)切酶。
7.可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，該試劑盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于檢測(cè)基因多態(tài)位點(diǎn)的標(biāo)記核酸探針。
8.可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，該試劑盒主要包括用于PCR的dNTP，引物，Taq酶，DNA模板，以及用于檢測(cè)基因多態(tài)位點(diǎn)的測(cè)序試劑盒。
9.可用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒，試劑盒含有用于PCR的以下試劑引物5’CAGTGAAGCAGATGCCTGGT 3’，5’TCCTGCCTAATGATGAGTTC 3’各0.2μl(5μM)，dNTP MIX 0.4μl(10mM)，Taq酶0.1μl(5u/μl)，PCR buffer 1.0μl(10X)，DNA模板1.0μl(10ng/μl)；另外含有用于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法的下列試劑Taq I buffer 1.5μl(10X)；和Taq I 0.1μl(10u/μl)。
10.用于檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒的使用方法包括下列步驟A、從活體獲取生物樣本，通過上述PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；B、純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶內(nèi)切PCR反應(yīng)產(chǎn)物；C、電泳鑒定酶切DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)與原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的方法，該方法包括檢測(cè)KLK1基因編碼序列的3812位的A/G多態(tài)性，其中A等位基因的分布頻率與原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)率呈正相關(guān)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)原發(fā)性高血壓相關(guān)的KLK1基因rs5517多態(tài)的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101033487SQ200610056749
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月7日
發(fā)明者顧東風(fēng), 趙維艷, 王來元, 李宏帆, 王亞平, 陳恕鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院, 北京諾賽基因組研究中心有限公司