專利名稱：：一種鴨瘟疫苗及其專用毒株的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種鴨瘟疫苗及其專用毒株。
背景技術：
：鴨瘟(DuckPlague)又名鴨病毒性腸炎，是危害鴨、鵝及其他雁形目禽類的一種急性、接觸性、敗血性傳染病，以血管損傷、消化道出血性壞死、淋巴器官受損和實質(zhì)性器官退行性變化為主要特征。任何品種、年齡和性別的鴨都能感染，但成年鴨的發(fā)病率高于幼鴨，其中以產(chǎn)蛋母鴨的死亡率最高(殷震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京科學出版社，1997:1073-1077)。該病由Baudet(BaudetAERF.mortalityinducksintheNetherlandscausedbyafilterablevirus.Fowlplague[J].TijdschrDiergeneeskd，1923,50:455-459.)首次報道于荷蘭，黃引賢等(黃永賢，歐守抒.擬鴨瘟的研究[J].華南農(nóng)學院學報，1959，1(1):67-78)于1959年在我國首次發(fā)現(xiàn)該病的存在，目前已成為嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。該病的病原是鴨瘟病毒(DuckPlagueVirus,DPV)或稱鴨腸炎病毒(DuckEnteritisVirus,DEV)，鴨皰疹病毒I型(DuckHerpesvirusType1)，屬皰疹病毒科，未分屬。據(jù)有關資料報道(殷震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京科學出版社，1997:1073-1077)，世界各地分離的鴨瘟病毒株，在抗原性上是一致的，即具有共同的免疫原性，均能產(chǎn)生交互免疫。自20世紀60年代以來，鴨瘟病毒雞胚化弱毒疫苗在全世界得到廣泛應用。我國也使用鴨瘟雞胚或雞胚成纖維細胞弱毒疫苗預防鴨瘟(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].二OO五年版.三部.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，.2006.)，且證明是有效的。滅活疫苗安全性好，不需低溫保存運輸，因而更能夠保證疫苗的使用效果?，F(xiàn)有的鴨瘟弱毒活疫苗，在使用過程中，由于保藏運輸不當，存在免疫失敗的可能性(楊待建等.免疫接種失敗與鴨瘟的發(fā)生[J].中國家禽，1998，20(11):20-21)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鴨瘟疫苗及其專用毒株。本發(fā)明所提供的鴨瘟病毒是鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應病毒。本發(fā)明的鴨瘟病毒具體可為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳二至七代得到的鴨胚適應病毒，優(yōu)選為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳二至四代得到的鴨胚適應病毒。其中，鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳三代得到的鴨胚適應毒一鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株已于2007年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)(地址是中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏登記號為CGMCCNo.2268。本發(fā)明的鴨瘟病毒可用于制備鴨瘟滅活疫苗。本發(fā)明所提供的鴨瘟疫苗，它的活性成分是滅活的鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應病毒。所述疫苗中還含有動物疫苗佐劑。所述佐劑可為注射用白油、司本-80、硬脂酸鋁和吐溫-80。所述鴨瘟疫苗中，所述活性成分是用94-96容量份的病毒液滅活得到的，所述病毒液為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應病毒接種易感鴨胚后得到的胚液；所述病毒液中鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應病毒的含量為10"—1055ELD5。/0.2ml(滅活前)；所述疫苗中含有注射用白油138-288容量份，司本-805-24容量份，硬脂酸鋁l.5-6重量份，吐溫-804-8容量份；所述容量份重量份二ml:g。，所述鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株可經(jīng)鴨胚傳二至七代，優(yōu)選為經(jīng)鴨胚傳二至四代。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備鴨瘟疫苗的方法。本發(fā)明所提供的制備鴨瘟疫苗的方法，是將下述油相和水相按照(1-3):1的容量比混合制成乳劑；所述水相可按照如下方法制備將94-98容量份的病毒液滅活后，加入無菌吐溫-802-6容量份，混勻得到水相；所述病毒液為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應病毒接種易感鴨胚后得到的胚液；所述病毒液中鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應病毒的含量為1045—1055ELD5。/0.2ml(滅活前);所述油相可按照如下方法制備按注射用白油92-96容量份、司本-804-8容量份和硬脂酸鋁1-2重量份的比例配制油相；所述容量份重量份二ml:g。該方法中，所述鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)鴨胚傳二至七代，優(yōu)選為經(jīng)鴨胚傳二至四代。實驗證明，用鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚適應毒制備的鴨瘟疫苗不引起產(chǎn)蛋鴨的全身不良反應和明顯的局部反應。疫苗在不同品種、年齡(4日齡12月齡)的鴨上，使用不同的免疫途徑，均能誘導產(chǎn)生80%以上保護。疫苗一次免疫鴨后，不同時間誘導產(chǎn)生的中和抗體滴度(GMT)分別是，7天為3.2、10天為4.6、14天為8，21天、30天和60天均為7;免后10天可以產(chǎn)生80%攻毒保護，14天和21天可產(chǎn)生完全保護。疫苗免疫鴨后，盡管誘導產(chǎn)生的中和抗體效價較低，但能夠有效地抵抗強毒的攻擊。本發(fā)明的鴨瘟疫苗使用滅活病毒制成，安全性好；保存、運輸(2-8°C)和使用方便，免疫效果穩(wěn)定。具體實施例方式實施例1、利用鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株的鴨胚適應毒制備鴨瘟疫苗一、鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株的生產(chǎn)用種毒種子批的建立通過鴨胚傳代，建立了鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株的鴨胚適應毒。通過對3株DPV的免疫原性、毒力等特性的比較，選擇鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株DE2代鴨胚毒作為制苗用種毒，鴨瘟病毒NJ株Ds代鴨肝組織毒作為檢驗用強毒。使用鴨胚對AV1221株DE2毒進行了連續(xù)6次傳代。對DE2代DE7代凍干種毒的鑒定結果表明未發(fā)現(xiàn)細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染；病毒含量為每0.2mL含1043810525ELD5。；能夠被DPV抗血清中和；制成滅活疫苗，免疫成鴨后均能夠產(chǎn)生完全保護。依據(jù)試驗結果，建立了生產(chǎn)用種毒的種子批。下述實驗所用的實驗材料如下A、病毒鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株，鴨肝組織毒，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;鴨瘟病毒NJ株(DPVNJ株)(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)鴨肝組織毒。B、抗血清DPV抗血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。按照現(xiàn)行的《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].二OO五年版.三部.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.)規(guī)定的中和抗體測定方法進行效價測定，結果表明中和抗體效價為1:16。C、雞胚9-IO日齡SPF雞胚，由北京梅里亞維通實驗動物有限公司提供。用于外源病毒污染檢驗。D、鴨胚11-12日齡易感鴨胚，來自無禽流感和鴨瘟流行，未注射過鴨瘟疫苗的種鴨群。E、家鴨212月齡易感麻鴨或櫻桃谷鴨，來自無禽流感和鴨瘟流行鴨群，未注射過鴨瘟疫苗。具體實驗方法和結果如下1、鴨胚適應毒的制備及病毒含量測定1)病毒傳代，得到鴨胚適應毒鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株用易感鴨胚進行傳代。使用滅菌生理鹽水將病毒進行稀釋后，經(jīng)絨毛尿囊膜接種鴨胚，每胚0.2raL。37。C培養(yǎng)觀察6-8天。收集48小時以后死亡胚的胚液和絨毛尿囊膜，勻漿后加入青霉素和鏈霉素，使青霉素和鏈霉素的終濃度均為100-400單位/ml，制成胚毒，得到第一代鴨胚適應毒，即鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳一代的鴨胚毒(名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE1株)，用于制備凍干種毒或傳代。將鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳一代的鴨胚毒再按照上述方法接種易感鴨胚進行傳代，得到鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳二代的鴨胚毒(第二代鴨胚適應毒，名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2株)，依次傳代，得到鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳三代的鴨胚毒(第三代鴨胚適應毒，名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株)、鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳四代的鴨胚毒(第四代鴨胚適應毒，名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4株)、鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳五代的鴨胚毒(第五代鴨胚適應毒，名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE5株)、鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳六代的鴨胚毒(第六代鴨胚適應毒，名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE6株)、鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚傳七代的鴨胚毒(第七代鴨胚適應毒，名稱為鴨瘟皰疹病毒AV1221DE7株)。其中，鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株，已于2007年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCCNo.2268。DPVNJ株用12月齡易感麻鴨傳代。將病毒進行稀釋后，肌肉注射成鴨。無菌采集典型發(fā)病死亡鴨的肝臟，制成肝組織毒，用于制備凍干種毒或傳代。DPVNJ株共傳5代，得到鴨瘟病毒NJ株成鴨傳5代病毒(名稱為NJD5或NJ株D5毒)2)病毒含量測定鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚適應毒(鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株)分別用易感鴨胚進行病毒含量測定。使用滅菌生理鹽水將病毒作10倍系列稀釋，取稀釋液經(jīng)絨毛尿囊膜8接種鴨胚，每個稀釋度接種5枚，每胚0.2mL。37。C培養(yǎng)觀察6-8天。記錄胚的死亡情況。按照Reed-Muench法計算ELD5。(半數(shù)致死量)。結果表明，每O.2mL鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株含有104'38-10618￡0)5。的病毒。2、特異性鑒定使用滅菌生理鹽水分別將鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株的病毒和鴨瘟病毒NJD5稀釋成200MLD/mL，分別與等量鴨瘟病毒抗血清混合；同時設病毒對照(100ELD5。/0.2mL或100MLD/mL)和生理鹽水對照。室溫作用1小時。鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株和抗血清混合物以及對照各接種易感鴨胚10枚，接種途徑為絨毛尿囊膜，每胚0.2mL。37。C培養(yǎng)觀察6-8天，記錄胚的死亡情況。鴨瘟病毒NJD5和抗血清混合物以及對照各接種12月齡易感麻鴨5只，每只肌肉注射lmL，隔離詞養(yǎng)觀察10-14天，記錄鴨的死亡情況。用鴨瘟病毒抗血清對6株病毒進行特異性鑒定的結果(表l)表明，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2株和抗血清混合物的10枚鴨胚全部存活，而作為病毒對照，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2株的10枚鴨胚全部死亡；接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268和抗血清混合物的IO枚鴨胚全部存活，而作為病毒對照，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268的10枚鴨胚全部死亡；接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4株和抗血清混合物的10枚鴨胚全部存活，而作為病毒對照，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4株的10枚鴨胚全部死亡；接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE5株和抗血清混合物的10枚鴨胚全部存活，而作為病毒對照，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE5株的10枚鴨胚全部死亡；接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE6株和抗血清混合物的10枚鴨胚全部存活，而作為病毒對照，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE6株的10枚鴨胚全部死亡；接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE7株和抗血清混合物的10枚鴨胚全部存活，而作為病毒對照，接種鴨瘟皰疹病毒AV1221DE7株的10枚鴨胚全部死亡；接種鴨瘟病毒NJD5和抗血清混合物的5只成鴨全部健活；而作為病毒對照，接種鴨瘟病毒NJD5的5只成鴨全部死亡。說明鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株和NJD5能夠被DPV抗血清中和。表l7株DPV特異性鑒定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、純凈性檢驗按照現(xiàn)行的《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].二OO五年版.三部.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，.2006.)規(guī)定，對如下種毒進行細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染檢驗(其中外源病毒污染檢驗采用雞胚法)鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株和鴨瘟病毒NJD5。檢驗結果表明，鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7株和鴨瘟病毒NJD5種毒中沒有發(fā)現(xiàn)細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。4、對本動物致病性試驗使用滅菌生理鹽水分別將鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2株和鴨瘟病毒NJD5作10倍系列稀釋，取稀釋液接種3月齡易感麻鴨，每個稀釋度接種5只，每只肌肉注射lmL。隔離飼養(yǎng)觀察10-14天，記錄典型發(fā)病及死亡情況。以引起全部接種鴨死亡的病毒最高稀釋度作為MLD(最小致死量)。結果如表2所示，表明NJDs對成鴨具有較強的致病性，其最小致死劑量為10—7lg組織毒。而鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2對成鴨的致病性較弱。表23株DPV對成鴨的致病性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注ND，表示未測定。"發(fā)病及死亡"列的分數(shù)中，分母表示接種的成鴨總只數(shù)，分子表示健活或死亡的只數(shù)。5、免疫原性將鴨胚培養(yǎng)的鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7，分別按照下述步驟二中的制備0601的方法制備疫苗，各免疫接種65日齡易感麻鴨5只，每只皮下注射0.5mL。21-28天后，連同條件的對照鴨5只(未免疫)，使用鴨瘟病毒NJD5病毒攻毒，每只鴨肌肉注射1000MLD/lmL。隔離飼養(yǎng)觀察10-14天，記錄各組鴨的發(fā)病死亡情況。以觀察期結束鴨健活判定為保護。結果如表3所示，鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7制備的疫苗免疫鴨后，4只全部能夠抵抗DPV強毒攻擊，免疫原性好。表3《株病毒免疫原性測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注ND，表示未免疫。"保護結果"列的分數(shù)中，分母表示接種的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。6、生產(chǎn)用種毒種子批的建立及鑒定根據(jù)上述試驗結果，選擇鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株作為制苗用毒株，鴨瘟病毒NJ株作為檢驗用強毒株。據(jù)此，將鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨肝組織毒作為原始種子，從適應鴨胚后的第二代鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2開始建立基礎種子和生產(chǎn)種子。使用易感鴨胚對鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2進行了連續(xù)傳代，得到鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE5、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE6和鴨瘟皰疹病毒AV1221DE7，并制成凍干種毒。按照獸用生物制品試驗研究技術指導原則[M](農(nóng)業(yè)部獸藥審評中心.二OO六年版)的規(guī)定，對各代種毒做了全面鑒定。結果如下1)病毒含量按照步驟1的方法使用鴨胚對所制備的鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株各代次種毒進行了病毒含量測定。結果如表4，表明各代次種毒的病毒含量為每0.2mL含10"8l()525ELD5。，相差不到1個滴度。表明病毒在傳代過程中保持穩(wěn)定。表4AV1221種毒病毒含量測定結果代次DE2DE3DE4DE5DE6DE7病毒含量(ELDw/0.2mL)104.38io5'18105.2510"3io483105.182)對鴨胚的毒力將各代次的種毒用生理鹽水作102倍稀釋后，經(jīng)絨毛尿囊膜接種ll日齡易感鴨胚10枚。每胚0.2mL。37'C培養(yǎng)觀察6-8天。結果，5個代次的病毒均能夠致死9枚以上的鴨胚。3)純凈性按照步驟3的方法對各代次種毒進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗，結果如表5，表明從5個代次的種毒中未檢出細菌、霉菌和支原體污染，從DE2、DEs和DE7代種毒中未檢出外源病毒污染。_表5AV1221種毒純凈性檢驗結果_代次_^_2§5_2Ml___DE7細菌生長-_————霉菌生長--———一支原體生長-—'———一外源病毒污染_:_^___^_^_注"-"，表示陰性。ND，為未做該項檢驗。4)特異性按照步驟2的方法對DE2、DE4、和DE7種毒進行了特異性鑒定。結果表明，3個代次的病毒均能夠被DPV抗血清中和。5)免疫原性分別用鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2-DE7按照下述步驟二中的制備0601的方法制備疫苗，免疫3月齡易感麻鴨。21-28天后，使用DPV強毒攻擊。保護結果見表6，表明6個代次病毒疫苗免疫鴨，在攻毒后均能產(chǎn)生完全保護。表明病毒在鴨胚傳代過程中免疫原性保持穩(wěn)定。表6AV1221種毒免疫原性測定結果疫苗鴨數(shù)(只)免疫途徑及劑量攻毒毒株攻毒途徑及劑量保護結果4DE24皮下注射0.5mLNJD5肌肉注射103MLD/lmL4/4DE3皮下注射0.5mLNJD5肌肉注射103MLD/lmL5/5DE4皮下注射0.5mLNJD5肌肉注射103MLD/lmL5/5DE5皮下注射0.5mLNJD5肌肉注射103MLD/lmL5/5DE65皮下注射0.5mLNJD5肌肉注射103MLD/lmL5/5DE75皮下注射0.5mLNJD5肌肉注射103MLD/lmL5/5對照5__NJD5肌肉注射103MLD/lmL_0/5注ND，表示未免疫。~~"保護結果"列的分數(shù)中，分母表示攻毒的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。6)種毒使用代次的確定根據(jù)對6個代次種毒的鑒定結果，確定種毒的最高使用代次為第7代，第2-4代為基礎種子，生產(chǎn)種子的使用代次不超過3代。二、鴨瘟疫苗的制備及效力試驗和安全試驗本步驟使用已建立的基礎種毒和鴨胚制備了3批生產(chǎn)種子，并用這些種子經(jīng)鴨胚繁殖、收集胚液病毒、0.1-0.2%甲醛溶液滅活后，與礦物油佐劑乳化配制了3批鴨瘟滅活疫苗。使用成鴨測定，疫苗最小免疫劑量為0.12mL，確定使用劑量為每羽份0.5mL。單劑量、單劑量重復和超劑量安全試驗結果為，3批疫苗不引起產(chǎn)蛋鴨的全身不良反應和明顯的局部反應。3批疫苗的免疫攻毒試驗結果表明，疫苗在不同品種、年齡(4日齡12月齡)的鴨上，使用不同的免疫途徑，均能誘導產(chǎn)生80%以上保護。疫苗一次免疫鴨后，不同時間誘導產(chǎn)生的中和抗體滴度(GMT)分別是，7天為3.2、10天為4.6、14天為8，21天、30天和60天均為7;免后10天可以產(chǎn)生80%攻毒保護，14天和21天可產(chǎn)生完全保護。疫苗免疫鴨后，盡管誘導產(chǎn)生的中和抗體效價較低，但能夠有效地抵抗強毒的攻擊。下述實驗所用的實驗材料除A-G外，其它材料來源同步驟一。A、注射用白油MARCOL52，購自法國Esso公司，批號VG3288982P。B、吐溫-80CRILLET4，購自新加坡CRODA公司，批號15488。C、司本-80CRILL4，購自新加坡CRODA公司，批號15438。D、硬脂酸鋁購自上海裕明實業(yè)有限公司，批號070706。E、鴨胚11-12日齡易感鴨胚，來自無禽流感和鴨瘟流行，未注射過鴨瘟疫苗的種鴨群。用于生產(chǎn)種子、制苗用病毒的制備，病毒含量測定，生產(chǎn)用種子的特異性鑒定等。F、家鴨4日齡12月齡易感麻鴨、櫻桃谷鴨或金定鴨，來自無禽流感和鴨瘟流行鴨群，未注射過鴨瘟疫苗。用于疫苗的安全性試驗和效力試驗。G、病毒步驟一制備的鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株制苗用基礎種毒(DE2DE4代毒)，ELD5?！穕(T4370.2mL，DPVNJ株Ds代組織毒，MLD為10-7g，用于疫苗的檢驗。1、疫苗制備1)生產(chǎn)種子制備與檢驗分別將鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268和鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4凍干基礎種毒復水后，使用滅菌生理鹽水進行稀釋，經(jīng)絨毛尿囊膜接種易感鴨胚，每胚0.2mL。37。C培養(yǎng)觀察4-6天。收集48小時以后死亡的胚，無菌采集胚液和絨毛尿囊膜，勻漿后加入青霉素和鏈霉素，使青霉素和鏈霉素的終濃度均為100-400單位/ml，制成鴨胚毒。作為生產(chǎn)種子。按照步驟一的方法進行病毒含量測定、特異性鑒定和純凈性檢驗。分別使用鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268和鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4基礎種毒制備了3批生產(chǎn)種子，每批40mL。檢驗結果為3批均無細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染，能夠被DPV抗血清中和。鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268和鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4種子的病毒含量分別105'38、10525和10483ELD5。/0.2mL。2)制苗用病毒液制備使用滅菌生理鹽水將步驟l)的生產(chǎn)種子進行稀釋，經(jīng)尿囊腔接種鴨胚，每胚0.2mL。37。C培養(yǎng)觀察4-6天。收集48小時以后死亡胚及活胚，無菌采集胚液。作為制苗用病毒液。結果分別使用3批生產(chǎn)種子制備了3批病毒液，每批200mL:鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2病毒液、鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268病毒液和鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4病毒液，其病毒含量分別為105°、1045和10483ELD5。/0.2mL。3)病毒滅活及檢驗向步驟2)制備的三批病毒液中，加入甲醛溶液，使甲醛的終濃度為O.1-0.2%(體積百分含量)，充分混勻后倒瓶；37t:滅活24-36小時，其間每間隔4-8小時振搖1次。滅活完成后，取樣做滅活檢驗。使用ll日齡易感鴨胚10枚，每胚經(jīng)絨毛尿囊膜接種0.2mL原液，37匸培養(yǎng)觀察7天。并照此方法，取胚液盲傳一代。結果表明3批滅活后的病毒液在鴨胚上連傳2代，均不引起胚死亡。表明病毒已被滅活徹底。4)疫苗配制用經(jīng)步驟3)滅活處理的病毒液制備三批疫苗0601、0602和0603。i)0601的制備下述容量份重量份=1111:g。a)油相制備按注射用白油94容量份、司本-806容量份和硬脂酸鋁1.5重量份的比例配制油相。取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化至半透明狀再與全量司本-80及注射用白油混合均勻，經(jīng)116'C滅菌30分鐘，冷至室溫備用。得到油相。b)水相制備將96重量份步驟2)的病毒含量為105°ELD5。/0.2mL(滅活前)的鴨瘟皰疹病毒AV1221DE2病毒液，經(jīng)步驟3)滅活檢驗合格后，加入滅菌吐溫-804容量份，充分振搖后，置2-8X:放置過夜，直到吐溫-80完全溶解。得到水相。按照油相和水相1.5:1的容量比，將油相加入勻漿杯中，低速轉動時，緩慢加入水相。加完水相后勻漿2-3分鐘，停止乳化前加入乳劑總重量的0.01%的硫柳汞，得到批號為0601的500mL疫苗。ii)0602的制備下述容量份重量份^ml:g。a)油相制備按注射用白油92容量份、司本-808容量份和硬脂酸鋁1重量份的比例配制油相。取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化至半透明狀再與全量司本-80及注射用白油混合均勻，經(jīng)116"C滅菌30分鐘，冷至室溫備用。得到油相。b)水相制備將94重量份步驟2)的病毒含量為104'5ELD5。/0.2mL(滅活前)的鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株CGMCCNo.2268病毒液，經(jīng)步驟3)滅活檢驗合格后，加入滅菌吐溫-804容量份，充分振搖后，置2-8。C放置過夜，直到吐溫-80完全溶解。得到水相。按照油相和水相2:1的容量比，將油相加入勻漿杯中，低速轉動時，緩慢加入水相。加完水相后勻漿2-3分鐘，停止乳化前加入乳劑總重量的0.01%的硫柳汞，得到批號為0602的500mL疫苗。iii)0603的制備下述容量份重量份=1111:g。a)油相制備按注射用白油95容量份、司本-805容量份和硬脂酸鋁2重量份的比例配制油相。取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化至半透明狀再與全量司本-80及注射用白油混合均勻，經(jīng)116'C滅菌30分鐘，冷至室溫備用。得到油相。b)水相制備將96重量份步驟2)的病毒含量為104'83ELD5。/0.2mL(滅活前)的鴨瘟皰疹病毒AV1221DE4病毒液，經(jīng)步驟3)滅活檢驗合格后，加入滅菌吐溫-804重量份，充分振搖后，置2-8'C放置過夜，直到吐溫-80完全溶解。得到水相。按照油相和水相3:1的重量比，將油相加入勻漿杯中，低速轉動時，緩慢加入水相。加完水相后勻漿2-3分鐘，停止乳化前加入乳劑總重量的0.01%的硫柳汞，得到批號為0603的500mL疫苗。將批號分別為0601、0602和0603的500mL疫苗，定量分裝，貼簽后，28°C保存。同時抽樣按照規(guī)定(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].二OO五年版.三部.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.)做無菌檢驗、物理性狀檢驗、甲醛和硫柳汞含量測定。結果，3批疫苗均無菌生長；物理性狀檢驗、甲醛和硫柳汞含量測定均符合規(guī)定。2、最小免疫劑量測定使用0601批疫苗，劑量分別為0.5mL/只、0.25mL/只和0.12mL/只。每個劑量注射5只94日齡易感麻鴨，24天后連同條件的5只對照鴨(未進行免疫)，用步驟一制備的鴨瘟病毒NJD5(NJ株Ds毒)攻擊，每只鴨肌肉注射103MLD/lmL。隔離飼養(yǎng)觀察10-14天，記錄各組鴨的發(fā)病死亡情況。以觀察期結束鴨健活判定為保護。結果如表7所示。表7鴨瘟滅活疫苗最小免疫劑量測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注*，分子為健活鴨數(shù)量，分母為攻毒鴨數(shù)量。**，0.25mL組鴨在免疫期間意外死亡l只。ND,表示未免疫。結果表明，0.25mL疫苗免疫可以產(chǎn)生4/4鴨保護，0.12mL疫苗產(chǎn)生4/5保護。最小免疫劑量為0.12mL。為了留有富余量，采用0.5mL作為疫苗的使用劑量。3、免疫效力試驗使用3批疫苗，分別采用皮下(用4日齡櫻桃谷鴨和4月齡金定鴨)或肌肉(用12月齡麻鴨)注射免疫，每批疫苗免疫5只，每只0.5mL(4日齡櫻桃谷鴨14天后同劑量加強免疫1次)。21天后連同條件的5只對照鴨(未進行免疫)，用步驟一制備的鴨瘟病毒NJD5(NJ株D5毒)攻擊，每只鴨肌肉注射103MLD/lmL。隔離飼養(yǎng)觀察10-14天，記錄各組鴨的發(fā)病死亡情況。以觀察期結束鴨健活判定為保護。結果如表8-10所示。表83批鴨瘟滅活疫苗皮下途徑的免疫金定鴨攻毒試驗結果疫苗批號鴨數(shù)量(只)品種年齡免疫途徑及劑量攻毒毒株攻毒途徑保護060106020603對照5金定4月齡頸背部皮下0.5mLNJ株Ds毒5金定4月齡頸背部皮下0.5mLNJ株Ds毒5金定4月齡頸背部皮下0.5mLNJ株仏毒5金定4月齡NDNJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL5/5胸肌注射103MLD/ltnL5/5胸肌注射103MLD/lmL5/5胸肌注射103MLD/lmL(V5注ND,表示未免疫.示健活的鴨只數(shù)。'保護"列的分數(shù)中，分母表示攻毒的成鴨總只數(shù)，分子表疫苗批號表93批鴨瘟滅活疫苗肌肉途徑的免疫攻毒試驗結果鴨數(shù)量(只)品種年齡免疫途徑及劑量毒株攻毒途徑及劑量保護060106020603對照5麻鴨12月齡胸肌注射0.5tnLNJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL5/55麻鴨12月齡胸肌注射O.5mLNJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL5/55麻鴨12月齡胸肌注射0.5mLNJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL5/55麻鴨12月齡NDNJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL0/5注ND，表示未免疫。"保護"列的分數(shù)中，分母表示攻毒的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。表103批鴨瘟滅活疫苗的雛鴨免疫攻毒試驗結果疫苗批號鴨數(shù)量(只)品種年齡毒株攻毒途徑及劑量保護06015櫻桃谷4日齡0602*4櫻桃谷4日齡0603*4櫻桃谷4日齡對照**4櫻桃谷4日齡NJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL4/5NJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL4/4NJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL4/4NJ株Ds毒胸肌注射103MLD/lmL0/4注ND，表示未免疫。"保護"列的分數(shù)中，分母表示攻毒的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。*，免疫期間各有1只翅號脫落。**，攻毒注射時意外死亡l只。結果表明，3批鴨瘟滅活疫苗對不同品種、不同年齡(4月齡和12月齡)的鴨，采用不同途徑免疫，均能產(chǎn)生完全保護。3批疫苗對4日齡櫻桃谷鴨，釆用二次免疫，l批產(chǎn)生4/5保護，2批產(chǎn)生4/4保護。依據(jù)上述結果確定，采用免疫攻毒試驗作為疫苗的效力檢驗方法。使用212月齡鴨5只，每只皮下注射疫苗0.5mL，2128天后，連同條件的對照鴨(未進行免疫)5只，使用10—3MLD強毒病毒攻擊。觀察14天，以對照鴨5/5死亡，免疫鴨4/5保護作為效力合格標準。4、免疫產(chǎn)生期試驗使用0602批疫苗，皮下途徑免疫12月齡麻鴨10只，每只0.5mL。另取10只作為對照(未進行免疫)。分別于免后10天和14天各取5只免疫鴨和對照鴨，用步驟一制備的鴨瘟病毒NJD5(NJ株Ds毒)攻擊，每只鴨肌肉注射103MLD/lmL。隔離飼養(yǎng)觀察14天，記錄各組鴨的發(fā)病死亡情況。以觀察期結束鴨健活判定為保護。結果如表ll所示。表ll鴨瘟滅活疫苗免疫產(chǎn)生期試驗結果疫苗免疫途徑分組鴨數(shù)量攻毒保護批號及劑量(只)時間毒株劑量及途徑0602皮下注射O.5mL免疫5免疫后10天NJ株Ds毒肌肉注射103MLD/lmL4/50602未免疫對照5免疫后10天NJ株Ds毒肌肉注射103MLD/lmL0/50602皮下注射O.5raL免疫5免疫后14天NJ株Ds毒肌肉注射103MLD/lmL5/50602未免疫對照5免疫后14天_NJ株Ds毒肌肉注射103MLD/lmL0/5S"保護"列的分數(shù)中，分母表示攻毒的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。試驗結果表明，l個使用劑量的疫苗，一次免疫后10天可以產(chǎn)生4/5鴨保護，一次免疫后14天和21天(表9)可以產(chǎn)生完全保護。5、中和抗體產(chǎn)生使用0602批疫苗，皮下途徑免疫12月齡麻鴨15只，每只0.5mL。分別于免疫前、免疫后7、10、14、21、30和60天隨機采集5只鴨的血液，分離血清；同時分別于免疫后10和14天各隨機抽取5只鴨進行攻毒試驗。使用DPVAV1222(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)株E62代病毒(雞胚繁殖的第62代毒)和SPF雞胚測定血清的中和抗體效價，并計算各組的幾何平均滴度(GMT)。結果如表12。表12鴨瘟滅活疫苗中和抗體產(chǎn)生試驗結果時間免疫前免疫后天數(shù)(天)71014213060中和抗體滴度(GMT)<23.24.68777結果顯示，免疫后7天開始產(chǎn)生中和抗體，14天明顯上升，且維持在一定的水平上?？贵w產(chǎn)生的情況與攻毒保護結果基本一致。6、安全試驗使用3批疫苗，21日齡金定鴨或12月齡麻鴨進行了單劑量、單劑量重復和超劑量安全性試驗。結果如表13-15所示。表133批鴨瘟滅活疫苗單劑量安全試驗結果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>注"觀察14天后結果"列的分數(shù)中，分母表示免疫的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。表143批鴨瘟滅活疫苗單劑量重復安全試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注"觀察14天后結果"列的分數(shù)中，分母表示免疫的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。表153批鴨瘟滅活疫苗超劑量重復安全試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注"觀察14天后結果"列的分數(shù)中，分母表示免疫的成鴨總只數(shù)，分子表示健活的鴨只數(shù)。3批疫苗3種安全性試驗結果表明，除注射后當天稍有減食，7天內(nèi)局部稍有結節(jié)外，未見全身不良反應。由此確定，使用212月齡鴨5只，每只一次皮下注射lraL疫苗。觀察1014天，5只鴨全部健活為疫苗安全檢驗合格。權利要求1、一種鴨瘟病毒，是鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳代得到的鴨胚適應毒。2、根據(jù)權利要求1所述的鴨瘟病毒，其特征在于所述鴨瘟病毒為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳二至七代得到的鴨胚適應毒。3、根據(jù)權利要求2所述的鴨瘟病毒，其特征在于所述鴨瘟病毒為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳二至四代得到的鴨胚適應毒。4、根據(jù)權利要求3所述的鴨瘟病毒，其特征在于所述鴨瘟病毒為鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株經(jīng)易感鴨胚傳三代得到的鴨胚適應毒一鴨瘟皰疹病毒AV1221DE3株，其保藏登記號為CGMCCNo.2268。5、權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒在制備鴨瘟疫苗中的應用。6、一種鴨瘟疫苗，它的活性成分是滅活的權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒。7、根據(jù)權利要求6所述的疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有佐劑。8、根據(jù)權利要求7所述的疫苗，其特征在于所述佐劑為注射用白油、司本-80、硬脂酸鋁和吐溫-80。9、根據(jù)權利要求8所述的疫苗，其特征在于所述活性成分是用94-96容量份的權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒的病毒液滅活得到的，所述病毒液為權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒接種易感鴨胚后得到的胚液，所述病毒液中權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒的含量為104'5—105'5ELD5。/0.2ml;所述疫苗中含有注射用白油138-288容量份，司本-805-24容量份，硬脂酸鋁1.5-6重量份，吐溫-804-8容量份；所述容量份重量份二ml:g。10、一種制備鴨瘟疫苗的方法，是將下述油相和水相按照(1-3):l的容量比混合制成乳劑；所述水相按照如下方法制備將94-98容量份的權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒的病毒液滅活后，加入無菌吐溫-802-6容量份，混勻得到水相；所述病毒液為權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒接種易感鴨胚后得到的胚液；所述病毒液中權利要求1至4中任一所述的鴨瘟病毒的含量為1045_1055ELD5。/0.2ml;所述油相按照如下方法制備按注射用白油92-96容量份、司本-804-8容量份和硬脂酸鋁1-2重量份的比例配制油相；所述容量份重量份二ml:g。全文摘要本發(fā)明公開了一種鴨瘟疫苗及其專用毒株。本發(fā)明的鴨瘟疫苗，它的活性成分是滅活的鴨瘟皰疹病毒AV1221毒株鴨胚適應毒。本發(fā)明的鴨瘟疫苗使用滅活病毒制成，安全性好；保存、運輸(2-8℃)和使用方便，免疫效果穩(wěn)定。文檔編號C12N7/00GK101200710SQ20071017837公開日2008年6月18日申請日期2007年11月29日優(yōu)先權日2007年11月29日發(fā)明者史大慶,凱康,朱良全,虹李,范書才申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所