專利名稱：新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是由某種原因引起的胰島功能減退或衰竭胰島素分泌減少或缺乏，引起機體糖代謝紊亂及其后期全身血管病變，產(chǎn)生多器官損害，嚴(yán)重威脅患者生命，內(nèi)科藥物治療不能避免其產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。全球糖尿病患者目前已超過2億，預(yù)計2020年將高達3.5億，糖尿病從2004年起成為中國的第一大常見病，現(xiàn)有患者500余萬。其中I型糖尿病患者終生需要依賴胰島素治療，給患者生活帶來極大的不便，大約10％的糖尿病患者為I型糖尿病。約30％的II型糖尿病患者至中、晚期(病程20年以上)也會發(fā)展成為胰島素依賴型。這兩種病人都需要進行胰島細胞移植手術(shù)治療，因此，可以說中國共約有2000萬糖尿病人需要做移植手術(shù)。
雖然胰島細胞移植技術(shù)的近期發(fā)展已經(jīng)可以使4/5接受了移植的I型糖尿病患者不再需要每天注射胰島素，但問題的關(guān)鍵卻轉(zhuǎn)移到如何才能找到足夠的胰島細胞供體。
為了解決供體問題，國際上早就開始了異種胰島移植的研究，這種移植可以徹底解決供體不足的矛盾，特別是豬胰島素，具有與人胰島素相同的生理功能，結(jié)構(gòu)上僅一個氨基酸的差別。相對人與人之間的移植，用豬胰島救人的手術(shù)更簡便、快捷、微創(chuàng)、安全，不受血型限制。豬胰島作為異種胰島組織供體來源日益受到重視，實驗研究已證明，豬胰島不僅能逆轉(zhuǎn)糖尿病動物的高血糖狀態(tài)，而且能防止糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。目前豬胰島移植的臨床應(yīng)用研究已成為移植界的一個研究熱點，但由于成年豬胰島的分離純化比較復(fù)雜，比其他動物困難，至今未能確立能夠穩(wěn)定地獲得大量胰島細胞的分離方法。
相對來說，新生豬或胎兒豬來源廣、價格低，，其胰島的分離純化更簡易，更適用于作為異種胰島細胞移植手術(shù)的供體。特別是胎豬和新生豬胰島細胞經(jīng)短期體外培養(yǎng)以后，抗原性很弱，是胰島移植最有前途的供體來源。其意義不僅可解決供體短缺的問題，Mandel等[Mandel TE，Watt PC，Mullen Y，et al.Islet grafts in NOD micea comparison of aso，allo，and pig Xenotransplantation.Transplant Proc，1989，213813-3817.]認(rèn)為在I型糖尿病中移植豬胰島細胞可能將避免移植人胰島而招致的自身免疫攻擊。
由于豬的胰島細胞分化和發(fā)育成熟需到胚胎后期，甚至出生數(shù)月后才得以完成[Korsgen O，Sandler S，Landatron AS，et al.Large-caleproduction of fetal porcine pancreatic islet-like cell clusters[J].Transplant，1988，45509-511.]，故不宜采用常規(guī)膠原酶消化分離小白鼠胰島的方法來獲得新生豬胰島。且消化后組織塊較大，組織塊中央易產(chǎn)生中心性壞死。
胰島細胞的獲得，以往采用密度梯度分離法，該法雖可得到高純度胰島細胞，但胰島收獲量僅約30％[于德民，吳銳，尹濰，等成年豬胰島分離和純化的實驗研究[J].中華器官器植雜志，1995，16146-1481]，臨床上難以達到數(shù)量上的要求。為此，我們采用一種改良的膠原灌注-不連續(xù)密度梯度純化法及培養(yǎng)的技術(shù)成功地分離了純化的新生豬胰島細胞團，在數(shù)量上和純度上都達到了臨床要求，可供胰島細胞分化與發(fā)育以及異種移植治療糖尿病研究之用。
成年豬胰島細胞分化成熟，移植量效比高，但分離胰島產(chǎn)量低。胚胎豬胰島細胞分化不成熟，移植量效比低。而新生豬胰島細胞能通過體外短期培養(yǎng)分化發(fā)育成熟，發(fā)揮其生理功能[Rayat GR，Rajotte RV，KorbuttGS.Potential application of neonatal porcine islets as treatmentfor type 1 diabetes[J].Ann NY Acad Sci 1999，875175-1881]。
由于新生豬胰島細胞大部分是散在的，不成胰島，因而很難分離胰島，只能在培養(yǎng)過程中加以純化；即抑制成纖維細胞生長，將退變的外分泌腺泡細胞、血管內(nèi)皮細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞通過更換培養(yǎng)液去除掉，而保留上皮樣細胞[張偉杰，姜漢英，陳金枝，等.豬胰島移植物的大量制備[J].中華器官移植雜志，1993，14151-153.]。
國外有采用1周齡新生豬，我們認(rèn)為，新生豬日齡不可超過1周，宜出生后3～5天內(nèi)者為最佳，日齡越長，則會影響膠原酶消化及胰島產(chǎn)量[劉紀(jì)寧，祝希媛，吳立，等1新生豬胰島細胞團的生成和異種移植[J].中華器官移植雜志，1992，13124-1261]。本發(fā)明所采用豬來源，皆為中國原產(chǎn)豬，價格便宜，供體數(shù)量不受限制，非常便于產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新生豬胰島細胞的分離、純化和培養(yǎng)方法，它可以獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)和分泌功能正常的胰島細胞團，符合臨床應(yīng)用所需的數(shù)量和純度的胰島細胞。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明新生豬胰島細胞的分離、純化和培養(yǎng)方法，依次包括如下步驟1)分離豬胰島細胞，從生長2～5天的新生豬體內(nèi)無菌剖腹取出胰腺，去除胰腺周邊組織，注入消化液，其消化溫度是37～39℃，消化液PH值是6.0～8.0，加入含有效量小牛血清的冷Hank’s液終止消化；2)純化步驟1)得到的豬胰島細胞，配置比重液，于0.5～1.0ml的消化清液中，加入0.3～1.0ml的含有效量小牛血清的冷Hank’s液，再依次取10～15ml的比重液注入，搖蕩混勻，靜置3～5min，低速離心沉淀細胞；3)將步驟2)得到的豬胰島細胞加培養(yǎng)基進行7～10天的細胞培養(yǎng)；4)形成豬胰島細胞團。
本發(fā)明使用新生豬，相對成年豬來說，新生豬或胎兒豬胰島的分離純化更簡易，更適用于作為異種胰島細胞移植手術(shù)的供體。特別是本發(fā)明的新生豬胰島細胞經(jīng)短期體外培養(yǎng)以后，抗原性很弱，成為胰島移植最有前途的供體來源，可解決供體短缺的問題。本發(fā)明越過了成年豬胰島技術(shù)障礙，解決了胰島移植的供體嚴(yán)重匱乏問題，使得豬供體產(chǎn)業(yè)化成為可能，進而為異種胰島細胞移植治療技術(shù)的全面推廣，造福廣大糖尿病患者打下雄厚的基礎(chǔ)。
本發(fā)明采用了一種改良的膠原灌注-不連續(xù)密度梯度純化法及組織培養(yǎng)的技術(shù)，成功地分離純化了新生豬胰島細胞團，解決了收獲量不足的問題，而在體外培養(yǎng)獲得了大量胰島細胞株。在體外培養(yǎng)條件下，樹突細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞和其他血液細胞由于不附壁生長，懸浮在培養(yǎng)液中，通過更換培養(yǎng)液很容易去除了這些細胞，并使純化后胰島細胞抗原性變?nèi)?，使之更適宜于異種胰島細胞移植手術(shù)。
本發(fā)明在數(shù)量上和純度上都達到了異種胰島細胞移植臨床要求，并可供胰島細胞分化與發(fā)育以及異種移植治療糖尿病的研究之用。


下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明做進一步詳細的說明附圖是新生豬胰島細胞的分離、純化和培養(yǎng)方法流程圖。
具體實施例方式
實驗例豬胰島細胞的制備方法包括分離、純化和培養(yǎng)等過程。
分離出生2～5天的新生豬用氯胺酮(17mg/kg)麻醉后，于無菌狀態(tài)下剖腹取出胰腺，用含抗生素的D-Hank’s液清洗3次去除血液，并迅速仔細去除胰腺周邊脂肪、血管和胰腺被膜，用冷的Euro～collins液沖洗3次后，稱重。將22號塑料插管插入主胰導(dǎo)管，置入錐形瓶中。根據(jù)稱重配成一定比例體積的膠原酶溶液(濃度為1.8mg/m L)，通過導(dǎo)管倒入胰腺組織內(nèi)，置于37～39℃恒溫水浴中輕輕振蕩消化20～30min，使消化液pH值保持在6.0～8.0之間。當(dāng)胰腺組織直觀上變松散時，加入含有效量小牛血清的冷Hank’s液終止消化，輕輕振蕩15s，用600μm的濾網(wǎng)回收組織。過濾出的殘余組織繼續(xù)消化，重復(fù)4～5次，至組織塊完全消化，僅剩下少量白色條索狀纖維組織，取清液移入50ml離心管中準(zhǔn)備離心分離。
純化先將Euro～collins液及Fico II 1400配制成比重為1.090、1.074、1.054g/cm3的比重液。移取約0.5～1ml的消化清液至50ml離心管中，加入0.3～1ml的含有小牛血清的冷Hank’s液，再依次取10～15ml的比重液注入，搖蕩混勻，靜置3～5min，在4℃下，低速(800r/min)離心20min，離心后收集1.090～1.054g/cm3之間的胰島沉淀細胞待培養(yǎng)。
培養(yǎng)將分離得到的細胞加入含20％小牛血清、青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，谷氨酰胺100mg/L增補的RPMI1640液培養(yǎng)。一般一個新生豬胰腺消化后的細胞分在5～7個T75瓶中，而每個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基含量不少于10～18ml。置于5％CO2、95％空氣、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；次日更換培養(yǎng)基，以后隔日換一次培養(yǎng)基，去除殘留的樹突樣細胞、血管內(nèi)皮細胞和過路淋巴細胞。
由于胰島細胞24～36h，成纖維細胞16～18h均已貼壁，選擇次日更換培養(yǎng)基可以去除絕大部分成纖維細胞，48h后待上皮樣細胞緊密貼壁后，換液時用D-Hank’s液輕輕沖洗即可完全去除血細胞。培養(yǎng)7d后，即可獲得純度達90％的胰島細胞。
第7天收集胰島細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，倒置顯微鏡下，胰島細胞呈橘黃色半透明類圓形細胞，胞漿豐富，邊緣清晰，有的細胞團邊緣有一紫色弧形反光帶。細胞團大都松散貼壁，少數(shù)懸浮于培養(yǎng)基中，部分細胞團周圍有少量纖維細胞爬行。
培養(yǎng)4～5天細胞生長活動最旺盛，以后2～3天則未見更多細胞團生長，培養(yǎng)7天后培養(yǎng)基中已很難見到抗原性強、與排斥反應(yīng)有密切關(guān)系的淋巴細胞、樹突狀細胞或血管內(nèi)皮細胞。隨培養(yǎng)時間的延長培養(yǎng)液中胰島素含量呈逐漸下降趨勢，但培養(yǎng)7天后的胰島細胞團對高糖和高糖+茶堿刺激卻表現(xiàn)出明顯的分泌反應(yīng)，其原因可能為隨培養(yǎng)的時間延長，胰島細胞死亡裂解減少，釋放胰島素減少而新生胰島細胞分泌尚不旺盛，但新生豬胰島細胞對糖刺激的分泌反應(yīng)說明了B細胞能短時期分化、發(fā)育成熟并發(fā)揮生理功能。
每次處理4只新生豬胰腺，每只新生豬胰島細胞團收獲量是6～8×105個，純度是90％。
本發(fā)明作為供體的新生豬來源廣、價格低，且采用改良的膠原灌注-不連續(xù)密度梯度純化法和組織培養(yǎng)方法，可以獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)和分泌功能正常的胰島細胞團，符合臨床應(yīng)用所需的數(shù)量和純度的胰島細胞?？蔀楫惙N移植治療糖尿病提供一個方便的供體來源，胰島細胞還可供胰島細胞分化與發(fā)育以及異種移植治療糖尿病研究之用。
本發(fā)明可以獲得高純度的胰島，且不容易破壞豬胰島。在體外培養(yǎng)條件下，樹突細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞和其他血液細胞由于不附壁生長，懸浮在培養(yǎng)液中，通過更換培養(yǎng)液很容易去除這些細胞，并使純化后胰島細胞抗原性變?nèi)?，更適宜于異種胰島細胞移植手術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法，依次包括如下步驟1)分離豬胰島細胞，從生長2～5天的新生豬體內(nèi)無菌剖腹取出胰腺，去除胰腺周邊組織，注入消化液，其消化溫度是37～39℃，消化液PH值是6.0～8.0，加入含有效量小牛血清的冷Hank’s液終止消化；2)純化步驟1)得到的豬胰島細胞，配置比重液，于0.5～1.0ml的消化清液中，加入0.3～1.0ml的含有效量小牛血清的冷Hank’s液，再依次取10～15ml的比重液注入，搖蕩混勻，靜置3～5min，低速離心沉淀細胞；3)將步驟2)得到的豬胰島細胞加培養(yǎng)基進行7～10天的細胞培養(yǎng)；4)形成豬胰島細胞團。
2.如權(quán)利要求1所述的新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟2)中，所述的比重液是比重在1.090～1.054g/cm3之間的Euro～collins及Fico II1400。
3.如權(quán)利要求1所述的新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟3)中，所述的培養(yǎng)基是含20％小牛血清、青霉素100U/ml，鏈霉素100u/ml，谷氨酰胺100mg/l增補的RMI1640液。
4.如權(quán)利要求1所述的新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟3)中，一個新生豬胰腺組織分別置入5～7個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求1所述的新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法，其特征在于在步驟3)中，隔日換培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新生豬胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)方法，其方法是從生長2～5天的新生豬供體中無菌剖腹取出胰腺，去除胰腺周邊組織，注入消化液，其消化溫度是37～39℃，消化pH值是6.0～8.0，其終止消化溶液包括小牛血清和Hank’s液；接著進行豬胰島細胞的純化和7～10天的細胞培養(yǎng)。通過本發(fā)明可獲得供胰島細胞分化與發(fā)育以及異種移植治療糖尿病研究的豬胰島供體，可達到通過異種胰島細胞移植治療糖尿病的目的，并為豬胰島供體的產(chǎn)業(yè)化及異種胰島細胞移植治療技術(shù)的推廣打下了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/06GK101033460SQ200710036638
公開日2007年9月12日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者牛申 申請人:牛申